iNKT cells are a population of T cells with unique characteristics. In contrast to most αβ T cells which recognize peptides presented by highly polymorphic MHC molecules, iNKT cells are reactive to glycolipids presented by CD1d, a non-polymorphic MHC-I like molecule. Moreover, whereas MHC-restricted αβ T cells bear highly variable receptors (TCRs) formed after somatic recombination of the V(D)J gene segments, the TCR of iNKT cells is formed by an invariant α chain, which always contains the same gene segments: AV14 and AJ18; and a β chain of limited BV gene usage: BV8S2, BV7 or BV2, in the mouse. This invariant α chain is the reason for which these cells are named “i” and the NK part of their name refers to the expression of receptors typical of natural killer (NK) cells. iNKT cells recognize glycolipids of endogenous and microbial origin. After activation they secrete large amounts of very different cytokines such as IFN-γ and IL-4 and thus influence immune responses and pathological conditions. One of the most potent iNKT cell agonists, recognized by the semi-invariant TCR, is the synthetic glycolipid α-Galactosylceramide (α-Gal). iNKT cells can be visualized using CD1d-multimeric complexes loaded with α-Gal and flow cytometry, since this reagent has enough avidity to stain these cells. Interestingly, mouse iNKT cells can be stained with human α-Gal-loaded CD1d oligomers and human iNKT cells can also be visualized with mouse α-Gal-loaded CD1d oligomers, indicating a high degree of conservation of the recognition of α-Gal presented by CD1d through evolution. Previous studies showed that rats have the genes necessary to build semi-invariant TCRs: They have a CD1d homologue; one or two BV8S2 homologues and interestingly, up to ten AV14 gene segments, which are highly conserved when compared to the mouse genes. Importantly, it has been shown at least for two of these AV14 gene segments that they can produce invariant TCRα chains which, when coexpressed with BV8-containing β chains, react to α-Gal presented by rat CD1d. Furthermore, ex vivo stimulation of primary splenocytes with α-Gal results in the secretion of IL-4 and IFN-γ. Surprisingly, rat semi-invariant TCRs do not recognize α-Gal presented by mouse CD1d and accordingly, mouse α-Gal-loaded CD1d tetramers failed to stain a discrete population of rat iNKT cells. Taking all together, despite that strong evidence suggested that iNKT cells are present in the rat, the direct identification of such population and the analysis of CD1d-restricted immune responses were still pending for this species. Hence the work presented in this doctoral thesis was aimed to identify iNKT cells, to analyze their phenotype and also to study the distribution and function of CD1d in the rat. For these purposes, we produced essential reagents which were still lacking such as rat specific anti-CD1d monoclonal antibodies and rat CD1d oligomers. Importantly, two of three anti-rat CD1d monoclonal antibodies (all of them generated in our laboratory before this thesis was initiated) also recognized mouse CD1d and therefore allowed a direct comparison of CD1d expression between rat and mouse. Whereas CD1d distribution in the hematopoietic system was found to be extremely similar between these two species; in non-lymphatic tissues important differences were observed. Interestingly, CD1d protein was detected at not yet described sites such as the rat exocrine pancreas and rat and mouse Paneth cells. These monoclonal antibodies did not only allowed the analysis of CD1d expression, but also the first demonstration of the function of rat CD1d as an antigen presenting molecule, since cytokine release in response to α-Gal was blocked when they were added to ex vivo cultures of rat primary cells. Staining of primary rat iNKT cells (possible now with the newly generated rat CD1d oligomers) revealed interesting similarities with human iNKT cells. First, we observed that rat iNKT cells are only a minority among all NKR-P1A/B positive T cells. Human iNKT cells constitute also a very small proportion of NKR-P1A (CD161) expressing T cells, whereas in mice inbred strains which express NKR-P1C (NK1.1), most of NKRP1C expressing T cells are iNKT cells. Second, the majority of rat iNKT cells are either CD4 or DN and only a small proportion expresses CD8β. These findings are similar to humans and different to mice which lack CD8+ iNKT cells. Third, analysis of various inbred rat strains demonstrated different iNKT cell frequencies which correlated with cytokine secretion after α-Gal stimulation of primary cells. In comparison to mice, iNKT cell numbers are markedly reduced in rats. In F344 rats, inbred rat strain which released the highest cytokine amounts after α-Gal stimulation, approximately 0.25% and 0.1% of total liver and spleen lymphocytes, respectively, are iNKT cells. In contrast, in LEW rats iNKT cells were practically absent and neither IL-4 nor IFN-γ were detected after stimulation of primary cells with α-Gal. Once more, these frequencies are very close to those observed in humans. Last, as reported for human peripheral blood cells, rat iNKT cells could be easily expanded in vitro by adding α-Gal to cultures of intrahepatic lymphocytes, whereas the expansion of mouse iNKT cells was not possible using the same protocol. The presence of a multimember AV14 gene segment family in the rat is an intriguing characteristic. These AV14 gene segments are extremely homologous except in the CDR2α region. Based on the amino acid sequence of this region they have been divided into two different types: Type I and II. A specific tissue distribution of the different types was proposed in the first study where the presence of several AV14 gene segments was described. We also analyzed the AV14 gene segment usage in F344 and LEW inbred rat strains. In F344 rats we found no preferential usage of either AV14 gene segment type in the spleen and the liver but type II AV14 gene segments appeared more frequently in the thymus. In contrast, LEW rats show a preferential usage of type I AV14 gene segments in all three compartments analyzed: Thymus, spleen and liver. Taken all together, the usage of newly generated reagents allowed to gain novel insights into CD1d expression in the rat and in the mouse and to directly identify rat iNKT cells for the first time. The phenotypic and functional analysis of rat iNKT cells revealed numerous similarities with human iNKT cells. These are of special interest, since rats serve to investigate several pathological conditions including models for autoimmune diseases. The possibility now to analyze iNKT cells and CD1d-restricted T cell responses in the rat might help to understand the pathogenesis of such diseases. In addition, the uncomplicated in vitro expansion and culture of rat iNKT cells should facilitate the analysis of the immunomoldulatory capacities of these cells. / iNKT Zellen sind eine Population von T Zellen mit einigen Besonderheiten. Anders als die meisten αβ T Zellen, deren T Zell Rezeptoren (TZRs) für von hochpolymorphen MHC Molekülen präsentierte Peptide spezifisch sind, erkennen iNKT Zellen Glycolipide die von CD1d, einem nicht polymorphem MHC-I artigen Moleküle, präsentiert werden. Während MHC-restringierte αβ T Zellen sehr unterschiedliche TZRs haben, die nach somatischer Rekombination der V(D)J Gensegmente generiert werden, besteht der TZR der iNKT Zellen aus einer invarianten α Kette und einer β Kette mit einem limitierten BV Gen Repertoire (BV8S2, BV7 und BV2 in Maus). Die invariante α Kette, auf die das i im Namen der iNKT Zellen verweist, enthält in der Maus immer AV14 und AJ18 kodierte V-Regionen. Das NK in ihrem Namen verweist darauf, dass sie häufig NK-Zell typische Oberflächenmoleküle exprimieren. iNKT Zellen erkennen Glycolipide endogenen und mikrobiellen Ursprungs und sezernieren nach Aktivierung große Mengen verschiedener Zytokine wie zum Beispiel IL-4 und IFN-γ. Auf diese Weise beeinflussen sie Immunantwort und pathologische Zustände. Eine der potentesten iNKT-Zell-TZR Agonisten ist das α-Galactosylceramid (α-Gal) und α-Gal beladene CD1d-Multimere ermöglichen es iNKT Zellen zu färben und mittels Durchflusszytometrie sichtbar zu machen. Die hohe Konservierung der iNKT TZR-CD1d Interaktion ermöglicht es sogar, Maus iNKT Zellen mittels α-Gal beladenen humanen CD1d-Multimere zu färben. Vorhergehende Studien zeigten, dass Ratten die notwendigen Gene für die Generierung der semi-invarianten TZR haben: Sie besitzen ein CD1d Homolog, ein oder zwei BV8S2 Homologe und bis zu zehn AV14 Gensegmente, die im Vergleich zu den Maus-AV14 Genen hoch konserviert sind. Mehrere dieser AV14 Gensegmenten wurden mit AJ18 zusammen rearrangiert gefunden und für mindestens zwei dieser invarianten α Ketten wurde gezeigt, dass sie zusammen mit BV8 enthaltenden β Ketten TZR bilden, die von CD1d präsentiertes α-Gal erkennen. Weiterhin wurde gezeigt, dass primäre Ratten- Milzzellen und intrahepatische Lymphozyten nach Kultur mit α-Gal IL-4 und IFN-γ sezernieren. Auf Grund dieser Befunde und der starken Konservierung der CD1d Gene und der Gene, die die semi-invarianten TZR kodieren, überrascht es, dass keine definierte Zellpopulation von intrahepatischen Rattenlymphozyten mittels α-Gal beladenen Maus CD1d-Tetrameren gefärbt wurde. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die direkte Identifizierung der Zellen und die Analyse der CD1d restringierten Immunantworten in der Ratten noch austand, obwohl es starke Hinweise für die Existenz der iNKT Zellen in dieser Art gab. Infolgedessen sind die Ziele dieser Arbeit: die Identifizierung der Ratten iNKT Zellen, die Analyse ihres Phänotyps und die Untersuchung der CD1d-restringierten Immunantworten. Um diese Ziele zu erreichen, wurden noch fehlende essentielle Reagenzien hergestellt, wie die ersten Ratten-CD1d spezifischen monoklonalen Antikörper und Ratten CD1d Oligomere. Zwei der drei charakterisierten monoklonalen Antikörpern erkennen sowohl Ratten CD1d als auch Maus CD1d. Dies ermöglichte den direkten Vergleich der CD1d Expression zwischen beiden Spezies (diese Antikörper wurden in unserem Labor vor dem Anfang dieser Doktorarbeit hergestellt). Während die CD1d Verteilung im hämatopoetischen System beider Arten äußerst ähnlich ist, wurden in nicht lymphatischen Geweben sehr starke Unterschiede gefunden. Interessanterweise wurde das CD1d Protein auch an noch nicht beschriebenen Stellen wie im exokrinen Pankreas der Ratte und in Paneth Zellen von Maus und Ratte beobachtet. Die monoklonalen Antikörper erlaubten nicht nur die Analyse der CD1d Verteilung, sondern auch den Beweis der Funktion von CD1d als Antigen präsentierendes Molekül, weil die Zugabe der Antikörper zu ex vivo Kulturen von primären Zellen die Sekretion von Zytokinen bei der Stimulation mit α-Gal hemmt. Färbungen von primären Ratten iNKT Zellen, jetzt möglich durch die neu generierte Ratten CD1d-Dimere, zeigten interessante Gemeinsamkeiten mit humanen iNKT Zellen. Es wurde erstens beobachtet, dass Ratten iNKT Zellen nur eine Minderheit unter allen NKR-P1A/B positiven T Zellen sind. Dies ähnelt den humanen iNKT Zellen, die ebenfalls auch nur ein sehr kleinen Teil der NKR-P1A (CD161) exprimierenden T Zellen stellen, während in Mausstämmen, die NKR-P1C (NK1.1) exprimieren, die Mehrheit der NKR-P1C positiven T Zellen iNKT Zellen sind. Zweitens sind die meisten Ratten iNKT Zellen CD4 positiv oder doppelt negativ während nur ein kleiner Anteil CD8β exprimiert. Diese Befunde gleichen denen mit humanen iNKTs und unterscheiden sich von Maus iNKTs, die immer CD8β negativ sind. Drittens zeigt die Analyse von verschiedenen Rattenstämmen, ähnlich wie beim Menschen, 10-100 fach geringere Frequenzen von iNKT Zellen als in der Maus. In F344 Ratten sind etwa 0.25% aller Lymphozyten in der Leber und etwa 0.1% aller Milzzellen iNKT Zellen. Wobei dies der Rattenstamm ist, der die größte Mengen an Zytokinen nach α-Gal Stimulation produziert. In LEW Ratten, die keine Zytokine nach α-Gal Stimulation produzierten, konnten iNKT Zellen praktisch nicht gefärbt werden. Schließlich konnten, wie bei humanen peripherischen Blutzellen beobachtet, Ratten iNKT Zellen durch alleinige Zugabe von α-Gal in vitro expandiert werden, während dies mit Maus iNKT Zellen nicht möglich war. Eine faszinierende bislang nur in der Ratte gemachte Beobachtung ist die Existenz einer AV14 Multigenfamilie, deren Mitglieder bis auf die CDR2 kodierende Region hochhomolog sind. Basiert auf der Aminosäuresequenz dieser Region wurde diese Familie in zwei Gruppen aufgeteilt: Typ I und II. Die erste Studie, in der diese zwei verschiedenen Typen beschrieben wurden, schlug eine spezifische Gewebsverteilung von AV14 positiven TCR vor. Wir haben ebenfalls die Benutzung dieser AV14 Gene in F344 und LEW Inzuchtrattenstämmen analysiert und gefunden, dass es in F344 Leber und Milz keine Präferenz für einen bestimmten AV14 Typ gibt. Jedoch wurde der Typ II häufiger in F344 Thymus gefunden. Im Vergleich zeigen LEW Ratten eine bevorzugte Benutzung des Typ I in allen analysierten Geweben (Thymus, Milz und Leber). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass diese Studie mit Hilfe neu generierter Reaganzien neue Erkenntnisse zur CD1d Expression in Ratte und Maus gewonnen wurden und erstmals eine direkte phänotypische und funktionelle Analyse von iNKT Zellen der Ratte durchgeführt wurde. Es wurden eine Reihe von Gemeinsamkeiten zwischen iNKT Zellen von Ratte und Mensch gefunden. Diese sind vor allem deshalb von Interesse, da das Versuchstier Ratte für eine Reihe von Autoimmunkrankheiten und andere pathologische Zustände als Modellorganismus dient. Es ist zu erwarten, dass weitere Untersuchungen von CD1d-restringierten Zellen der Ratte neue Einsichten in die Genese dieser Krankheiten ermöglicht. Darüberhinaus sollte die in der Ratte beobachtete einfach durchzuführende in vitro Kultur und Expansion von iNKT Zellen eine Analyse ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften deutlich erleichtern.

Das NKG2D (Natural Killer Group 2 Member D)-Protein, ist ein aktivierender Rezeptor, der es NK- und CD8+ T-Zellen ermöglicht, infizierte oder transformierte körpereigene Zellen zu erkennen und zu eliminieren. Eine Fehlregulation dieses Rezeptors auf Immunzellen scheint jedoch auch zur Ausbildung von Autoimmunerkrankungen wie Typ I Diabetes, Zöliakie und RA zu führen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein humaner Antikörper gegen hNKG2D für einen möglichen therapeutischen Einsatz bei Autoimmunerkrankungen generiert. Basierend auf den Sequenzen von schwerer (VH) und leichter Kette (VL) der murinen monoklonalen Antikörper 6H7 und 6E5A7, welche hNKG2D spezifisch binden und die Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor blockieren, wurden scFv-Phagenbibliotheken hergestellt. Diese wurden anschließend zur Selektion im Phagen-Display eingesetzt. Der Humanisierungsprozess erfolgte hierbei mit Hilfe des Guided Selection-Verfahrens. Dazu wurde in einem ersten Phagen-Display-Durchgang die VH-Domäne des parentalen scFv mit einem humanen VL-Repertoire kombiniert. Die beiden daraus resultierenden humanen VL-Ketten wurden im darauf folgenden Schritt mit einem Repertoire an humanen VH-Domänen verknüpft. Da hierbei kein humaner rekombinanter scFv mit hNKG2D-Bindungsaktivität identifiziert werden konnte, musste eine schrittweise Humanisierung der Framework-Regionen (FR) der VH unter Beibehaltung der murinen CDR-Bereiche erfolgen. Diese führte zur Generierung des humanen scFv E1VLV71KVH, welcher neben den murinen CDR-Regionen lediglich noch drei Aminosäuren murinen Ursprungs im FR-Bereich besaß. Dessen biologische Aktivität wurde nach Konvertierung in das IgG1/lambda-Format in verschiedenen in vitro-Systemen analysiert. Anhand der Ergebnisse aus diesen Versuchen konnte ein deutlicher Verlust der Affinität und inhibitorischen Aktivität nach der Humanisierung festgestellt werden. Die dadurch erforderliche Affinitätsmaturierung des E1VLV71KVH Antikörpers mittels sequentieller Randomisierung des CDR3-Bereichs von E1VL und V71KVH resultierte in fünf unterschiedlichen, hoch-affinen Anti-hNKG2D scFv. Zwei dieser generierten Konstrukte, B1VLB6VH und E4VLG10VH, wurden nach ihrer Herstellung als vollständige IgG1/lambda-Antikörper in vitro hinsichtlich ihrer Aktivierungs- und Neutralisierungsaktivität, sowie ihrer Stabilität und Internalisierung durch NK-Zellen untersucht. Beide Antikörper wiesen nach der Affinitätsmaturierung mit einem IC50 von ca. 3,4x 10-2 µg/ml ein wesentlich höheres Inhibitionspotential als der murine Ursprungsantikörper (ca. 3,3 µg/ml) auf und zeigten gegenüber Hitzeeinwirkung und Serumproteasen eine hohe Stabilität. Mit Hilfe fluoreszenzmikroskopischer Untersuchungen konnten Internalisierungsvorgänge der Antikörper in die NK-Zelle beobachtet werden. Für ein besseres Verständnis NKG2D-abhängiger Regulationsvorgänge und die Identifizierung NKG2D-spezifischer Zielgene wurde das Genexpressionsprofil von humanen NK-Zellen nach Interaktion mit dem NKG2D-Liganden ULBP-1Fc mittels Microarray untersucht. Infolge einer anschließenden Validierung der Ergebnisse auf RNA- und Proteinebene konnten mittels RT-qPCR, FACS, ELISA und CBA NKG2D-spezifische Biomarker wie CRTAM, TNFalpha, IFNgamma und GM-CSF etabliert werden. Ergänzend zu 51Cr-Freisetzungs-Experimenten in zwei unterschiedlichen in vitro Zellkultursystemen ermöglichten diese Biomarker eine umfassende Charakterisierung neutralisierender und aktivierender Eigenschaften der beiden Antikörper B1VLB6VH und E4VLG10VH. Anhand dieser Experimente konnte festgestellt werden, dass die humanen Anti-hNKG2D Antikörper eine ambivalente Funktionalität aufweisen. In Lösung sind sie in der Lage, NKG2D-induzierte CRTAM-Expression, Zellyse und Zytokinfreisetzung zu inhibieren. Nach Kreuzvernetzung des NKG2D-Rezeptors über an Platten immobilisierte Anti-hNKG2D Antikörper hingegen lassen sich aktivierende Eigenschaften wie Zellyse und Zytokinsekretion durch NK Zellen beobachten. Aufgrund ihrer ambivalenten Aktivität scheint ein therapeutischer Einsatz der beiden Antikörper bei humanen Autoimmunerkrankungen zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht möglich. In der vorliegenden Arbeit wurden somit die Voraussetzungen geschaffen, um einen humanen, hoch affinen hNKG2D neutralisierenden Antikörper in einem letzten Schritt in ein besser geeignetes Antikörper-Format (scFv, Fab oder F(ab)2) zu konvertieren. / The natural killer group 2, member D protein (NKG2D) is an activating receptor on NK- and CD8+ T-cells, which enables them to identify and eliminate infected and transformed somatic cells. However, a dysfunction of this receptor on immune cells may lead to the development of autoimmune diseases like type I diabetes, celiac disease, and rheumatoid arthritis. In this doctoral thesis, a human antibody with anti-hNKG2D specificity was developed which could be of clinical relevance for the treatment of autoimmune diseases. Based on the sequences of heavy (VH) and light chain (VL) of the two murine monoclonal antibodies 6H7 and 6E5A7 which specifically bind to hNKG2D and block the interaction between NKG2D-ligand and receptor, scFv-phage-libraries were prepared. These libraries were used in the following selection process by phage-display and the humanization of the murine scFv was achieved by guided selection-technology. The VH domain of the parental scFv was first combined with a human VL-repertoire and the two resulting human light chains were then joined to a repertoire of human VH-domains. Because no recombinant human scFv with hNKG2D binding activity could be identified by this technique a stepwise humanization process of the VH framework-region (FR) had to be performed while retaining the murine CDR-domains. This procedure resulted in the human scFv E1VLV71KVH which in addition to the murine CDRs merely contained three amino acids of murine origin in the FR. The biological activity of the E1VLV71KVH was analyzed in different in vitro-systems after conversion of the scFv fragment into the completely human IgG1/lambda antibody format. The results of these experiments revealed a noticeable loss of affinity and neutralizing function of the antibody after humanization and thus demonstrated the need for affinity maturation. Therefore, a sequential randomization of the CDR3 domains of E1VL and V71KVH was performed which resulted in five different anti-hNKG2D scFv fragments with high affinity. Two of these human constructs, B1VLB6VH and E4VLG10VH, were produced as fully human IgG1/ antibodies and examined in vitro with regard to their activating and neutralizing activity as well as their stability and internalization effects by NK cells. After affinity maturation, both antibodies exhibited more potent inhibitory activity at IC50 values of 3,4x 10-2 µg/ml compared to the original murine antibody (3,3 µg/ml) and showed a high rigidity to impact of heat and serum proteases. Internalization events of the antibodies by NK cells could be observed by fluorescence microscopic analysis. For a better understanding of NKG2D-dependent regulation processes and the identification of NKG2D-specific target genes, the expression profile of ULBP-1Fc stimulated human NK cells was determined using microarray technology. The microarray data were validated on both RNA- and protein-level using RT-qPCR, FACS, ELISA and CBA, and the following biological NKG2D-specific markers could be established: CRTAM, TNFalpha, IFNgamma and GM-CSF. In addition to the execution of 51Cr-release studies in two different in vitro cell culture systems these markers provided the basis for the characterization of the neutralizing and activating capacity of the human antibodies B1VLB6VH and E4VLG10VH. The findings of all these experiments indicated that the human anti-hNKG2D antibodies exhibit an ambivalent functionality: In solution the antibodies have the ability to inhibit NKG2D-specific CRTAM-Expression, cytolytic activity and cytokine release. However, cross-linking of NKG2D-receptor via plate-bound human anti-hNKG2D antibodies results in the induction of a cytolytic response and cytokine secretion by human NK cells. Due to the bifunctional activity of these two antibodies a therapeutic use in human autoimmune diseases does not seem to be feasible yet. Taken together, this thesis has provided the basis for the conversion of a human hNKG2D neutralizing antibody with high affinity into a more suitable antibody format (scFv, Fab or F(ab)2).

Zusammenfassung NKT Zellen wurden ursprünglich über die gleichzeitige Expresion eines T-Zellantigenrezeptors (TZR) und den NK-Zellmarkern NKRP1A im Menschen bzw. NK1.1. (NKRP1C) in der Maus definiert. In Mensch und Maus exprimieren die meisten NKT Zellen CD1d restringierte TZR mit charakteristischen Genumlagerungen- Va24JaQ/Vb11 im Menschen und Va14Ja18/Vb8.2 in der Maus. Den NKT Zellen werden außerdem wichtige Funktionen in der „first line defence“ und der Immunregulation zugesprochen. Gegenstand der Doktorarbeit war die Charakterisierung eines hypothetischen Gegenstückes in der Ratte. In der Maus wurden rund 30% der intrahepatischen Lymphozyten (IHL) und 3% der Milzlymphozyten als CD1d restringierte NK T Zellen identifiziert und konnten mittels a-GalCer beladenen Maus-CD1d Tetramer visualisiert werden. Wie in der Maus wurden in der Ratte NKRP1A+TZR+ Zellen vorwiegend in der Leber gefunden, waren aber fünfmal weniger häufig. F344 Ratten NKT Zellen waren darüber hinaus im Gegensatz zu den CD4+ oder CD4-CD8- Maus NKT Zellen meistens CD8 positiv und banden kein mCD1d Tetramer. Da in der menschlichen Leber CD1d-restringierte Va24JQ+ T Zellen ebenfalls viel seltener als in der Maus sind, scheint es nun möglich, daß der Phänotyp der Ratten NKT Zellen eher dem des Menschen als dem der Maus entspricht. Ein Test der Fähigkeit von F344 Leber- und Milzlymphozyten nach Kultur mit a-GalCer Cytokine zu produzieren, ergab ähnlich wie in der Maus eine Produktion von IL-4 und IFN-g;. Aus diesem Grund kann eine fehlende Reaktivität von Ratten NKT Zellen für a-GalCer nicht der Grund für eine fehlende mCD1d Tetramerbindung sein. Um die Reaktivität der NKRP1A+TZR+ Rattenzellen auf a-GalCer besser zu verstehen, wurde der Ratten TZR analysiert. RT-PCR von Leberlymphozyten mit Va14-spezifischen Primern und die Analyse der klonierten PCR Produkte ergab ein viel schwächeres Signal für Ratten als für Maus cDNA. Darüber hinaus zeigten Sequenzanalysen, daß das Va14 auch mit anderen J als dem für TCRinv typischem Ja18 rearrangiert war. Die niedrige Anzahl von Va14Ja18 „in frame“ Umlagerungen legt Nahe, daß nur ein kleiner Anteil der Leber-lymphozyten CD1d restringierte NKT Zellen sind. Maus und humane NKT Zellen erkennen durch CD1d-b2m Komplexe präsentiertes a-GalCer und reagieren mit Aktivierung, Proliferation und Cytokinproduktion. Um die Fähigkeit von Maus und Ratten-CD1d a-GalCer zu präsentieren, zu testen, wurde das CD1d Molekül der Ratte kloniert. Sequenzanlyse und funktionelle Tests bestätigten die strukturelle und funktionelle Homologie des CD1d beider Spezies. Gleichzeitig wurde zur Analyse der Reaktivität von NKRP1A+TZR+ Zellen auf a-GalCer ein Ratten Va14+ invarianter TZR kloniert und in einem TZR- T-Zellhybridom (BWr/mCD28) exprimiert. Zellen die transgenen Ratten Va14+TZR und CD28 exprimierten, sezernierten IL-2 nach Stimulation mit aTZR/CD3 Antikörper aber zeigten keine Spezifität für a-GalCer. Die fehlende Reaktivität für a-GalCer und die fehlende Bindung von mCD1-a-GalCer Tetramer waren wahrscheinlich durch Aminosäuresubstitionen insbesondere an Position 71 (51 nach IMGT Nomenklatur) der klonierten TZRa Kette begründet. Eine „Umkehrung“ dieser Änderung wurde mittels molekularbiologischer Techniken durchgeführt aber Expression dieses TZR auf BWr/mCD28 wurde nicht erreicht. Im Gegensatz zum invarianten Va14+ Ratten TZR war der Maus Va14+ TZR voll funktional und spezifisch für mCD1d Tetramer. KT12 Hybridom und Maus TZRinv exprimierende BWr/mCD28 Zellen wurden sowohl durch Ratten als durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer aktiviert. Dasselbe galt für TZR, die eine Maus Va14 TZR Kette und eine Ratten Vb8.4 TZR Kette enthielten. Im Gegensatz hierzu antworteten Linien mit mVa14 und Ratten Vb8.2 nur auf durch Ratten und nicht auf durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer und banden nahezu kein mCD1d Tetramer. Dies legt Nahe, daß Keimbahn kodierte der b-Kettenbereiche (CDR2 oder CDR4) speziesspezifische Bereiche des CD1d erkennen. Weiterhin wurde gefunden, das die Zytokinsekretion der Zellinien durch CD80 spezifische monoklonale Antikörper inhibiert wurde, was eine wichtige Rolle der CD80-CD28 Interaktion bei der Aktivierung dieser Zellen nahelegt. Um zu sehen ob NKT Zellen auch in anderen Rattenstämmen als F344 existieren, wurde Häufigkeit und Funktion von NKRP1A+TZR+ Zellen in F344 und LEW Ratten miteinander verglichen. F344 und LEW, zwei Rattenstämme die unterschiedliche CD1d Allele tragen, zeigten in der Analyse mit einem neu generierten rCD1d spezifischen monoklonalen Antikörper nur geringe Unterschiede in der Expressionsstärke. Hingegen, unterschieden sich beide Stämme in der Reaktivität für a-GalCer. NKRP1A+ Zellen waren in der LEW Ratte weniger häufig als in der F344 Ratte und antworteten in vitro nicht auf a-GalCer oder sein Analogon OCH. Ein Resultat, das insbesodere angesichts der besonderen Empfänglichkeit von LEW Ratten für experimentell induzierte organspezifische Autoimmunerkrankungen von besonderem Interesse ist. Zusammgefasst kann gesagt werden, daß das Maus und Ratten CD1d/TZRinv NKT Zellsystem hohe strukturelle und funktionale Homologie aufweist, aber daß es wie im Menschen weniger invariante NKT Zellen in der Ratte als in der Maus gibt. TZR transgene Zelllinien wiesen ein speziesspezifisches Muster in der a-GalCer Erkennung auf, das für die Analyse von CDd/TZR-Kontaktbereichen von großem Nutzen sein wird. Dasselbe gilt für den Ratten und Maus-CD1d-spezifischen monoklonalen Antikörper, der im Rahmen der Studie generiert wurde. Dieser kann bei der Charakterisierung der CD1d Proteinexpression in verschiedenen Geweben und der besseren funktionellen Charakterisierung von CD1d restringierten T Zellen der Ratte eingesetzt werden. / Summary: Originally, NKT cells have been defined by their expression of T-cell receptor (TCR) and NK cell markers NKRP1A in human and NK1.1 (NKRP1C) in mouse. Most of these cells express CD1d-restricted TCR with a characteristic rearrangement- Va24JaQ/Vb11 in human and Va14Ja18/Vb8.2 in mouse, and have been implicated in playing an important role in first line defence and immunoregulation. The subject of this thesis was the characterisation of the hypothetical rat NKT cell population. In the mouse system, CD1d-restricted NK1.1+ T cells represented around 30% of intrahepatic and around 3% of splenic lymphocytes and could be visualised by staining with a-GalCer-loaded mouse CD1d tetramer. Rat NKRP1A+TCR+ cells, similar to mouse NKT cells, were predominantly expressed in the liver. However, their frequency was around 5 fold lower than the frequency of mouse intrahepatic lymphocytes. F344 rat NKT cells, in contrast to mouse CD4+ or DN NK1.1+ T lymphocytes, were of CD8 rather than CD4 phenotype, and did not bind to mCD1d-a-GalCer-tetramer. Since human hepatic CD1d-restricted Va24JQ+ T cells are not as frequent as their mouse counterparts and may express CD8- a marker not expressed by mouse CD1d-restricted cells, it is possible that the phenotype of F344 rat NKT cells corresponds more to the phenotype of human than mouse NKT cells. Similar to mouse NKT cells, F344 rat liver- and spleen-derived lymphocytes were able to produce IL-4 and IFN-g; when stimulated with the synthetic ligand a-GalCer in vitro. Therefore, the lack of binding of rat lymphocytes to mouse CD1d tetramer could not be due to their inability to respond to a-GalCer. To better characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, the rat invariant TCR was analysed. RT-PCR of liver lymphocytes with Va14-specific primers and subsequent cloning revealed a much weaker PCR signal for rat lymphocyte cDNA than for mouse cDNA. Furthermore the analysis of rat AV14JA18 sequences showed that the rat Va14+TCR invariant could be rearranged not only with AJ18 but also with other AJ segments. The low number of clones with in frame Va14Ja18 rearrangement could suggest that only a small proportion of liver lymphocytes were CD1d restricted NKT cells. Mouse and human NKT cells are able to recognise a-GalCer presented by the CD1d-b2 microglobulin complex, leading to their activation, proliferation and cytokine secretion. In order to compare the capacity of mouse and rat CD1d to present a-GalCer, rat CD1d was cloned. Sequence analysis and functional tests in vitro confirmed the structural and functional homology of rat CD1d with mouse CD1d. In parallel, to characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, rat Va14+TCR invariant was cloned and expressed in the TCR- T cell hybridoma BWr/mCD28. Rat Va14TCR+CD28+ transgenic cells secreted IL-2 upon aTCR/CD3 antibody stimulation, but were not specific for a-GalCer. Such cells were also negative in staining with mCD1d-a-GalCer tetramer. The lack of reactivity to a-GalCer and the lack of binding to mouse tetramer were probably caused by amino acid alterations, particularly at position 72 (51 according to IMTG nomenclature) of cloned rat TCRinv. Reversal of these “alterations” using molecular biology techniques was performed but the expression of this TCR on the surface of BWr/mCD28 cells could not be achieved. In contrast to rat TCRinv, mouse Va14+TCR was fully functional and was specific for mouse CD1d tetramer. KT12 hybridoma and BWr/mCD28 cells expressing mouse TCRinv, when stimulated with a-GalCer presented by primary CD1d+ cells or rCD1d transgenic cell lines, produced IL-2 in an Ag- and CD1d-dependent manner. Transgenic lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.4 responded to a-GalCer presented by rat and mouse CD1d, and bound mCD1 tetramer. By contrast, cell lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.2 responded only to a-GalCer presented by rCD1d and bound weakly to mCD1d tetramer. This suggests that germ line encoded regions of the b-chain (CDR2 or CDR4) bind to species-specific determinants of CD1d. The cytokine secretion of the cell lines was inhibited by anti-CD80 mAb, indicating the importance of CD80-CD28 costimulation in their activation. To check whether rat NKT cells may exist in other rat strains, the frequency and functions of NKRP1A+TCR+ in F344 and LEW rat were compared. F344 and LEW, two rat strains expressing different allelic CD1d forms, varied slightly in the level of CD1d expression, as assessed by staining with a newly generated CD1d specific monoclonal antibody. By contrast, these rat strains differed in terms of a-GalCer recognition. NKRP1A+TCR+ cells were less frequent in LEW than in F344 rats, and did not respond to a-GalCer or the analogue OCH in vitro, a result which is of special interest considering the susceptibility of LEW but not F344 rats to experimentally induced organ specific autoimmune diseases. In summary, the rat and mouse CD1d-invariant TCR systems show a high degree of structural and functional homology, but it seems that invariant NKT cells in rat, similar to such cells in human, occur at lower frequency than in mice. TCR transgenic cell line species-specific patterns of CD1d a-GalCer reactivity will provide a valuable tool for the mapping of CD1d/TCR contacts. Also monoclonal antibodies specific for rat and mouse CD1d, generated in this study, provide valuable tools to determine CD1d protein expression in various rat tissues and will help to better characterise functions of CD1d-restricted rat T cells.

NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Eliminierung von virusinfizierten Zellen aber vor allem auch von Tumorzellen. Neue Therapieformen wie die autologe NK-Zell-Therapie versuchen sich diese Eigenschaften der NK-Zellen zu Nutze zu machen. Allerdings zeigten diese Methoden bisher nur mäßige Erfolge. Als weitere Strategie wäre die direkte Modulation der NK-Zellen denkbar. Dasatinib ist ein potenter Inhibitor einer Vielzahl von Kinasen, welche maßgeblich an der Vermittlung und Regulation von NK-Zell-Effektorfunktionen beteiligt sind. Bisher ist einerseits eine unmittelbare Inhibition der NK-Zell-Funktionen in Gegenwart von Dasatinib beschrieben, andererseits finden sich aber in klinischen Studien Hinweise auf eine Erhöhung der anti-leukämischen NK-Zell-Aktivität bei mit Dasatinib behandelten Patienten. Um ein besseres Verständnis dieser differenten Effekte zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Arbeit neben der Zytotoxizität, Degranulation und Zytokinproduktion auch die möglichen Dasatinib-Einflüsse auf NK-Zell-Rezeptoren sowie auf molekularer Ebene die Einflüsse auf Signalmoleküle untersucht. Während in Gegenwart von Dasatinib eine Inhibition der NK-Zell-Effektorfunktionen gezeigt werden konnte, wurde nach 24 h Vorbehandlung eine signifikante Steigerung der Zytotoxizität gegenüber Daudi-Lymphomzellen als auch eine Zunahme der Zytokinproduktion und NK-Zell-Degranulation beobachtet. Diese aktivierenden Effekte waren unabhängig von der MHC-Klasse-I-Expression der Zielzellen nachweisbar. Während die Expression der NK-Rezeptoren NKG2D und LFA-1 durch Dasatinib nicht beeinflusst wurde, wurde CD16 nach der Stimulation mit K562- oder Daudi-Zellen auf Dasatinib- vorbehandelten NK-Zellen schneller herunterreguliert. Auf Proteinebene wurde die Phosphorylierung von Tyrosinresten, insbesondere auch von Lck, welches in der frühen Signaltransduktion von NK-Zellen eine wichtige Rolle spielt, in Gegenwart von Dasatinib inhibiert, während sich nach 24 h Vorbehandlung und nach Stimulation mit Zielzellen kaum Unterschiede im Phosphorylierungsniveau von p38, Akt und Erk zwischen unbehandelten und Dasatinb-behandelten NK-Zellen finden ließen. Zum Teil führte die Vorbehandlung sogar zu einer leichten Erhöhung der Phosphorylierung der Signalmoleküle Akt und Vav. Insgesamt scheint die Erhöhung der NK-Zell-Aktivität in erster Linie ein Reboud-Effekt zu sein. Die Ergebnisse der funktionellen Untersuchungen verdeutlichen die Wichtigkeit des Zeitpunktes der Dasatinib-Gabe um sich die immunmodulatorischen Effekte dieses Medikaments in der Lymphom bzw. Leukämietherapie zu Nutze zu machen. / NK cells play an important role in recognition and elimination of virally infected and malignant cells. New therapeutic approaches like autologous NK-cell therapy try to take advantage of these NK cell properties. However only moderate results could be achieved by this method. Direct modulation of NK-cells might be an alternative strategy. Dasatinib is a potent inhibitor of numerous kinases involved in transmission and regulation of NK-cell effector functions. Direct inhibition of NK –cell function in the presence of dasatinib has been described on the one hand, but on the other hand clinical trials give evidence of increased antileukaemic NK-cell activity in dasatinib treated patients. To elucidate theses opposing effects cytotoxicity, degranulation and cytokine production as well as possible influences on NK-cell receptors and signaling molecules were studied. While inhbition of NK-cell function could be shown in the presence of dasatinib, 24 h pre-treatment resulted in significant increase in cytotoxicity against Daudi lymphoma cells, cytokine production and NK-cell degranulation. These activating effects did not depend on MHC-class-I expression on target cells. While dasatinib had no influence on the expression of the NK-cell receptors NKG2D and LFA-1, downregulation of CD16 on dasatinib pre-treated NK-cells was accelerated after stimulation with K562 or Daudi cells. Phosphorylation of tyrosine residues, especially LCK, which plays an important role in early NK-cell signaling, was inhibited in the presence of dasatinib, but hardly any differences in the phosphorylation of p38, Akt and Erk could be observed when 24 h pre-treated NK cells were stimulated with target cells. A slight increase in phosphorylation levels of Akt and Vav was achieved by dasatinib pre-treatment. Altogether, the observed enhancement of NK-cell activity argues for a potential rebound effect. The results of the functional assays emphasize the importance of accurate scheduling of dasatinib doses to take advantage of its immunmodulatory effects in therapies against leukaemia and lymphoma.

Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are phagocytic cells of the innate immune system that efficiently kill bacteria. However, they also have regulatory effects on other immune cells and contribute to immunosuppression in cancer, which worsens the outcome. In particular, this has been demonstrated for a subset of granulocytic cells called myeloid- derived suppressor cells (MDSCs), but its distinction from PMNs is controversial. Most authors have explored the suppressive effects of MDSCs on T cells, but recent data suggest that NK cells are also affected. NK cells are crucial for the combat of tumor cells, in particular leukemic cells. There is hardly data available on the interaction between NK cells and suppressive granulocytic cells. Therefore, the aim of this thesis was to explore the effects of MDSCs and PMNs on the NK cell function against the leukemia cell line K562. In co-culture experiments, I demonstrate that granulocytic MDSCs and PMNs had similar effects on NK cell function and homeostasis. On the one hand, they positively influenced the survival and maturation of NK cells. On the other, they inhibited the activation, cytotoxicity and cytokine production of NK cells, both IFNγ and TNFα, in response to K562 target cells. Furthermore, I show a down-regulation of the activating receptor NKp30 on NK cells in the presence of MDSCs or PMNs, which may form part of the underlying suppressive mechanisms. However, there is also evidence for the involvement of other molecules. Further investigations are needed to confirm a relevant suppression of NK cells by granulocytic cells in cancer patients, and to identify therapeutic targets. The recognition that regular PMNs have similar effects on NK cells as MDSCs could simplify future experiments, since MDSCs are heterogeneous and laborious to isolate and identify. NKcells and granulocytes are among the first immune cells to reconstitute after hematopoietic stem cell transplantation, and NK cells may be particularly exposed to suppressive effects of granulocytes this scenario. Modulating these suppressive effects of granulocytes on NK cells therapeutically may yield a better NK cell function and an improved cancer prognosis.  / Neutrophile Granulozyten (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die insbesondere Bakterien durch Phagozytose unschädlich machen. Zusätzlich haben sie jedoch immunregulatorische und sogar immunsuppressive Eigenschaften. Sie tragen zur Suppression des Immunsystems im Rahmen von Tumorerkrankungen bei, was die Prognose negativ beeinflusst. Dies wurde insbesondere für einen Subtyp von Granulozyten, so genannte myeloide Suppressorzellen (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs), gezeigt, wobei deren Unterscheidung von PMNs kontrovers diskutiert wird. Die meisten Autoren untersuchten suppressive Effekte von MDSCs auf T Zellen, doch auch NK Zellen sind betroffen. Eine funktionierende NK Zell Antwort ist entscheidend für die Abwehr von Tumorerkrankungen, insbesondere Leukämie. Über die Interaktion von NK Zellen und MDSCs ist bisher wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von MDSCs und PMNs auf die NK Zell Antwort auf Leukämiezellen zu untersuchen. In Co-Kultur Experimenten zeige ich, dass granulozytäre MDSCs und PMNs ähnliche Effekte auf die Funktionen und Homöostase von NK Zellen haben. Einerseits wirkten sie sich positiv auf das Überleben und die Reifung der NK Zellen aus, andererseits hemmten sie deren Aktivierung, Zytotoxizität und Zytokinproduktion (sowohl IFNg als auch TNFa) als Antwort auf die Leukämie Zelllinie K562. Ferner war der Aktivierungsrezeptor NKp30 auf NK Zellen unter dem Einfluss der Granulozyten vermindert exprimiert, was mit für die inhibitorische Effekte verantwortlich sein könnte. In weiteren Experimenten sollte die Relevanz der hier gezeigten Effekte in vivo bestätigt werden und die zugrundeliegenden Mechanismen untersucht werden. Der Hinweis, dass PMNs ähnliche hemmende Effekte auf NK Zellen ausüben wie MDSCs kann zukünftige Experimente vereinfachen, da die Isolierung der MDSCs aufwändig und uneinheitlich ist. NK Zellen und neutrophile Granulozyten sind unter den ersten Immunzellen, die sich nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation erholen. NK Zellen könnten in dieser Situation besonders den hemmenden Einflüssen der Granulozyten unterliegen. Ein therapeutisches Eingreifen in diese Interaktion könnte die NK Zell Antwort stärken und die Prognose von Leukämieerkrankungen verbessern.

The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation. / Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit den antimykotischen Eigenschaften von NK-Zellen und dient der Charakterisierung der Immunantwort gegenüber A. fumigatus in Abhängigkeit der MOI (Multiplizität der Infektion). Klinisch interessant ist dies bei immunsupprimierten Patienten mit invasiver Aspergillose. Anhand von Oberflächenmarkern konnten eine an die Pilzkonzentration angepasste Bindung und Aktivierung von NK-Zellen demonstriert werden. Daneben kam es zu einer Modulation der Freisetzung ausgewählter Zytokine nach Konfrontation mit steigenden Mengen von A. fumigatus. Besonders deutlich war der Effekt bei den Chemokinen CCL3 und CCL4, deren Zusammenhang mit Pilzinfektionen bereits gezeigt wurde. Die Ergebnisse zum MOI-abhängigen Verhalten von NK-Zellen gegenüber A. fumigatus bestätigen die Relevanz bei der antimykotischen Immunantwort und verdeutlichen, weshalb ihnen zunehmende diagnostische und therapeutische Bedeutung zukommt. / The thesis focuses on the antifungal activity of NK-cells and characterizes the immune response towards A. fumigatus depending on the MOI (multiplicity of infection). This is of clinical interest regarding immunosuppressed patients suffering from invasive aspergillosis. Surface markers were used to demonstrate the binding and activation of NK cells adapted to the fungal concentration. In addition, the release of selected cytokines was modulated after confrontation with increasing amounts of A. fumigatus. The chemokine CCL3 and CCL4 that have already been described to be important during fungal infections showed the most impressive results. This study confirms the role of NK cells within the antifungal immune response and the increasing relevance for diagnosis and therapy.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von IL-12 auf die Rezeptoren DNAM-1, TIGIT und CD96 auf NK-Zellen näher zu untersuchen. Wir konnten nachweisen, dass IL-12 den Rezeptor DNAM-1 hochreguliert. CD96 wurde nach 48-stündiger Inkubation mit IL-12 bei frisch isolierten NK-Zellen zunächst ebenfalls hochreguliert, nach längerer in vitro Kultur mit IL-2/IL-15 und anschließender Intervention mit IL-12 für 48h fiel CD96 allerdings wieder unter das Ausgangsniveau ab. Die höchste Steigerung der Expression durch IL-12 konnte an den Rezeptoren CD62L (Adhäsion) und CD161 (Inhibition) beobachtet werden. Die Ergebnisse wiesen darauf hin, dass IL-12 einen Einfluss auf das Verhältnis der NK-Subpopulationen besitzt, indem es durch Hochregulation von CD56 und Herabregulation von CD16 zu einer Umwandlung von CD56dimCD16+ NK-Zellen zu CD56brightCD16- NK-Zellen beitrug. Während bei beiden Populationen DNAM-1 hochreguliert wurde, stieg die Expression von CD96 in der CD56dim Population, fiel aber in der CD56bright Population. Die Expression von TIGIT verhielt sich in der IL-15 Gruppe gegensätzlich dazu. IFN-γ konnte die Expression der Liganden für DNAM-1, TIGIT und CD96 auf einer der untersuchten Tumorzelllinien (SK-ES-1) steigern. Die Zytotoxizität von NK-Zellen konnte nicht durch IL-12 gesteigert werden. Indessen konnten wir feststellen, dass DNAM-1 für die Aufrechterhaltung der zytotoxischen Funktion essentiell war und eine Blockierung von DNAM-1 zu einer drastischen Verringerung derselben geführt hat. Dagegen konnten die NK-Zellen ihre Funktion nach der Blockierung von CD96 weitestgehend aufrechterhalten, es kam allerdings auch nicht zu einer gesteigerten Lyse von Tumorzellen. Die Ergebnisse verdeutlichten, dass IL-12 zwar die Expression von DNAM-1 auf NK-Zellen zu steigern vermochte, dies allerdings nicht zu einer gesteigerten Zytotoxizität der NK-Zellen gegenüber den getesteten drei Tumorzelllinien geführt hat. / The main focus of this work was to examine the influence of IL-12 on the receptors DNAM-1, CD96 and TIGIT on natural killer cells. We could show that IL-12 upregulates DNAM-1 expression. CD96 was upregulated on fresh isolated NK cells as well after 48h incubation with IL-12, however after 7 days in culture with IL-2/IL-15 CD96 was downregulated after treatment with IL-12. The highest increase of expression after treatment with IL-12 was observed for the receptors CD62L (adhesion) and CD161 (inhibitory). Our data suggested that IL-12 has an impact on the balance of the two subpopulations of NK cells. We suggested that via upregulation of CD56 and downregulation of CD16, IL-12 led to a turn from the CD56dimCD16+ NK-cell-population to the CD56brightCD16- population. In both populations DNAM-1 was upregulated, whereas the expression of CD96 was upregulated in the CD56dim population but downregulated in the CD56bright population. The expression of TIGIT was contrary to that of CD96 (in the IL-15 treated group). IFN-Y could increase the expression of the ligands of DNAM-1, TIGIT and CD96 (CD155 and CD112) on one of the examined tumor cell lines (SK-ES-1). Treatment with IL-12 was not able to increase the cytotoxicity of NK cells towards tumor cell lines. Instead we could demonstrate that DNAM-1 was essential for NK cell function and blocking of DNAM-1 dramatically decreased cytotoxicity. However blocking of CD96 had no impact on NK cell cytotoxicity. Our results show that although IL-12 increased expression of DNAM-1 on NK cell surface it had no positive impact on NK cell cytotoxicity towards three different tumor cell lines.

Die Bornasche Krankheit (Borna disease, BD) tritt natürlicherweise bei Pferden und Schafen auf. Infektionen mit dem Virus der BD (BDV) sind auch bei zahlreichen anderen Säuger- und Vogelarten bekannt, wobei diese – wie auch bei der Mehrzahl der infizierten Pferde und Schafe – zumeist klinisch inapparent verlaufen. Über mögliche Virusreservoire und die Art der Virusübertragung herrscht weitestgehend Unklarheit. Die bisher zur Verfügung stehenden Nachweismethoden sind lediglich in begrenztem Umfang und meist nur bei experimentell infizierten Tieren evaluiert. Unklar ist ferner, welchen Stellenwert die derzeit etablierten Nachweismethoden für die intra vitam Diagnostik natürlicher Infektionen haben. Mit diesen Fragen als auch mit Fragen nach der Virusausbreitung im infizierten Organismus und einer möglichen Erregerausscheidung beschäftigt sich die vorliegende Arbeit.

Erste tumorassoziierte Veränderungen finden im Glykosilierungsmuster von Glykoproteinen und Glykolipiden statt. Die dabei entstehenden tumorassoziierten Carbohydrat-Antigene sind prominente Zielstrukturen der natürlichen Tumorimmunität (Immune Surveillance) und gewinnen in der Onkologie als immunogene Epitope zunehmend an Bedeutung. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 ist Teil der tumorspezifischen Immunität. Er wurde mit Hilfe der konventionellen Hybridomatechnologie direkt aus einem an Magenkarzinom erkrankten Menschen isoliert. Neben der Erforschung seines außergewöhnlichen Apoptose-mechanismus konnte innerhalb dieser Arbeit eine Zielstruktur des Antikörpers identifiziert und charakterisiert werden. Der humane monoklonale IgM-Antikörper SAM-6 bindet an eine neue Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 (GRP78SAM-6). Das Antigen wurde über mehrstufige chromatographische Verfahren aus Tumorzellmembranextrakten aufgereinigt und nach tryptischen Verdau über die Methode des Peptidmassen-Fingerprinting eindeutig als humanes GRP78 identifiziert. Die auf der Zellmembran lokalisierte Variante des GRP78 besitzt ein Molekulargewicht von 82 kD und wird auf vielfältigen Tumorgeweben stabil exprimiert. GRP78SAM-6 liegt parallel zur 78 kD-Wildtyp-Variante co-exprimiert vor und konnte im Gegensatz zur Wildtyp-Variante nicht auf gesundem Gewebe nachgewiesen werden. Bei der SAM-6-spezifischen Variante des GRP78 handelt es sich um eine posttranslational modifizierte Form des GRP78, die spezifisch auf der Zellmembran lokalisiert ist, nicht jedoch intrazellulär zu finden ist. Sie unterscheidet sich durch zusätzliche Glykosilierungen vom GRP78-Wildtypen, wobei O-glykosidisch verknüpfte Glykane für die Bindung und die Reaktion mit dem SAM-6 Antikörper essentiell sind. Der SAM-6-Rezeptor stellt eine tumorspezifische Isoform des Hitzeschockproteins GRP78 dar, deren O-glykosilierte Carbohydrat-Regionen als Epitop fungieren. Durch die Bindung an GRP78SAM-6 hemmt der Antikörper SAM-6 in vitro als auch in vivo konzentrationsabhängig das Wachstum von Magen- und Pankreaskarzinomzellen und induziert eine neue Art des apoptotischen Zelltodes, die sog. Lipoptose. Es handelt sich um einen durch den Antikörper vermittelten direkten Effekt, der sich ausschließlich auf malignes Gewebe beschränkt. Schlüsselpunkt der apoptotischen Wirkung ist die Akkumulation zytotoxischer Mengen an Cholesterol und Triglyceridestern, die nach Bindung an den Antikörper in Form von Lipoprotein-Partikeln in die Tumorzelle gelangen. Der pentamere IgM-Antikörper bindet neben membranständigem GRP78SAM-6 der Tumorzelle, die ApoB 100-haltigen Lipoproteine VLDL und LDL. Insbesondere oxidativ modifizierte Formen des LDL (oxLDL) zeigten dabei die höchste Bindungsaffinität zum SAM-6 Antikörper. In deren Anwesenheit war ein maximaler lipotoxischer Effekt zu beobachten. Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, weite Teile des Lipoptose-Mechanismus aufzuklären. Eigenen Immunfluoreszenzstudien zufolge wird der SAM-6 Antikörper über rezeptorvermittelte Endozytose internalisiert. Die GRP78-vermittelte Internalisierung von oxLDL-beladenem Antikörper scheint daher plausibel und für die tödliche Anhäufung der Lipide verantwortlich zu sein. Die SAM-6-induzierte Apoptose verläuft anschließend über einen spezifischen Signalweg, der Gemeinsamkeiten mit dem intrinsischen Signalweg aufweist, jedoch wie beim extrinsischen Signalweg über externe pro-apoptotische Liganden angeregt wird. Infolge der unphysiologisch hohen intrazellulären Konzentration an oxLDL kommt es zur Induktion einer Caspasenkaskade, die nach der initialen Freisetzung von Cytochrom C aus den Mitochondrien über die Initiatorcaspasen 8 und 9 verläuft und letztendlich durch die Aktivierung der terminalen Caspasen 3 und 6 den apoptotischen Zelltod einleitet. Die Entdeckung von extrazellulär exprimiertem GRP78 auf Tumorzellen bietet die Möglichkeit neuer Therapieansätze in der Onkologie. Die SAM-6-spezifische Variante des GRP78 bietet insbesondere die Möglichkeit eines gezielten Angriffs auf die Tumorzelle, ohne gesunde Zellen zu tangieren. Sie wird auf Tumorgeweben verschiedenster Ätiologie stabil exprimiert und infolge ihres tumorspezifischen Auftretens zur optimalen Zielstruktur der natürlichen körpereigenen Immunantwort gegen Tumore. Der natürliche IgM-Antikörper ist Teil der natürlichen Immunität. Diese verfügt über ein breites Repertoire an Rezeptoren und garantiert die permanente Überwachung und Reaktion gegen modifizierte körpereigene Zellen. Sie ist dafür verantwortlich, dass Tumore sich nur in Ausnahmefällen manifestieren. / Tumor-associated modifications occur first in the glycosylation pattern of glycoproteins and glycolipids. These tumor-associated carbohydrate antigens are prominent targets of the natural tumor immunity (immune surveillance) and as immunogen epitopes they become more important for oncology therapies. The human monoclonal IgM antibody SAM-6 is part of this tumor specific immunity. It was isolated from a gastric cancer patient by using the conventional human hybridoma technology. Beside the investigation of its unique apoptosis mechanism, further goal of this study was the identification and characterization of the SAM-6 target. The human monoclonal IgM antibody SAM-6 binds to a new isoform of the GRP78 heat-shock protein (GRP78SAM-6). The SAM-6 antigen was purified from membrane extracts of stomach carcinoma cells using size exclusion and ion exchange chromatography. After tryptic digestion and peptide mass mapping it was definitely identified as human GRP78. The membrane bound variant of GRP78 has a molecular weight of 82 kD and is specifically over expressed in a wide range of cancer types. GRP78SAM-6 is co-expressed with wild-type GRP78 and is in contrast to its wild-type variant absent from normal tissues. The SAM-6 specific variant of GRP78 is a post-transcriptionally modified variant of GRP78, which is specifically expressed on the cell surface, but not found intracellularly. In contrast to the wild-type, GRP78SAM-6 is additionally glycosylated, whereas O-linked carbohydrates are essential for binding and reaction with the SAM-6 antibody. The SAM-6 receptor is a tumor specific isoform of the heat-shock protein GRP78, its epitopes are O-linked carbohydrate-moieties. After binding to GRPSAM-6, the antibody SAM-6 inhibits the growth of stomach and pancreas carcinoma cells in vitro and in vivo and induces a new kind of apoptotic cell death, the so-called lipoptosis. This direct and antibody induced effect is limited exclusively to malignant tissues. The crucial factor of the apoptotic effect is the accumulation of cytotoxic amounts of cholesterol and triglyceride esters, which get into the tumor cells in form of lipoprotein particles. The pentameric IgM antibody binds to GRPSAM-6 located on the tumor cell surface and to apoB 100, which is constituent of the lipoproteins VLDL and LDL. In particular, oxidatively modified LDL particles (oxLDL) showed the highest binding affinity to the SAM-6 antibody. In their presence the highest lipotoxic effect was observed. Within this study, important parts of this tumor specific lipoptosis mechanism could be explored. Own immunofluorescence studies revealed that the SAM-6 antibody is internalized via receptor mediated endocytosis. GRP78 mediated internalization of oxLDL-loaded antibody might be feasible and responsible for the deadly accumulation of lipids. The SAM-6 antibody induces a specific apoptotic pathway, which has similarities to the intrinsic pathway, but is activated by external pro-apoptotic ligands as it is know from the extrinsic pathway. Shortly after internalization of the antibody-LDL complex the unphysiologically high concentration of intracellular lipids initiates the release of mitochondrial cytochrom c followed by the activation of a cascade of caspases, such as initiator caspases 8 and 9 and finally the terminal caspases 3 and 6 leading to cell death. The discovery of extracellularly located GRP78 on tumor cells offers the opportunity of new oncological therapies. Especially the SAM-6 specific variant of GRP78 promises a targeted therapy against tumor cells, without hitting healthy cells. It is stable expressed on a variety of tumor tissues and in consequence of its tumor specific expression an ideal target of human innate immune responses against tumors. The natural IgM antibody SAM-6 is part of this natural immunity. It uses a broad repertoire of receptors and guaranties a permanent control and reaction against modified self-structures. Innate immunity is the reason that tumors only occur in exceptional cases.