NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Immunsystem, insbesondere durch die Zerstörung von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen sowie durch die Produktion von Zytokinen. Eine gezielte Modulation der Effektorfunktionen von NK-Zellen kann den Weg für neue Therapiestrategien gegenüber malignen Erkrankungen oder auch Autoimmunerkrankungen bahnen. Dasatinib ist ein potenter Inhibitor einer Vielzahl von Kinasen, die an der Regulation von NK-Zelleffektorfunktionen beteiligt sind und für die bereits eine Inhibition von T-Zelleffektorfunktionen gezeigt werden konnte [Schade et al. 2008; Weichsel et al. 2008]. Ein besseres Verständnis der immunmodulatorischen Eigenschaften von Dasatinib kann nicht nur neue Einsatzbereiche identifizieren, sondern auch die bereits bewährte Therapie der CML optimieren. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Dasatinib auf die Expansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion von humanen NK-Zellen analysiert. Dazu wurden aus peripheren Blutlymphozyten gesunder Spender polyklonale NK-Zellen in Kokultur mit bestrahlten RPMI 8866-Zellen mit und ohne Dasatinib expandiert und NK-Zelleffektorfunktionen mit Durchfluszytometrie-basierten Experimenten untersucht. Im Detail wurde die Zytotoxizität nach dem Prinzip des FATAL-Experiments [Sheehy et al. 2001], die Degranulationsaktivität über die Expression von CD107a/b, die Produktion von TNF-α bzw. IFN-γ mit einer intrazellulären Färbung und die Apoptose- und Zelltodanalyse über Annexin-V und 7-AAD gemessen. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass Dasatinib die Haupteffektorfunktionen von NK-Zellen gesunder Blutspender in vitro reguliert: Die Expansionskapazität von NK-Zellen wird dosisabhängig und bei 50 nM Dasatinib vollständig inhibiert, ohne dass dies durch ein Absterben der NK-Zellen bedingt ist. Die Zytotoxizität von NK-Zellen, die unter 10 nM Dasatinib expandiert sind, ist nach Entfernen des Medikamentes restauriert, und die Degranulationskapazität und die Zytokinproduktion sind gesteigert. Bei unbehandelt expandierten NK-Zellen führt die direkte Anwesenheit von Dasatinib zu einer dosisabhängigen Hemmung der Zytotoxizität gegenüber K562-Zellen. Darüber hinaus inhibiert Dasatinib dosisabhängig die Degranulation und Zytokinproduktion von NK-Zellen bei einer Stimulation mit K562-Zellen nicht aber bei einer Stimulation mit PMA/Ca2+Ionophor. Eine indirekte Veränderung des Lyseverhaltens der NK-Zellen durch Effekte von Dasatinib auf die K562-Zellen zeigt sich nicht nach 4h, aber nach 24h im Sinne einer erhöhten Spontanlyse, aber geringeren spezifischen Lyse. Eine 24h-Vorbehandlung von K562-Zellen mit Dasatinib führt außerdem zu einer verminderten Degranulationsaktivität und Zytokinproduktion von unbehandelten NK-Zellen. Die Hemmung der NK-Zelleffektorfunktionen bei direkter Anwesenheit von Dasatinib und deren Restauration respektive Steigerung nach Entfernen des Medikaments ist am ehesten auf eine reversible Inhibition von Src-Kinase-abhängigen Prozessen der intrazellulären Signalübertragung zurückzuführen. Eine kompromittierte NK-Zellfunktion könnte während einer Behandlung mit Dasatinib zu einer Verminderung der Infektabwehr und der immunologischen Tumorüberwachung führen. Möglicherweise lassen sich jedoch die unerwünschten Wirkungen durch ein verändertes Dosisregime, wie eine Hochdosispulstherapie, bei guter Therapieeffizienz minimieren. Eine supprimierte Aktivität der NK-Zellen durch Dasatinib könnte dagegen bei der Therapie von NK-Zelllymphomen oder auch von Autoimmunerkrankungen eine neue Behandlungsoption darstellen. Aufgrund der bereits bekannten inhibitorischen Wirkung auf T-Zellfunktionen gibt es dabei möglicherweise Synergien in der immunsuppressiven Wirkung. Das immunmodulatorische Potential von Dasatinib birgt daher große Chancen sowohl im Einsatz als Immunsuppressivum, als auch in der Optimierung der bereits bewährten Therapie der CML. / NK cells play an important role in the human immune system, especially by the lysis of virally infected cells and tumor cells, but also by the production of cytokines. Modulating NK cell effector functions may help to identify new strategies in the therapy of cancer or autoimmune diseases. Dasatinib is a potent inhibitor of multiple kinases regulating NK cell effector functions and the drug was already shown to inhibit T cell effector functions. A better understanding of the modulatory effect of dasatinib on the immune system may not only identify new applications of the drug but may also help to improve the current therapy of chronic myelogenous leukemia. Thus, the impact of dasatinib on the expansion, cytotoxicity and cytokine production of human NK cells was analyzed in this thesis. NK cells from healthy human blood donors were expanded by co-culturing irradiated RPMI 8866 cells with and without dasatinib. NK cell effector functions have been examined by flow cytometry. Cytotoxicity was analyzed by a FATAL-based experiment, degranulation activity by CD107a/b expression, TNF-α and IFN-γ production by intracellular staining and viability by Annexin V and 7-AAD. The data of this work show that dasatinib regulates the main NK cell effector functions of healthy blood donors in vitro. Expansion of NK cells is dose-dependently inhibited, including a complete inhibition at 50 nM dasatinib, which is not due to a decreased viability of NK cells. After removing the drug, cytotoxicity of NK cells being expanded at 10 nM dasatinib is restored while degranulation and cytokine production are increased. When no drug is present during expansion, dasatinib inhibits NK cell cytotoxicity against K562 cells in a dose-dependent manner. Furthermore, dasatinib leads to a dose-dependent inhibition of degranulation and cytokine production of NK cells after stimulation by K562 cells but not after stimulation by PMA/Ca2+Ionophor. Indirect effects of dasatinib on NK cell cytotoxic activity by an impairment of K562 cells is not detected after 4h, but after 24h showing an increased spontaneous lysis but a decreased specific lysis. 24h-pretreating of K562 cells with dasatinib decreases degranulation and cytokine production of untreated NK cells. The inhibition of NK cell effector functions by direct presence of dasatinib and their restoration or enhancement after removing the drug are most likely due to a reversible inhibition of SRC-kinase dependent processes during intracellular signal transduction. An impaired NK cell function during the treatment with dasatinib might alter immune defense or tumor immunosurveillance. However, adverse effects could also be reduced by a high-dose pulse therapy with an equal anti-tumor efficacy. Suppressing NK cell activity by dasatinib might also be helpful in the therapy of NK cell lymphomas or autoimmune diseases. As an inhibitory effect was already shown on T cell functions, there might be a synergistic action regarding the immunosuppressive effect. The potential of dasatinib is promising not only as an immunosuppressant but also by improving the current therapy of chronic myelogenous leukemia.

Der menschliche Organismus ist zeitlebens von malignen Neoplasien bedroht, die durch lokales oder metastasiertes Wachstum lebensnotwendige Funktionen des Körpers beeinträchtigen können. Als wichtigstes Werkzeug zur Abwehr dieser Neoplasien wurde in den letzten Jahrzehnten die natürliche Immunität aufgedeckt. Besonders die Antikörper der innaten Immunität spielen eine entscheidende Rolle. BARB-4 ist ein humaner, tumorspezifischer Antikörper und Teil dieser natürlichen Immunität. Er wurde mit Hilfe der Hybridomatechnologie aus einem Patienten mit Siegelringkarzinom des Magens isoliert, und ist einer der wenigen Vertreter innater humaner IgG Antikörper. Diese Arbeit gibt einen ersten Überblick über die Bindungsspezifität und die funktionellen Eigenschaften des BARB-4-Antikörpers. In den immunhistochemischen Färbungen konnte die Tumorspezifität des Antikörpers nachgewiesen werden. Bei dem zugehörigen Antigen handelt es sich um eine Variante des TAF15, einem Protein der FET-Familie, die intrazelluläre Aufgaben bei Transkriptionsvorgängen haben, bei denen zudem aber auch eine Beteiligung an Adhäsions- und Migrationsvorgängen vermutet wird. Diese Variante ist bei malignen Zellen an der Oberfläche lokalisiert, was die Ergebnisse der Durchflußzytometrie belegen. Durch konfokale Mikroskopie mit Fluoreszenz-markiertem BARB-4 konnte diese Oberflächenbindung an Tumorzellen bestätigt werden. Im weiteren zeitlichen Verlauf konzentrierte sich der Antikörper im Zellinneren. Die Präsenz des Antikörpers führte bei Versuchen mit Tumorzellen zu einer bemerkenswerten Hemmung der Adhäsions- und Migrationsfähigkeit der Zellen. Beide stellen Schlüsseleigenschaften für die Metastasierung von Tumorzellen dar. Diese Eigenschaften könnten BARB-4 für einen möglichen, therapeutischen Einsatz zur Prävention von Tumormetastasen qualifizieren. / Throughout live, the human body is threatened by malign neoplasms whose local or metastasizing growth can restrict its essential functions. In the last decades, natural immunity was discovered as an instrumental tool in the fight against these neoplasms. Especially antibodies of the innate immune response play a central role in this defense. BARB-4 is part of this repertoire of antibodies. B-cells producing BARB-4 were isolated from a patient suffering from signet ring carcinoma, and propagated using Hybridoma-technology. While most antibodies of the innate immune response are of the IgM subclass, BARB-4 is an IgG antibody. This work offers an assessment of the specificity and functional properties of BARB-4. By using immuno-histochemistry, it couId be shown that BARB-4 specifically binds to human cancer cells. More specifically BARB-4 binds to a variant of TAF15, a member of the FET family of transcriptional regulators. TAF15 is also assumed to be involved in adhesion and cell-migration. Flow-cytometry confirmed its localization to the plasma-membrane, which is unique to this tumor-specific variant of TAF15. Subsequent confocal microscopy showed that after initial binding of TAF15, the BARB-4 antibody is internalized by the bound cancer cells. Remarkably, BARB-4 treatment of cancer cells resulted in the inhibition of their ability to adhere and migrate. As both adhesion and migration are hallmarks of metastasis in cancer cells, BARB-4 is a possible candidate for therapeutic prevention of cancer metastasis.

Tumorstammzellen scheinen das Triebwerk für die Initiierung und Progression des Mammakarzinoms zu sein. Durch ihr Potential zur Proliferation von Tumorgewebe, zur Metastasierung und zur Bildung von Rezidiven bestimmen sie maßgeblich die Prognose und Mortalität von Brustkrebspatientinnen. Diese Arbeit demonstriert, welche Mechanismen sich Brustkrebsstammzellen zu Nutze machen, um einer Immunantwort durch NK Zellen zu entkommen. Mittels durchflusszytometrischer Analysen konnte innerhalb der Gesamtpopulation an MCF 7-Brustkrebszellen eine CD44highCD24low-Subpopulation, die dem Tumorstammzellanteil entspricht, abgegrenzt werden. Im Vergleich zur Ausgangspopulation war nach einer Kokultur mit aktivierten NK Zellen gesunder menschlicher Spender eine Anreicherung von Tumorstammzellen in vitro zu verzeichnen. Die Inkubation von Brustkrebszellen mit NK Zell-Überstand führte zu keiner wesentlichen Veränderung der Tumorstammzellpopulation, was die Notwendigkeit eines direkten Zell-Zell-Kontakts impliziert. Diese Tumorstammzellen könnten nach einem Angriff durch NK Zellen einerseits durch Selektion übrig geblieben sein oder andererseits durch epithelial-mesenchymale Transition (EMT) neu entstanden sein. Hinweise auf einen Selektionsprozess ließen sich anhand der verminderten Oberflächenexpression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen im Vergleich zu Nichtstammzellen finden. Die untersuchten Brustkrebszelllinien (MCF 7, SKBR 3, BT 474 und MDA MB 231) besaßen ein jeweils individuell reguliertes Muster der aktivierenden NKG2D Liganden (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3), DNAM 1-Liganden (CD112, CD155) und von MHC1-Molekülen auf Tumorstammzellen und Nichtstammzellen. Die niedrigere Expression von NK Zell-Liganden auf Tumorstammzellen lässt auf eine verminderte Angreifbarkeit durch NK Zellen schließen. Eine Induktion von Tumorstammzellen aus differenzierten epithelialen Tumorzellen via EMT nach einer Kokultur mit NK Zellen konnten wir beweisen. Aus einer stammzelldepletierten MCF 7-Population gingen nach dem Kontakt zu NK Zellen Tumorzellen mit dem Phänotyp CD44highCD24low de novo hervor. Die Herunterregulation des epithelialen Adhäsionsmoleküls E-Cadherin sowie die Hochregulation mesenchymaler Marker wie des Strukturproteins Vimentin, der EMT-auslösenden Transkriptionsfaktoren Slug, Snail und Twist, und der stammzelltypischen Transkriptionsfaktoren Oct4, KLF4 und cMyc auf mRNA-Ebene sprachen für eine EMT-getriggerte Induktion von Tumorstammzellen nach einer Kokultur von MCF 7-Zellen mit NK Zellen. Desweiteren stellten wir fest, dass der direkte Kontakt zwischen Tumorzellen und NK Zellen für die Induktion von Tumorstammzellen von großer Bedeutung ist, und zwar auch nach Inhibition des zytotoxischen Effektorpotentials der NK Zellen. Diese Zell-Zell-Interaktionen scheinen von NKG2D und DNAM 1 abhängig zu sein und eine konsekutive Stammzellinduktion via EMT zu beinhalten. Da aus einer nativen Population nach dem Kontakt zu NK-Zellen ein doppelt so hoher Anteil an Tumorstammzellen hervorging wie aus einer ebenso mit NK-Zellen behandelten stammzelldepletierten Fraktion, ist davon auszugehen, dass ein überdurchschnittlich gutes Überleben von Tumorstammzellen unter NK-Zell-vermitteltem Selektionsdruck auch zum „Immune Escape“ beitragen kann. Hinsichtlich ihrer Klonogenität gab es zwischen bestehenden und induzierten Tumorstammzellen keinen Unterschied. Beide Fraktionen waren in gleichem Ausmaß in der Lage neue Kolonien zu bilden. Es konnte also gezeigt werden, dass eine EMT-getriggerte Induktion im Sinne eines „Immune Escapes“ von Brustkrebszellen nach dem Kontakt zu NK Zellen maßgeblich zur Tumorstammzellanreicherung beiträgt. Ein zusätzlicher Selektionsprozess bestehender Tumorstammzellen kann als wahrscheinlich angenommen werden. Interaktionen über die NK Zell-Rezeptoren NKG2D und DNAM 1 bzw. deren Liganden auf Tumorzellen scheinen eine Schlüsselrolle zu spielen. Sie könnten als Ansatzpunkt für medizinische Interventionen dienen, die zur Verhinderung einer Tumorstammzellanreicherung im Mammakarzinom beitragen und somit die Prognose von Brustkrebspatientinnen verbessern. / Tumor stem cells seem to be the engine for initiation and progression of breast cancer. By their potential for unlimited proliferation, dissemination and relapse they largely determine the prognosis and mortality of breast cancer patients. This thesis shows mechanisms breast cancer (stem) cells use to escape from an immune response by NK cells. Using flow cytometry analysis, we defined a subpopulation of CD44highCD24low cells corresponding to the tumor stem cell fraction of MCF-7 breast cancer cells. Compared to the native MCF-7 cell population we observed an enrichment of tumor stem cells in vitro after co-culture with activated NK cells from healthy human donors. Incubation of breast cancer cells with NK cell supernatant resulted in no significant change, which implies that the observed NK cell-mediated enrichment of the cancer stem cell population depends on direct cell-cell contact. One possibility is that these tumor stem cells could be enriched by selection, i.e. by preferential killing of their more differentiated counterparts. Alternatively, they could arise de novo via epithelial to mesenchymal transition (EMT). A selection process was supported by data showing reduced surface expression of NK cell ligands on tumor stem cells compared to non-stem cells. The investigated breast cancer cell lines (MCF-7, SKBR 3, BT 474 and MDA MB 231) showed a distinctly regulated pattern of activating NKG2D-ligands (MICA, MICB, ULBP1, ULBP2, ULBP3) and DNAM 1-ligands (CD112, CD155) and of MHC1-molecules on tumor stem cells and non-stem cells. The comparatively lower expression of NK cell ligands suggests a reduced vulnerability of tumor stem cells towards NK cells. However, we also showed the induction of tumor stem cells from differentiated epithelial tumor cells via EMT. Tumor cells with the phenotype CD44highCD24low arose de novo from a stem cell depleted MCF-7 tumor cell population which was then co-incubated with NK cells. Downregulation of the epithelial cell adhesion molecule E-cadherin as well as upregulation of mesenchymal markers such as the structural protein vimentin, the EMT-inducing transcription factors Slug, Snail and Twist and the stem cell-typical transcription factors Oct4, KLF4 and cMyc on mRNA level indicate an EMT-triggered induction of tumor stem cells after co-culture of MCF-7 with NK cells. We also found that the direct contact between tumor cells and non-lytic NK cells is of vital importance for the induction of tumor stem cells. These cell-cell interactions appeared to depend on NKG2D and DNAM-1 and to include a consecutive stem cell induction via EMT. As the proportion of tumor stem cells after co-culture of native MCF-7 cells and NK cells was almost twice the number of stem cells arisen from an equally treated stem cell depleted fraction we can assume that an above-average survival of tumor stem cells due to selection stress can also contribute to immune escape. Regarding their clonogenicity we noticed no difference between pre-existent and induced tumor stem cells. Both fractions possessed the ability to generate new colonies of similar quantity. Thus, we showed that upon exposure to NK cells EMT-triggered induction considerably contributes to the enrichment of breast cancer stem cells. An additional process of stem cell selection seems to be realistic. Interactions of the NK cell receptors NKG2D and DNAM 1 and its ligands on tumor cells respectively seem to play a key role. The recognition that de-differentiation may represent a previously unrecognized immune escape mechanism of breast cancer cells could serve as a starting point for medical interventions, with the aim of preventing stem cell accumulation in breast cancer and thus improving the prognosis of breast cancer patients.

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung von Punktmutationen in ifng und ncam1 in Hinblick auf eine veränderte Funktionalität von NK-Zellen bei der Interaktion mit A. fumigatus. Die gewonnenen Erkenntnisse sollen langfristig zur Verbesserung der Diagnostik, Prophylaxe und Therapie einer Invasiven Aspergillose, die zum Beispiel im Rahmen einer Stammzelltransplantation auftreten könnte, beitragen. In dieser Arbeit wurde die DNA von zwanzig gesunden Spendern auf einen ifng-SNP (rs2069705) und einen ncam1-SNP (rs10502171) untersucht. Von je drei ausgewählten Spendern mit SNP und sechs Kontrollspendern wurden NK-Zellen isoliert. Diese wurden unstimuliert belassen, mit Interleukin 2/15 oder A. fumigatus stimuliert. Bei der Versuchsreihe zum ifng-SNP wurde eine qPCR zur Ermittlung der relativen Expression von ifng und ccl4, bei den Versuchen zum ncam1-SNP eine durchflusszytometrische Analyse zur Messung der Expression verschiedener Oberflächenmarker durchgeführt. Bei beiden wurde mittels ELISA die Freisetzung von IFN-gamma bzw. CCL4/MIP-1ß bestimmt. Die in dieser Arbeit gewonnenen Ergebnisse zum ifng-SNP lassen vermuten, dass das Vorliegen dieses ifng-SNP keine durch NK-Zellen vermittelten Auswirkungen auf das Risiko der Patienten, an einer Invasiven Aspergillose zu erkranken, hat. In Bezug auf den ncam1-SNP konnte die Hypothese bestätigt werden, dass der SNP die Interaktion zwischen der NK-Zelle und A. fumigatus verändert. Der SNP korreliert zwar mit einer erhöhten Grundaktivierung von NK-Zellen, jedoch auch mit einem schwächeren Aktivierungspotential bei Stimulation mit dem Pilz. / The aim of this thesis was the characterization of point mutations in ifng and ncam1 with respect to an altered functionality of NK cells during interaction with A. fumigatus. In the long term, the findings should contribute to the improvement of the diagnosis, prophylaxis and therapy of invasive aspergillosis, which can occur, for example, after stem cell transplantation. In this work, the DNA of twenty healthy donors was examined for one ifng-SNP (rs2069705) and one ncam1-SNP (rs10502171). NK cells were isolated from three donors for each SNP and six control donors. These were left unstimulated, stimulated with interleukin 2/15 or A. fumigatus. In the ifng-SNP series qPCR was performed to determine the relative expression of ifng and ccl4, in the ncam1-SNP series flow cytometric analysis was performed to measure the expression of different surface markers. In both cases the release of IFN-gamma and CCL4/MIP-1ß was determined by ELISA. The results obtained in this study on ifng-SNP suggest that the presence of this ifng-SNP has no NK cell mediated effects on the risk of patients suffering from invasive aspergillosis. With regard to the ncam1-SNP, the hypothesis that the SNP alters the interaction between the NK cell and A. fumigatus was confirmed. The SNP correlates with an increased basic activation of NK cells, but also with a weaker activation potential when stimulated with the fungus.

In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle der Transkriptionsfaktoren NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2 in NK-Zellen und die Rolle der Faktoren NFATc1-4 und NFAT5 in Keratinozyten analysiert. Die Familie der Nuclear Factor of Activated T-cell (NFAT) Transkriptionsfaktoren besteht aus fünf Mitgliedern, welche entscheidend die Gentranskription bei Immunantworten beeinflussen. Nach Antigenaktivierung wird in Lymphozyten die Expression des Nfatc1-Gens stark induziert. Die Akkumulation der dabei gebildeten kurzen Isoform NFATc1/αA ist für die Zytokinproduktion als Effektorfunktion sowie für die Proliferation und das Überleben aktivierter Zellen verantwortlich. Das kurze NFATc1-Protein unterscheidet sich nicht nur strukturell, sondern auch funktionell von fast allen anderen NFAT-Proteinen. Um neue Erkenntnisse über die Funktion der Isoform NFATc1/αA in Lymphozyten zu gewinnen, wurden KT12 NK-Zellen mit NFATc1/αA bzw. NFATc1/ßC und NFATc2- exprimierenden Vektoren transfiziert, geklont, stimuliert und anschließend auf ihre jeweilige Apoptoserate und die Zytokinsynthese bzw. -expression hin untersucht. Die gewählten KT12-Hybridoma-Zellen erwiesen sich allerdings in ihrer intendierten Funktion als Testzellen für die Über-Expression von NFATc-Proteinen in NK-Zellen als ungeeignet. Fehlregulationen von NFAT-Signalwegen werden mit einer fehlerhaften Entwicklung des Immunsystems, mit der Entstehung von Autoimmunerkrankungen und mit Krebs in Verbindung gebracht. Um die Rolle von NFAT-Faktoren in Keratinozyten besser zu verstehen, wurden HaCaT-Zellen und primäre humane Keratinozyten mit Differenzierungssignalen bzw. UVB-Licht stimuliert. Änderungen der Transkription von NFAT-Faktoren, Keratinozyten-spezifischen Proteinen und Chemokinen wurden mittels qRT-PCR-Assays detektiert und analysiert. Insgesamt konnte die Beteiligung von NFAT-Faktoren am Differenzierungsprozess und an der UV-Antwort von Keratinozyten gezeigt werden. Es zeigte sich tendenziell eine stärkere Induktion der kurzen NFATc1-Isoform im Vergleich zu langen NFATc1-Isoformen, was die Frage nach einer besonderen Funktion der kurzen NFATc1-Isoform in Keratinozyten aufwirft. Generell ließen sich besonders hohe Expressionslevel des Transkriptionsfaktors NFAT5 - verglichen mit anderen NFAT-Faktoren - messen. Für die Entwicklung von Therapien, welche die Ursachen und Folgen einer dysregulierten Hautbarrierenbildung behandeln, könnten sich weitere Studien zu einzelnen NFAT-Faktoren bzw. NFATc1-Isoformen als zielführend erweisen. / In the present work the role of the transcription factors NFATc1/αA or NFATc1/ßC and NFATc2 in NK cells and the role of the factors NFATc1-4 and NFAT5 in keratinocytes were investigated. The nuclear factor of activated T-cell (NFAT) transcription factor family consists of five members that critically influence gene transcription in immune responses. Following antigen activation, expression of the Nfatc1 gene is strongly induced in lymphocytes. Accumulation of the short NFATc1/αA isoform - formed in this process - is responsible for cytokine production as an effector function and for proliferation along with the survival of activated cells. The short NFATc1 protein differs not only structurally but also functionally from almost all other NFAT proteins. To gain new insights into the function of the NFATc1/αA isoform in lymphocytes, KT12 NK cells were transfected with NFATc1/αA, NFATc1/ßC or NFATc2- expressing vectors. The KT12 cells were cloned, stimulated and subsequently analyzed for their respective apoptosis rates together with cytokine synthesis or expression. However, the selected KT12 hybridoma cells proved to be unsuitable in their function as test cells for the overexpression of NFATc proteins in NK cells. Misregulation of NFAT signaling pathways has been associated with defective development of the immune system and autoimmune diseases and cancer. To better understand the role of NFAT factors in keratinocytes, HaCaT cells and primary human keratinocytes were stimulated with differentiation signals and UVB light, respectively. Changes in transcription of NFAT factors, keratinocyte-specific proteins and chemokines were detected and analyzed by qRT-PCR assays. Overall, the involvement of NFAT factors in the differentiation process and UV response of keratinocytes was demonstrated. The short NFATc1 isoform tended to be more strongly induced compared with long NFATc1 isoforms, raising the question of a special function of the short NFATc1 isoform in keratinocytes. Particularly high expression levels of the transcription factor NFAT5 - compared to other NFAT factors - could be measured. For the development of therapies that treat the causes and consequences of dysregulated skin barrier formation further studies on individual NFAT factors or NFATc1 isoforms will prove useful.

The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus. / Der humanpathogene Pilz Aspergillus (A.) fumigatus kann lebensbedrohliche Infek-tionen in immunsupprimierten Patienten verursachen. Die Immunerkennung von Patho-genen sowie die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen sind essentiell für die erfolg-reiche Bekämpfung von Pilzinfektionen. Zell-Zell-Interaktionen tragen zur gegenseitigen Aktivierung bei und können somit die Zytotoxizität gegenüber eindringenden Pathogenen steigern. In dieser Arbeit wurde die gegenseitige Zellaktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die aus Monozyten generierten, dendritischen Zellen (DZ) nach Stimula-tion mit Zellwandfraktionen und Zelllysaten des Pilzes A. fumigatus analysiert. Des Weite-ren wurde der Einfluss dendritischer Rezeptoren auf die NK-Zellaktivierung untersucht. Die Stimulation mit Liganden für Dectin-1 und TLR-2 induzierte die Freisetzung löslicher Faktoren, welche ausreichend waren, um autologe NK-Zellen zu stimulieren. Zusammen-fassend ist zu sagen, dass DZ mehr Rezeptoren zur Pilzerkennung exprimieren und so-mit NK-Zellen auch dann aktivieren konnten, wenn diese, aufgrund fehlender Rezepto-ren, nicht stimuliert wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Pathogen-Erkennungsrezeptoren auf NK-Zellen identifiziert werden. Der Charakterisierungsmarker CD56 zeigte nach fun-galer Kokultur eine reduzierte Detektion in durchflusszytometrischen Analysen. Die ver-minderte Proteindetektion von CD56 war nicht assoziiert mit Apoptose, Internalisation, Sekretion oder Proteindegradierung. Weitere Analysen bestätigten eine starke CD56-Bindung zu Pilzhyphen, gefolgt von einer Konzentration des Proteins an der NK-A. fumi-gatus Interaktionsstelle. Diese Relokalisation zeigte eine Abhängigkeit zu Aktin, da Zytos-kelett-Inhibitoren die CD56-Bindung am Pilz verhinderten. Eine spezifische Blockade von CD56 Rezeptoren reduzierte die Freisetzung der immun-rekrutierenden Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES, was folgern ließ, dass CD56 eine funktionelle Rolle in der Pil-zerkennung der NK-Zellen hat. NK-Zellen, die während einer Immunsuppressionstherapie aus Empfängern einer al-logenen Stammzelltransplantation (alloSZT) gewonnen wurden, zeigten eine inhibierte Bindung von CD56 an Pilzhyphen. Diese korrelierte mit einer reduzierten Aktinpolymeri-sation nach fungaler Stimulation. Weiterhin hemmte eine Immunsuppressionstherapie mit Corticosteroiden die Sekretion von MIP-1α, MIP-1β und RANTES in NK-Zellen, die mit Pilz ex vivo stimuliert wurden. Ähnliches war zu beobachten, wenn NK-Zellen von ge-sunden Spendern vor Pilzstimulation mit Corticosteroiden vorbehandelt wurden. Daraus folgend wurde den Corticosteroiden ein negativer Einfluss auf die NK-Zellfunktion bei Pilzinfektionen zugesprochen.

The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM. / Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren. Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können. Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren. Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren. Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM.

This thesis tackles the problem of modeling the semantics of natural language. Neural Network models are reviewed and a new Bayesian approach is developed and evaluated. As the performance of standard Monte Carlo algorithms proofed to be unsatisfactory for the developed models, the main focus lies on a new adaptive algorithm from the Sequential Monte Carlo (SMC) family. The Gradient Importance Sampling (GRIS) algorithm developed in the thesis is shown to give very good performance as compared to many adaptive Markov Chain Monte Carlo (MCMC) algorithms on a range of complex target distributions. Another advantage as compared to MCMC is that GRIS provides a straight forward estimate of model evidence. Finally, Sample Inflation is introduced as a means to reduce variance and speed up mode finding in Importance Sampling and SMC algorithms. Sample Inflation provides provably consistent estimates and is empirically found to improve convergence of integral estimates. / Diese Dissertation befasst sich mit der Modellierung der Semantik natürlicher Sprache. Eine Übersicht von Neuronalen Netzwerkmodellen wird gegeben und ein eigener Bayesscher Ansatz wird entwickelt und evaluiert. Da die Leistungsfähigkeit von Standardalgorithmen aus der Monte-Carlo-Familie auf dem entwickelten Model unbefriedigend ist, liegt der Hauptfokus der Arbeit auf neuen adaptiven Algorithmen im Rahmen von Sequential Monte Carlo (SMC). Es wird gezeigt, dass der in der Dissertation entwickelte Gradient Importance Sampling (GRIS) Algorithmus sehr leistungsfähig ist im Vergleich zu vielen Algorithmen des adaptiven Markov Chain Monte Carlo (MCMC), wobei komplexe und hochdimensionale Integrationsprobleme herangezogen werden. Ein weiterer Vorteil im Vergleich mit MCMC ist, dass GRIS einen Schätzer der Modelevidenz liefert. Schließlich wird Sample Inflation eingeführt als Ansatz zur Reduktion von Varianz und schnellerem auffinden von Modi in einer Verteilung, wenn Importance Sampling oder SMC verwendet werden. Sample Inflation ist beweisbar konsistent und es wird empirisch gezeigt, dass seine Anwendung die Konvergenz von Integralschätzern verbessert.

The present dissertation focuses on the question whether and under which conditions infants recognise clauses in fluent speech and the role a prosodic marker such as a pause may have in the segmentation process. In the speech signal, syntactic clauses often coincide with intonational phrases (IPhs) (Nespor & Vogel, 1986, p. 190), the boundaries of which are marked by changes in fundamental frequency (e.g., Price, Ostendorf, Shattuck-Hufnagel & Fong, 1991), lengthening of the final syllable (e.g., Cooper & Paccia-Cooper, 1980) and the occurrence of a pause (Nespor & Vogel, 1986, p. 188). Thus, IPhs seem to be reliably marked in the speech stream and infants may use these cues to recognise them. Furthermore, corpus studies on the occurrence and distribution of pauses have revealed that there is a strong correlation between the duration of a pause and the type of boundary it marks (e.g., Butcher, 1981, for German). Pauses between words are either non-existent or short, pauses between phrases are a bit longer, and pauses between clauses and at sentence boundaries further increase in duration. This suggests the existence of a natural pause hierarchy that complements the prosodic hierarchy described by Nespor and Vogel (1986). These hierarchies on the side of the speech signal correspond to the syntactic hierarchy of a language. In the present study, five experiments using the Headturn preference paradigm (Hirsh-Pasek, Kemler Nelson, Jusczyk, Cassidy, Druss & Kennedy, 1987) were conducted to investigate German-learning 6- and 8-month-olds’ use of pauses to recognise clauses in the signal and their sensitivity to the natural pause hierarchy. Previous studies on English-learning infants’ recognition of clauses (Hirsh-Pasek et al., 1987; Nazzi, Kemler Nelson, Jusczyk & Jusczyk, 2000) have found that infants as young as 6 months recognise clauses in fluent speech. Recently, Seidl and colleagues have begun to investigate the status the pause may have in this process (Seidl, 2007; Johnson & Seidl, 2008; Seidl & Cristià, 2008). However, none of these studies investigated infants’ sensitivity to the natural pause hierarchy and especially the sensitivity to the correlation between pause durations and the respective within-sentence clause boundaries / sentence boundaries. To address these questions highly controlled stimuli were used. In all five experiments the stimuli were sentences consisting of two IPhs which each coincided with a syntactic clause. In the first three experiments pauses were inserted either at clause and sentence boundaries or within the first clause and the sentence boundaries. The duration of the pauses varied between the experiments. The results show that German-learning 6-month-olds recognise clauses in the speech stream, but only in a condition in which the duration of the pauses conforms to the mean duration of pauses found at the respective boundaries in German. Experiments 4 and 5 explicitly addressed the question of infants’ sensitivity to the natural pause hierarchy by inserting pauses at the clause and sentence boundaries only. Their durations were either conforming to the natural pause hierarchy or were being reversed. The results of these experiments provide evidence that 8-, but not 6-month-olds seem to be sensitive to the correlation of the duration of pauses and the type of boundary they demarcate. The present study provides first evidence that infants not only use pauses to recognise clause and sentence boundaries, but are sensitive to the duration and distribution of pauses in their native language as reflected in the natural pause hierarchy. / Die vorliegende Dissertation geht der Frage nach, ob und ab wann Deutsch lernende Kinder in der Lage sind, Clauses in gesprochener Sprache zu erkennen und welche Rolle dabei ein prosodischer Marker wie die Pause spielen kann. Im Sprachstrom sind syntaktische Clauses oft durch Intonationsphrasen (IPhs) repräsentiert (Nespor & Vogel, 1986). Die Grenzen solcher IPhs werden markiert durch Veränderungen in der Grundfrequenz (z.B., Price, Ostendorf, Shattuck-Hufnagel & Fong, 1991), die Längung der grenzfinalen Silbe (z.B., Cooper & Paccia-Cooper, 1980) und das Vorhandensein einer Pause (Nespor & Vogel, 1986, p. 188). Man kann also davon ausgehen, dass die Grenzen von IPhs zuverlässig markiert sind und Kleinkinder diese Hinweisreize zu deren Wahrnehmung nutzen. Ein weiterer Hinweis ist die Dauer einer Pause, die systematisch mit der Art der Grenze korreliert an der sie vorkommt (z.B., Butcher, 1981, fürs Deutsche). Es finden sich kaum oder gar keine Pausen zwischen Wörtern, etwas längere Pausen an Phrasengrenzen, noch längere Pausen an Clausegrenzen und die längsten Pausen an Satzgrenzen. Das legt die Existenz einer Natürlichen Pausenhierarchie nahe, die die prosodische Hierarchie (Nespor & Vogel, 1986) auf der Seite des Sprachsignals ergänzt. Diese prosodischen Hierarchien korrespondieren mit der syntaktischen Hierarchie einer Sprache. In der vorliegenden Studie werden fünf Experimente präsentiert, die mittels der Headturn Preference Methode (Hirsh-Pasek, Kemler Nelson, Jusczyk, Cassidy, Druss & Kennedy, 1987) durchgeführt wurden. Die Fragestellung war, ob Deutsch lernende 6 und 8 Monate alte Kinder Pausen nutzen, um Clauses im Sprachstrom zu erkennen und ob sie bereits sensitiv für die natürliche Pausenhierarchie sind. Vorläuferstudien (Hirsh-Pasek et al., 1987; Nazzi, Kemler Nelson, Jusczyk & Jusczyk, 2000) haben gezeigt, dass bereits 6 Monate alte Englisch lernende Kinder Clauses in der Sprache erkennen. Erstmals haben Seidl und Mitarbeiterinnen (Seidl, 2007; Johnson & Seidl, 2008; Seidl & Cristià, 2008) den Status der Pause in diesem Zusammenhang näher untersucht. Keine der genannten Studien hat jedoch die Sensitivität von Kindern gegenüber der natürlichen Pausenhierarchie und besonders die Sensitivität gegenüber der Korrelation von Pausendauer und Clause-, bzw. Satzgrenzen erforscht. Um dieser Frage nachzugehen, wurde in der vorliegenden Studie ein hoch kontrolliertes Stimulusmaterial verwendet: Sätze die aus zwei IPhs bestehen, welche jeweils einem syntaktischen Clause entsprechen. In den ersten drei Experimenten wurden Pausen zum einen an den Clause- und den Satzgrenzen und zum anderen innerhalb der ersten Clauses und an den Satzgrenzen eingefügt. Die Dauer der Pausen variierte zwischen den Experimenten. Die Ergebnisse zeigen, dass 6 Monate alte Kinder in der Lage sind, Clauses in gesprochener Sprache zu erkennen, aber nur ein einer Bedingung, in der die eingefügten Pausen eine Dauer hatten, die mit der natürlichen Sprache übereinstimmte. In den Experimenten 4 und 5 wurde explizit getestet, inwieweit die Kinder sensitiv gegenüber der natürlichen Pausenhierarchie sind. Dafür wurden Pausen nur noch an den Clause- und den Satzgrenzen eingefügt, die jeweilige Dauer der Pausen entsprach dabei einmal der Pausenhierarchie, zum anderen widersprachen sie ihr. Die Ergebnisse der beiden Experimente zeigen, dass 8 Monate alte Kinder, nicht jedoch 6 Monate alte Kinder, sensitiv für die Verbindung von Pausendauer und der jeweiligen prosodisch/syntaktischen Grenze sind. Die Ergebnisse der Dissertation zeigen erstmals, dass Kinder Pausen nicht nur nutzen, um Clauses in gesprochener Sprache zu erkennen, sondern dass sie auch sensitiv gegenüber Pausendauer und Pausenverteilung in ihrer Muttersprache sind und damit gegenüber der Natürlichen Pausenhierarchie.

Die Zielstellung einer nachhaltigen Entwicklung erfordert die Berücksichtigung verschiedener Besonderheiten bei der Entscheidungsfindung. Eine wesentliche Anforderung ist hierbei die Integration mehrerer Ziele bzw. Entscheidungskriterien. Für die Unterstützung komplexer Entscheidungen stehen verschiedene Verfahren zur Unterstützung der Entscheidungen zur Verfügung. Diese Verfahren weisen verschiedene Vorgehensweisen und Ziele auf. Durch die systematische Aufspaltung und Strukturierung multikriterieller Bewertungsvorgänge hinsichtlich der Zielmenge wird erreicht · die Reduzierung der Bewertungskomplexität, · Nachvollziehbarkeit der einzelnen Ansatz- und Bewertungsschritte sowie · die Offenlegung der berücksichtigten Ziele und Handlungsalternativen. Das Verständnis einer Realwissenschaft zur Problemlösungsunterstützung erfordert vor der Notwendigkeit der Umsetzung einer nachhaltigen Entwicklung, der Komplexität der Vorgehensweise, teilweise fehlendem Wissen über kausale Zusammenhänge und Synergien, Unsicherheit und Prognoseungenauigkeiten sowie praktischen Anforderungen der Durchführung einen Kompromiß zwischen wissenschaftlicher Exaktheit und praktischer Anwendbarkeit. Die Qualität der verfügbaren Daten rechtfertigt oftmals nicht die Anwendung exakter, allerdings auch aufwendiger mathematischer Verfahren. Diese führen zudem zu einer Komplexität, die das Verständnis erschwert und die Anforderungen an ein Modell konterkariert.