Ce travail de thèse s’inscrit dans un contexte d’explosion des nanoparticules et de leur très grand potentiel pour des applications en cancérologie. Ainsi, deux classes de nanoparticules ont été étudiées afin de valider et de caractériser biologiquement ce potentiel. Premièrement les Nanodiamants hydrogénés (H-NDs) dont l’interaction avec les photons de l’irradiation comme générateur de stress oxidatif était au cœur du postulat physico-chimique. Nous avons non seulement validé cette hypothèse dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du rein et du sein notamment, insensibles aux doses d’irradiation étudiées ; mais également identifié la sénescence comme étant la voie activée par le double traitement H-NDs et irradiation. Les Solides hybrides poreux sont également des matériaux prometteurs grâce à leur haut pouvoir d’encapsulation de molécules actives. Nous avons ainsi démontré l’absence de toxicité de ces composés seuls dans quatre lignées de cancer du poumon et du foie, élément essentiel avant d’envisager leur utilisation, chargés avec des principes actifs. Enfin, à l’heure où la réglementation internationale encourage le développement et l’utilisation de modèles alternatifs à l’expérimentation animale, nous avons mis au point un modèle de culture tridimensionnelle d’adénocarcinome mucosécrétant de poumon. Il est utilisé pour l’étude de la progression tumorale ainsi que pour la découverte de nouvelles molécules de chimiothérapie. / The present work focuses on nanoparticles and their great skills for oncology therapies. Two kinds of nanoparticles have been studied in order to biologically validate and characterize their features. The use of hydrogenated Nanodiamonds (H-NDs) as radio sensitizer is based on a physic-chemical postulate where they act as oxidative stress generator through interaction with irradiation. Thus we validated this hypothesis in radio resistant kidney and breast cancer cell lines and identify senescence as the main pathway after co-treatment with H-NDs and irradiation. Metal organic frameworks are also of particular interest for drug delivery because of their very important loading capacities. Here we demonstrate the biocompatibility of the empty compounds in four lung and hepatic cancer cell lines, a main point before their involvement in drug delivery strategies. Finally, following international guidelines encouraging to make animal testing more ethic, we developed a new 3D cell culture mimicking mucinous lung adenocarcinoma. This well characterized model will be used for the study of cancer development and drug screening.

Les plasmons de surface (SP) sont des modes du champ électromagnétique confinés à l'interface entre un métal et un diélectrique. De par leur nature hybride, les SP permettent de concentrer et manipuler la lumière à des échelles sub-longueur d'onde. Ces propriétés sans précédent suscitent un grand intérêt, en particulier pour le transport et le traitement de l'information quantique mais aussi pour le contrôle de l'émission spontanée d'émetteurs fluorescents. Les études présentées dans ce manuscrit s'intéressent au couplage de nanostructures plasmoniques avec des nanoparticules luminescentes. L'outil utilisé est un microscope optique en champ proche (SNOM) dans lequel la nano-source de lumière est un nano-objet fluorescent attaché en bout de pointe (sonde active). Cette technique permet à la fois d'augmenter la résolution théorique accessible en SNOM mais aussi de positionner la sonde avec une précision nanométrique et de l'exciter directement grâce à la lumière laser injectée dans la fibre optique. En utilisant uniquement la lumière émise par l'objet, ces pointes ouvrent la voie à des études originales en nano-optique et en plasmonique. Dans ce travail de thèse, deux aspects distincts ont été abordés. D'une part, nous avons étudié les propriétés des plasmons de surface dans le régime de la plasmonique quantique en utilisant pour cela une sonde active fabriquée à base d'un émetteur de photons uniques, le centre NV (nitrogen-vacancy) contenu dans les nano-diamants. Les résultats fondamentaux obtenus sur ce système permettent d'envisager de nombreuses expériences en plasmonique quantique. D'autre part, le travail de développement des sondes actives à base de nanocristaux de YAG (yttrium-aluminum garnet) dopés au cérium a été poursuivi. Ces sondes nous ont permis de démarrer de nouvelles études sur les résonances plasmoniques localisées de particules colloïdales en or. / Surface plasmons (SPs) are modes of the electromagnetic field confined at the interface between a metal and a dielectric. Due to their hybrid nature, the SPs can be used to concentrate and handle light on subwavelength scales. These unprecedented properties draw great interest, in particular for quantum information transport and processing and also for the control of spontaneous emission of fluorescent emitters. The studies presented in this manuscript report the coupling of plasmonic nanostructures with luminescent nanoparticles. The tool we use is a scanning near-field optical microscope (SNOM), in which the nano-source of light is a fluorescent nano-object attached at the end of the probe (active tip). This technique allows not only to reach a better optical resolution in SNOM but also to position the nano-emitter with a nanometre precision and to excite it directly thanks to the laser light injected into the optical fibre. By using only the light emitted by the object, these tips open the way to original studies in nano-optics and plasmonics. In this work, two distinct aspects were studied. First, we studied the properties of the SPs in the quantum plasmonics regime. For this purpose, we used an active tip based on single photons emitters which are the NV centres (nitrogen-vacancy centre) hosted in nanodiamonds. The fundamental results obtained on this system make it possible to consider many other quantum plasmonics experiments. In addition, a different type of active tips based on Cerium-doped YAG (yttrium-aluminum garnet) nanoparticules was developed. These probes allow us to start new studies on localised plasmonic resonances in colloidal gold particles.

Die vorliegende Arbeit behandelt die Oberflächenmodifikation von Nanodiamanten (ND) aus der Detonationssynthese und die anschließende Konjugation von einzel- bzw. doppelsträngiger DNA an die zuvor eingeführten funktionellen Gruppen. Als Ausgangsmaterialien wurden zwei Nanodiamantpulver mit unbekannter Oberflächenbelegung eingesetzt, deren Charakterisierung durch elektronenmikroskopische Methoden erfolgte. Weiterhin wurden kommerziell modifizierte ND mit definierter Oberflächenbelegung (Amino- und Hydroxylgruppen) verwendet. Für potenzielle Anwendungen von ND wird eine monofunktionale Oberfläche angestrebt, die u. a. über Oxidation oder Reduktion der durch den Herstellungsprozess eingeführten primären funktionellen Gruppen realisiert werden kann. Die dadurch erzeugten sekundären Funktionen ermöglichen die kovalente bzw. nichtkovalente Anbindung weiterer Substanzen, z. B. von Biomolekülen, an die Oberflächen der ND-Partikel. Die hier beschriebene Konjugation von DNA, an die mit Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen modifizierten Partikeloberflächen, erfolgte durch die Generierung von Amid-, Phosphodiester- und Isoharnstoffbindungen. Der Erfolg der Konjugationen wurde mit Hilfe von Infrarotspektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Fluoreszenz der Konjugate beruhte dabei auf Fluoreszenzfarbstoffen, die an die DNA-Moleküle gebunden waren. Darüber hinaus wird die Herstellung einer kolloidalen ND-Suspension beschrieben, von der die Partikelgrößen und das Zeta-Potenzial bestimmt wurden. Kolloidale Suspensionen ermöglichen aufgrund der geringen Partikelgrößen diverse biologische und medizinische Anwendungen von ND. Mit den hier präsentierten Ergebnissen erweitert sich der Kenntnisstand zur Konjugation von DNA an ND aus der Detonationssynthese. Die angewandte Methodik kann ebenso auf andere Substanzen wie Proteine oder Chemotherapeutika übertragen werden. Derart funktionalisierte Partikel besitzen ein großes Potenzial für die weitere Anwendung in der Biomedizin und Nanotechnologie. / The present study deals with the surface modification of nanodiamonds (ND) from detonation synthesis and the subsequent conjugation of both single and double stranded DNA to previously introduced functional groups. As starting materials two kinds of nanodiamond powders with unknown surface configuration were used. Both types of ND were characterized by electron-microscopic methods. Furthermore, commercially modified ND with defined surface configuration (amino and hydroxyl groups) were applied. Potential applications of ND require a mono-functional surface, that can be realized e. g. via oxidation or reduction of the primary functional groups introduced during the production process. The thereby generated secondary functions permit the covalent or non-covalent linking of further substances onto the surfaces of ND particles. Conjugation of DNA, as described here, onto the carboxyl-, hydroxyl- or aminomodified particle surfaces was accomplished by generating of amino, phosphodiester and isourea bonds. The success of conjugations has been examined by infrared spectroscopy and fluorescence microscopy. The fluorescence of conjugates based on fluorescent dyes bound to the DNA molecules. Furthermore, the fabrication of a colloidal ND suspension is described, of which the particle sizes and the Zeta potential have been determined. Colloidal suspensions facilitate various biological and medical applications of ND on the basis of low particle sizes. The presented results enlarge the state of knowledge about the conjugation of DNA on ND from detonation synthesis. The applied methodology may also be transferred to other substances like proteins or chemotherapeutics. In this way, functionalized particles have a big potential for further application in biomedicine and nanotechnology.

Nanodiamanty (250 nm) boli podrobené oxidácií, a tiež separované podľa veľkosti. Následne bola na povrch nanodiamantov adsorbovaná rozvetvená vrstva polyglycerolu. Táto vrstva vzniká kyslo katalyzovanou ,,ring opening“ polymeráciou glycidolu s hydroxylovými a karboxylovými skupinami povrchu nanodiamantov. Vzniknutá polyglycerolová vrstva zvyšuje stabilitu a biokompatibilitu nanodiamantov. Po vytvorení polyglycerolovej vrstvy bol do reakcie pridaný glycidyl propargyl éter, čím došlo k terminácií polymerácie, v dôsledku zavedenia propargylu do reakcie. Prítomná trojná väzba umožňuje nové modifikácie povrchu, napr. prostredníctvom CuAAC reakcie. S využitím CuAAC reakcie je možné na povrch fluorescenčných nanodiamantov pripojiť manózu (so spojkou obsahujúcou azidoskupinu). Pripravené nanočastice boli charakterizované použitím fyzikálno chemických metód. Distribúcia veľkosti častíc bola meraná pomocou dynamického rozptylu svetla (DLS), a taktiež bola potvrdená obrazovou analýzou mikrografov z elektrónového transmisného mikroskopu (TEM). Vyhodnotené bolo aj správanie sa nanodiamantov v biologických podmienkach (stabilitné testy v 1xPBS, 10xPBS a 100 % FBS) a bol meraný aj zeta potenciál. Nakoniec boli pripravené fluorescenčné diamanty (250 nm) s naviazanou manózou. Vzhľadom k výsledkom termogravimetrie, meraniam DLS a pozorovania pomocou TEM môžeme povedať, pripravené nanodiamanty sú pokryté tenkou vrstvou polyglycerolu. Prítomnosť manózy bola zistená na základe FTIR spektier. Nami pripravené fluorescenčné nanodiamanty obalené vrstvou polyglycerolu sú vhodné pre ďalšie testovanie in vitro a in vivo vďaka ich stabilite v médiách s vysokým obsahom solí ako napr. fosfátový pufor (PBS) a nízkemu viazaniu proteínov vo fetalnom bovinnom sere (FBS).

anks to their unique properties and high biocompatibilities, fluorescent nanodiamonds are promising representatives of modern carbon nanomaterials with a broad range of applications. Nevertheless, their wider use is limited because of weak fluorescence intensity and low colloidal stability in the biological environment. e optimization of treatment procedures and development of new suitable surface designs is therefore critically needed. In this study, several key steps for fluorescent nanodiamond treatment have been optimized, leading to both a substantial increase in fluorescence intensity and to significantly lower surface damage caused by graphitization. Further, a new high-throughput irradiation technique was developed. e influence of surface chemistry on the fluorescence parameters was studied using partial fluorination of the functional groups on the nanodiamond surface. A novel method which significantly affects the interaction of nanodiamonds with biological systems by increasing of the homogeneity and circularity was developed. e potential of nanodiamonds for future medical and biological research was demonstrated on particles with complex surface architectures that enabled targeting and therapy of tumor cells. Moreover, a strong and highly selective affinity of fibroblast growth factors to diamond...

Die vorliegende Arbeit behandelt die Oberflächenmodifikation von Nanodiamanten (ND) aus der Detonationssynthese und die anschließende Konjugation von einzel- bzw. doppelsträngiger DNA an die zuvor eingeführten funktionellen Gruppen. Als Ausgangsmaterialien wurden zwei Nanodiamantpulver mit unbekannter Oberflächenbelegung eingesetzt, deren Charakterisierung durch elektronenmikroskopische Methoden erfolgte. Weiterhin wurden kommerziell modifizierte ND mit definierter Oberflächenbelegung (Amino- und Hydroxylgruppen) verwendet. Für potenzielle Anwendungen von ND wird eine monofunktionale Oberfläche angestrebt, die u. a. über Oxidation oder Reduktion der durch den Herstellungsprozess eingeführten primären funktionellen Gruppen realisiert werden kann. Die dadurch erzeugten sekundären Funktionen ermöglichen die kovalente bzw. nichtkovalente Anbindung weiterer Substanzen, z. B. von Biomolekülen, an die Oberflächen der ND-Partikel. Die hier beschriebene Konjugation von DNA, an die mit Carboxyl-, Hydroxyl- oder Aminogruppen modifizierten Partikeloberflächen, erfolgte durch die Generierung von Amid-, Phosphodiester- und Isoharnstoffbindungen. Der Erfolg der Konjugationen wurde mit Hilfe von Infrarotspektroskopie und Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Die Fluoreszenz der Konjugate beruhte dabei auf Fluoreszenzfarbstoffen, die an die DNA-Moleküle gebunden waren. Darüber hinaus wird die Herstellung einer kolloidalen ND-Suspension beschrieben, von der die Partikelgrößen und das Zeta-Potenzial bestimmt wurden. Kolloidale Suspensionen ermöglichen aufgrund der geringen Partikelgrößen diverse biologische und medizinische Anwendungen von ND. Mit den hier präsentierten Ergebnissen erweitert sich der Kenntnisstand zur Konjugation von DNA an ND aus der Detonationssynthese. Die angewandte Methodik kann ebenso auf andere Substanzen wie Proteine oder Chemotherapeutika übertragen werden. Derart funktionalisierte Partikel besitzen ein großes Potenzial für die weitere Anwendung in der Biomedizin und Nanotechnologie.:1 Einleitung 1 2 Theoretische Grundlagen 6 2.1 Nanodiamant 7 2.1.1 Historische Betrachtungen zur Detonationssynthese 7 2.1.2 Herstellung von Diamant 8 2.1.3 Aufbereitung von Nanodiamanten aus der Detonationssynthese 11 2.1.4 Struktur und Eigenschaften von Diamant 12 2.1.5 Homogenisierung der Oberflächenbelegung 16 2.1.6 Aggregation und Deaggregation von Nanodiamant-Partikeln 20 2.1.7 Anwendungen von Nanodiamant-Partikeln 21 2.2 Aptamere 26 2.2.1 Strukturbildung und Bindungsmechanismen 26 2.2.2 Zielsubstanzen 28 2.2.3 Vergleich von Aptameren und Antikörpern 29 2.2.4 Herstellung von Aptameren – Der SELEX-Prozess 32 2.2.5 Anwendungsfelder für Aptamere 34 2.3 Konjugation von Nanopartikeln mit Biomolekülen 38 2.4 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 46 2.4.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 46 2.4.2 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) 47 2.4.3 Bestimmung des Zeta-Potenzials durch elektrophoretische Licht-streuung (ELS) 48 2.5 Methoden zur Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 52 2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 52 2.5.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 53 2.5.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 54 2.6 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 56 2.6.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 56 2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie 60 3 Material und Methoden 62 3.1 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 62 3.1.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 62 3.1.2 Bestimmung von Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und Zeta-Potenzial 63 3.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 64 3.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 64 3.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 65 3.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 65 3.3 Chemische Modifikation von Nanodiamanten 66 3.3.1 Verwendete Materialien und Geräte 67 3.3.2 Einführung von Carboxylgruppen 68 3.3.3 Einführung von Hydroxylgruppen 69 3.3.4 Einführung von Aminogruppen 70 3.4 Herstellung von Nanodiamant-Aptamer-Konjugaten 73 3.4.1 Verwendete Materialien und Geräte 73 3.4.2 Konjugation über Amidbindungen 77 3.4.3 Konjugation über Ester- und Phosphodiesterbindungen 81 3.4.4 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 85 3.5 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 88 3.5.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 88 3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie 89 4 Ergebnisse und Diskussion 92 4.1 Charakterisierung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 92 4.1.1 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung 92 4.1.2 Bestimmung des Zeta-Potenzials 93 4.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulvern 98 4.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 98 4.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 101 4.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 107 4.3 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 117 4.3.1 Nanodiamanten: Originalmaterial und modifizierte Nanodiamanten 118 4.3.1.1 Nanodiamanten – Originalmaterial 118 4.3.1.2 Modifikation mit Carboxylgruppen (ND-COOH) 122 4.3.1.3 Modifikation mit Hydroxylgruppen (ND-OH) 123 4.3.1.4 Modifikation mit Aminogruppen (ND-NH2) 128 4.3.2 Nanodiamant-DNA-Konjugate 138 4.3.2.1 Konjugation über Amidbindungen 140 4.3.2.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 144 4.3.2.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 150 4.4 Fluoreszenzmikroskopie an Nanodiamant-DNA-Konjugaten 154 4.4.1 Konjugation über Amidbindungen 154 4.4.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 157 4.4.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 161 5 Zusammenfassung und Ausblick 165 6 Literaturverzeichnis 170 Anhang I A-1 Parameter der Partikelgrößen- und Zeta-Potenzial-Messungen I A-2 Nukleotidsequenz von EF1a III A-3 GFP-Filter-Spektrum IV A-4 FT-IR-Spektren von Nanodiamanten V A-5 FT-IR-Spektren von Nanodiamant-DNA-Konjugaten X Verzeichnis der Formelzeichen XIV Abkürzungsverzeichnis XV Eigene wissenschaftliche Beiträge XVIII Danksagung Erklärung / The present study deals with the surface modification of nanodiamonds (ND) from detonation synthesis and the subsequent conjugation of both single and double stranded DNA to previously introduced functional groups. As starting materials two kinds of nanodiamond powders with unknown surface configuration were used. Both types of ND were characterized by electron-microscopic methods. Furthermore, commercially modified ND with defined surface configuration (amino and hydroxyl groups) were applied. Potential applications of ND require a mono-functional surface, that can be realized e. g. via oxidation or reduction of the primary functional groups introduced during the production process. The thereby generated secondary functions permit the covalent or non-covalent linking of further substances onto the surfaces of ND particles. Conjugation of DNA, as described here, onto the carboxyl-, hydroxyl- or aminomodified particle surfaces was accomplished by generating of amino, phosphodiester and isourea bonds. The success of conjugations has been examined by infrared spectroscopy and fluorescence microscopy. The fluorescence of conjugates based on fluorescent dyes bound to the DNA molecules. Furthermore, the fabrication of a colloidal ND suspension is described, of which the particle sizes and the Zeta potential have been determined. Colloidal suspensions facilitate various biological and medical applications of ND on the basis of low particle sizes. The presented results enlarge the state of knowledge about the conjugation of DNA on ND from detonation synthesis. The applied methodology may also be transferred to other substances like proteins or chemotherapeutics. In this way, functionalized particles have a big potential for further application in biomedicine and nanotechnology.:1 Einleitung 1 2 Theoretische Grundlagen 6 2.1 Nanodiamant 7 2.1.1 Historische Betrachtungen zur Detonationssynthese 7 2.1.2 Herstellung von Diamant 8 2.1.3 Aufbereitung von Nanodiamanten aus der Detonationssynthese 11 2.1.4 Struktur und Eigenschaften von Diamant 12 2.1.5 Homogenisierung der Oberflächenbelegung 16 2.1.6 Aggregation und Deaggregation von Nanodiamant-Partikeln 20 2.1.7 Anwendungen von Nanodiamant-Partikeln 21 2.2 Aptamere 26 2.2.1 Strukturbildung und Bindungsmechanismen 26 2.2.2 Zielsubstanzen 28 2.2.3 Vergleich von Aptameren und Antikörpern 29 2.2.4 Herstellung von Aptameren – Der SELEX-Prozess 32 2.2.5 Anwendungsfelder für Aptamere 34 2.3 Konjugation von Nanopartikeln mit Biomolekülen 38 2.4 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 46 2.4.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 46 2.4.2 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung durch dynamische Lichtstreuung (DLS) 47 2.4.3 Bestimmung des Zeta-Potenzials durch elektrophoretische Licht-streuung (ELS) 48 2.5 Methoden zur Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 52 2.5.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 52 2.5.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 53 2.5.3 Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) 54 2.6 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 56 2.6.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 56 2.6.2 Fluoreszenzmikroskopie 60 3 Material und Methoden 62 3.1 Herstellung und Charakterisierung von kolloidalen Nanodiamantsuspensionen 62 3.1.1 Herstellung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 62 3.1.2 Bestimmung von Partikelgröße, Partikelgrößenverteilung und Zeta-Potenzial 63 3.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulver 64 3.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 64 3.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 65 3.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 65 3.3 Chemische Modifikation von Nanodiamanten 66 3.3.1 Verwendete Materialien und Geräte 67 3.3.2 Einführung von Carboxylgruppen 68 3.3.3 Einführung von Hydroxylgruppen 69 3.3.4 Einführung von Aminogruppen 70 3.4 Herstellung von Nanodiamant-Aptamer-Konjugaten 73 3.4.1 Verwendete Materialien und Geräte 73 3.4.2 Konjugation über Amidbindungen 77 3.4.3 Konjugation über Ester- und Phosphodiesterbindungen 81 3.4.4 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 85 3.5 Nachweismethoden für Modifikation und Konjugatbildung 88 3.5.1 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 88 3.5.2 Fluoreszenzmikroskopie 89 4 Ergebnisse und Diskussion 92 4.1 Charakterisierung kolloidaler Nanodiamantsuspensionen 92 4.1.1 Bestimmung der Partikelgröße und Partikelgrößenverteilung 92 4.1.2 Bestimmung des Zeta-Potenzials 93 4.2 Materialcharakterisierung von Nanodiamantpulvern 98 4.2.1 Rasterelektronenmikroskopie (REM) 98 4.2.2 Energiedispersive Röntgenspektroskopie (EDX) 101 4.2.3 Hochauflösende Transmissionselektronenmikroskopie (HRTEM) 107 4.3 Fourier-Transform-Infrarot- (FT-IR-) Spektroskopie 117 4.3.1 Nanodiamanten: Originalmaterial und modifizierte Nanodiamanten 118 4.3.1.1 Nanodiamanten – Originalmaterial 118 4.3.1.2 Modifikation mit Carboxylgruppen (ND-COOH) 122 4.3.1.3 Modifikation mit Hydroxylgruppen (ND-OH) 123 4.3.1.4 Modifikation mit Aminogruppen (ND-NH2) 128 4.3.2 Nanodiamant-DNA-Konjugate 138 4.3.2.1 Konjugation über Amidbindungen 140 4.3.2.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 144 4.3.2.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 150 4.4 Fluoreszenzmikroskopie an Nanodiamant-DNA-Konjugaten 154 4.4.1 Konjugation über Amidbindungen 154 4.4.2 Konjugation über Phosphodiesterbindungen 157 4.4.3 Konjugation über Isoharnstoffbindungen 161 5 Zusammenfassung und Ausblick 165 6 Literaturverzeichnis 170 Anhang I A-1 Parameter der Partikelgrößen- und Zeta-Potenzial-Messungen I A-2 Nukleotidsequenz von EF1a III A-3 GFP-Filter-Spektrum IV A-4 FT-IR-Spektren von Nanodiamanten V A-5 FT-IR-Spektren von Nanodiamant-DNA-Konjugaten X Verzeichnis der Formelzeichen XIV Abkürzungsverzeichnis XV Eigene wissenschaftliche Beiträge XVIII Danksagung Erklärung

Nanoparticles (NPs) have considerable potential in targeted medicine. NPs can merge various functions and serve as labels for imaging or as nanocarriers in therapy. Modification of NPs with targeting ligands can lead to highly specific interactions with targeted cancer cells. However, the efficacy of targeting depends on the ratio between specific and non-specific interactions of a NP with the cell. Non-specific interactions of NPs are unrelated to targeted receptors and need to be eliminated in order to decrease background noise during imaging and adverse effect of drugs on healthy tissues. In this thesis, surface modifications of NPs were explored mainly on biocompatible carbon NPs called nanodiamonds (NDs), which have exceptional fluorescent properties such as long fluorescence lifetime, no photobleaching and photoblinking and sensitivity of their fluorescence to electric and magnetic field. Main issues addressed in this thesis are low colloidal stability of NDs in buffers and media, their non-specific interactions with proteins and cells and limited approaches for ND surface modifications. These issues were solved by coating NDs with a layer of biocompatible, hydrophilic, and electroneutral poly(ethylene glycol) or poly[N-(2- hydroxypropyl) methacrylamide] polymers. Optimized polymer coating...

The main objective of this work was to manufacture and to characterize detonation nanodiamond (ND) coatings with high biocompatibility and high drug loading capability. This was achieved via the integration of functionalized NDs into standard coating systems. The examination of cell proliferation and cell differentiation supported the biological assessment of the ND-enhanced coatings. As a first step, an osteogenic peptide was covalently grafted onto oxidized NDs. Accordingly, carboxylic acid derivativ is were generated on the as-received ND surface via an optimized heat treatment. The osteogenic peptide was tethered to the oxidized ND surface using a carbodiimide crosslinking method. The multifaceted ND preparation and disaggregation facilitated the powder handling during the conjugation process. Moreover, antibiotics were physisorbed onto as-received NDs to add antimicrobial properties. The correlated surface loading of NDs was determined using various absorption spectroscopy methods such as fluorescence and ultraviolet-visible spectroscopy. Peptide-conjugated NDs and NDs with untreated surface chemistry have been immobilized on different biomaterials using liquid phase deposition techniques. Herein, polyelectrolyte multilayers (PEMs) were utilized, among others, due to their self-organization and universal applicability for numerous substrates. In order to assess the cell-material interactions, human fetal osteoblasts (hFOBs) were cultured. The hFOBs exhibited a high cell proliferation, high cell density, and sound cellular adhesion, which proves the high biocompatibility of PEMs containing NDs. The present study represents a novel and reliable strategy towards a public approved composite coating. The potential of NDs as a biocompatible delivery platform and as a coating material for biomaterials has been demonstrated. This technology will be useful for the development and optimization of next-generation drug delivery vehicles, e.g. drug-eluting coatings, as well as for biomaterials in general.:Abstract i Kurzfassung iii List of Figures v List of Tables vi Abbreviations vii 1 Introduction and Objectives 1 1.1 Scope of the Thesis 3 2 Fundamentals 9 2.1 Overview of Biomaterials 9 2.2 Surface Modification Techniques of Biomaterials 11 2.3 Cellular Response to Tailored Biomaterials 13 2.4 Essential Features of Detonation Nanodiamonds 15 2.4.1 Biomedical Applications 16 2.4.2 Chemical Functionalization Pathways 19 2.4.3 Colloidal Stability 21 3 Materials and Methods 25 3.1 Wet Chemical and High-temperature Oxidation of Detonation Nanodiamonds 26 3.2 Disaggregation of Detonation Nanodiamond Agglomerates 26 3.3 Grafting of Biomolecules onto Detonation Nanodiamonds 27 3.4 Macroscopic Surface Modification of Biomaterials 28 3.5 Characterization Techniques 30 3.5.1 Morphology 30 3.5.2 Colloidal Stability and ND Crystal Structure 30 3.5.3 ND Surface Chemistry and Surface Loading 31 3.5.4 Alkaline Phosphatase Activity of Human Mesenchymal Stem Cells 31 3.5.5 Cell Viability and Immunofluorescence Staining of Human Fetal Osteoblasts 32 4 Surface Modification of Detonation Nanodiamonds 35 4.1 Comparison of Wet Chemical and High-temperature Oxidation 35 4.1.1 Absorption Spectroscopy 35 4.1.2 Crystal Structure of Dry-oxidized NDs 37 4.2 Chemisorption of Bone Morphogenetic Protein-2 Derived Peptide 38 4.3 Physisorption of Amoxicillin 42 4.4 Conclusions 44 5 Coatings Exhibiting Detonation Nanodiamonds 47 5.1 Colloidal Stability of Aqueous ND Suspensions 47 5.1.1 ND Agglomerate Size and Zeta Potential Measurement 47 5.1.2 Influence of pH and Ion Concentration 50 5.2 Electrophoretic Deposition and Covalent Attachmen 51 5.3 Polyelectrolyte Multilayers 55 5.4 Conclusions 56 6 Biological Assessment of Detonation Nanodiamond Coatings 59 6.1 Alkaline Phosphatase Activity of Mesenchymal Stem Cells 59 6.2 Cellular Response of Osteoblasts 61 6.2.1 Cell Morphology 61 6.2.2 Cell Adhesion . 64 6.2.3 Cell Viability 66 6.3 Conclusions 68 7 Summary and Outlook 71 Acknowledgements 77 References 79 Appendix 109 List of Publications 113 / Das Hauptziel der Arbeit bestand in der Herstellung sowie der Charakterisierung von Beschichtungen aus Detonationsnanodiamanten (ND), welche eine hohe Biokompatibilität und eine hoheWirkstoffbeladbarkeit aufweisen sollten. Dieses Ziel wurde durch die Integration funktionalisierter ND in herkömmliche Beschichtungssysteme erreicht. Die biologische Beurteilung von den ND-verstärkten Beschichtungen wurde durch Untersuchungen der Zellproliferation und der Zelldifferenzierung untermauert. Im ersten Schritt wurde ein Peptid mit knochenbildenden Eigenschaften kovalent an oxidierte ND angebunden. Mittels einer optimierten Wärmebehandlung wurden Carbonsäurederivate auf der ND-Oberfläche erzeugt. Anschließend wurde das Peptid unter Verwendung eines Carbodiimid-Vernetzungsmittels an die oxidierte ND-Oberfläche angebunden. Während des Konjugationsprozesses erleichterte die facettenreiche ND-aufbereitung und -disaggregation die Pulverhandhabung. Außerdem wurden Antibiotika auf den ND adsorbiert, um antimikrobielle Eigenschaften zu erzeugen. Die entsprechende Oberflächenbeladung der ND wurde unter Verwendung verschiedener absorptionsspektroskopischer Ansätze wie Fluoreszenz- und UV/Vis-Spektroskopie bestimmt. Biofunktionale und unbehandelte ND wurden über Flüssigphasenabscheidung auf verschiedene Biomaterialien aufgebracht. Hierbei wurden unter anderem Polyelektrolyt-Mehrschichtsysteme aufgrund ihrer Selbstorganisation und universellen Anwendbarkeit auf zahlreiche Substrate eingesetzt. Um die Zellantwort auf die mehrschichtigen ND zu bewerten, wurden humane Osteoblasten (hFOB) kultiviert. Die hFOB zeigten eine hohe Zellproliferation, eine hohe Zelldichte und eine hohe Zelladhäsion, was die hohe Biokompatibilität von mehrschichtigen ND belegt. Die vorliegende Arbeit stellt eine neuartige und zuverlässige Strategie für eine allgemein anerkannte Verbundbeschichtung dar. Das Potenzial von ND als biokompatible Medikamententräger und als Beschichtungsmaterial für Biomaterialien konnte aufgezeigt werden. Die dargestellte Technologie kann für die Entwicklung und Optimierung von Medikamententrägern der nächsten Generation, z. B. in arzneimittelfreisetzenden Beschichtungen, sowie für Biomaterialien im Allgemeinen verwendet werden.:Abstract i Kurzfassung iii List of Figures v List of Tables vi Abbreviations vii 1 Introduction and Objectives 1 1.1 Scope of the Thesis 3 2 Fundamentals 9 2.1 Overview of Biomaterials 9 2.2 Surface Modification Techniques of Biomaterials 11 2.3 Cellular Response to Tailored Biomaterials 13 2.4 Essential Features of Detonation Nanodiamonds 15 2.4.1 Biomedical Applications 16 2.4.2 Chemical Functionalization Pathways 19 2.4.3 Colloidal Stability 21 3 Materials and Methods 25 3.1 Wet Chemical and High-temperature Oxidation of Detonation Nanodiamonds 26 3.2 Disaggregation of Detonation Nanodiamond Agglomerates 26 3.3 Grafting of Biomolecules onto Detonation Nanodiamonds 27 3.4 Macroscopic Surface Modification of Biomaterials 28 3.5 Characterization Techniques 30 3.5.1 Morphology 30 3.5.2 Colloidal Stability and ND Crystal Structure 30 3.5.3 ND Surface Chemistry and Surface Loading 31 3.5.4 Alkaline Phosphatase Activity of Human Mesenchymal Stem Cells 31 3.5.5 Cell Viability and Immunofluorescence Staining of Human Fetal Osteoblasts 32 4 Surface Modification of Detonation Nanodiamonds 35 4.1 Comparison of Wet Chemical and High-temperature Oxidation 35 4.1.1 Absorption Spectroscopy 35 4.1.2 Crystal Structure of Dry-oxidized NDs 37 4.2 Chemisorption of Bone Morphogenetic Protein-2 Derived Peptide 38 4.3 Physisorption of Amoxicillin 42 4.4 Conclusions 44 5 Coatings Exhibiting Detonation Nanodiamonds 47 5.1 Colloidal Stability of Aqueous ND Suspensions 47 5.1.1 ND Agglomerate Size and Zeta Potential Measurement 47 5.1.2 Influence of pH and Ion Concentration 50 5.2 Electrophoretic Deposition and Covalent Attachmen 51 5.3 Polyelectrolyte Multilayers 55 5.4 Conclusions 56 6 Biological Assessment of Detonation Nanodiamond Coatings 59 6.1 Alkaline Phosphatase Activity of Mesenchymal Stem Cells 59 6.2 Cellular Response of Osteoblasts 61 6.2.1 Cell Morphology 61 6.2.2 Cell Adhesion . 64 6.2.3 Cell Viability 66 6.3 Conclusions 68 7 Summary and Outlook 71 Acknowledgements 77 References 79 Appendix 109 List of Publications 113

The absence of a cheap and easily scalable synthesis technique for nitrogen-vacancy (NV) centers enriched nanodiamonds (NDs) is a critical factor for the development of devices based on this very peculiar nanoparticle. Indeed, the combination between the unique NV fluorescence properties and NDs characteristics allow to obtain a tool having quantum sensing capabilities, with nanometric spatial resolution, which is able to operate in a wide range of temperature, pressures and in harsh chemical conditions. NVenriched NDs applications in nanothermometry, nanomagnetometry and in bio-imaging have already been reported. However, most of the standard fluorescent NDs production techniques present common drawbacks: poor control in NDs size distribution and in nitrogen concentration, as well as the need of post-synthesis process to clean the NDs surface from impurities and to increase the NV density. In this thesis, an alternative method for fluorescent NDs synthesis based on pulsed laser ablation (PLA) of graphite is demonstrated. After the introductory chapters on NV-centers physics and NDs properties (Chapter 2 and 3), the demonstration that PLA is a viable route for synthesis of NDs is given in Chapter 4. In particular, PLA of graphite and of diamond-like carbon is performed in water. Here, a thermodynamic model taking into account the peculiar physical processes occurring during PLA is developed to explain NDs formation. Then, synthesis of NV-enriched NDs is demonstrated through PLA of graphite in a nitrogen atmosphere (Chapter 5) and in liquid nitrogen (Chapter 6). In both chapters, the thermodynamic model is adapted to explain diamond phase formation in a gaseous environment and in a cryogenic liquid. Furthermore, NV centers optical properties are fully characterized with optically detected magnetic resonance (ODMR) spectroscopy. Finally, in Chapter 7, fluorescent NDs are produced by laser ablation of N-doped graphite in water. This particular target is then used for a quantitative comparison between the other fluorescent NDs laser-synthesis, with the aim of establishing in which condition the highest NV-center formation efficiency is achieved.

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