Cyanobakterien zŠhlen zu den Šltesten Lebewesen auf der Erde. Diese Bakterien, auch Blaualgen genannt, trugen wesentlich zur Sauerstoffanreicherung der Erde bei, da sie eine ausgeprŠgte FŠhigkeit zur Photosynthese besitzen. Der produzerte Sauerstoff der Photosynthese hemmt jedoch eine weitere AktivitŠt von Cyanobakterien, die Stickstofffixierung. Um die Hemmung zu vermeiden, werden diese AktivitŠten zeitlich getrennt und optimal dem tŠglichen Hell-Dunkel-Rhythmus angepasst. Ein evolutionŠrer Vorteil wird erzielt, wenn der Organismus diesen Rhythmus antizipiert und sich darauf vorbereitet. Aus diesem Grund haben Cyanobakterien eine innere Uhr entwickelt, deren Rhythmus zirkadian ist, ãzirka diemÒ bedeutet ãungefŠhr ein TagÒ. Cyanobakterien der Spezies Synechococcus elongatus PCC 7942 haben sich als Modellorganismus etabliert, weil in ihnen die ersten bakteriellen zirkadianen Oszillationen auf molekularer Ebene entdeckt worden sind. Ihre zirkadiane Uhr entspringt dreier, auf der DNS beieinanderliegenden, Gene (kaiA, kaiB, kaiC) und ihrer dazugehšrigen Proteine. Phosphorylierte KaiC-Proteine Ÿben eine RŸckkopplung auf die Transkription von kaiB und kaiC aus, wodurch die AktivitŠt des kaiBC-Promotors zirkadian oszilliert. Eines der wichtigsten Experimente der letzten Jahre hat gezeigt, dass dieser Transkriptions-Translations-Oszillator mit einem weiteren Oszillator gekoppelt ist, der nicht von Transkription und Translation abhŠngt. Das Experiment des Kondo Labors rekonstruiert zirkadiane Oszillationen mit nur drei Proteinen KaiA, KaiB, KaiC und ATP. Die Proteine bilden Komplexe verschiedener Stoichiometrie, die durchschnittliche Phosphorylierung des Proteins KaiC zeigt stabile Oszillationen mit einer zirkadianen Periode. Da ein Entfernen von einem der Proteine zum Verlust der Oszillationen fŸhrt, wird dieser Post-Translations-Oszillator auch als Kernoszillator bezeichnet. Der Phosphorylierungszyklus von KaiC wird bestimmt durch fortlaufende Phosphorylierung und Dephosphorylierung an zwei Positionen des Proteins, den AminosŠuren Serin 431 und Threonin 432. Die Phase des Kernoszillators kann an der Verteilung der vier PhosphorylierungszustŠnde (nicht-, serin-, threonin- und doppeltphosphoryliert) abgelesen werden. KaiC wechselwirkt mit KaiA und KaiB, damit verschieden phosphorylierte KaiC synchronisieren und die Uhr Ÿber mehrere Tage konstante Oszillationen zeigt. Die Details dieser Wechselwirkung sind jedoch unbekannt. In dieser Dissertation erstelle ich ein mathematisches Modell des Kernoszillators und simuliere die vorliegenden Experimente des O''Shea Labors. Die Simulation reproduziert den KaiC Phosphorylierungszyklus der Uhr quantitativ. Um die wichtigsten experimentellen Nebenbedingungen zu erfŸllen, muss das theoretische Modell zwei molekulare Eigenschaften von KaiC berŸcksichtigen, wodurch ich wichtige Vorhersagen treffe. Die erste Nebenbedingung ist durch die Robustheit des Systems gegeben. Die KaiC-Phosphorylierung Šndert sich nicht, wenn die Gesamtkonzentrationen der drei Proteine in gleicher Weise variiert werden. Um diese Bedingung zu erfŸllen, muss das Modell zwei verschiedenartige Komplexe von KaiA und KaiC berŸcksichtigen. ZusŠtzlich zu einem KaiAC Komplex, der die Autophosphorylierung von KaiC unterstŸtzt, muss KaiC den grš§ten Teil von KaiA unabhŠngig vom Phosphorylierungszustand sequestrieren. Diese zweite Bindestelle ist meine erste theoretische Vorhersage. Die zweite Nebenbedingung ist durch das Ÿbergangsverhalten nach Hinzugabe von KaiB gegeben. KaiB induziert eine Dephosphorylierung von KaiC, die abhŠngig vom Phosphorylierungsniveau ist. Ein Umschalten zwischen phosphoylierendem und dephosphorylierendem KaiC ist deshalb nur in bestimmten Zeitfenstern mšglich. Um die gemessenen Zeitfenster in der Simulation zu reproduzieren, postuliere ich im Modell, dass sechsfach Serin phosphorylierte KaiBC Komplexe KaiA inaktivieren. Diese hochgradig nichtlineare RŸckkopplung ist meine zweite theoretische Vorhersage. Die beiden Vorhersagen werden anschlie§end experimentell ŸberprŸft. HierfŸr werden aufgereinigte Kai-Proteine mit ATP gemischt. Proben an ausgewŠhlten Zeitpunkten werden mit der nativen Massenspektrometrie untersucht. Diese ist eine neuartige Methode, die es erlaubt, intakte Proteinkomplexe zu untersuchen. Die Spektren bestŠtigen sowohl die zweite KaiAC-Bindestelle als auch die nichtlineare RŸckkopplung. Das mathematische Modell erlaubt es au§erdem, die drei definierenden Prinzipien von zirkadianen Uhren fŸr den Kernoszillator zu erklŠren. Erstens sichern konstante Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungsraten von KaiC und ein pŸnktliches Umschalten zwischen beiden Phasen den Freilauf des Oszillators. Dieser Freilauf bewirkt, dass die zirkadiane Uhr auch unter konstanten Bedingungen, vor allem gleichbleibenden LichtverhŠltnissen, weiterlaufen kann. Zweitens muss die Periodendauer des Oszillators zu unterschiedlichen Šu§eren Bedingungen erhalten bleiben (Temperaturkompensation). Diese Bedingung wird realisiert, indem temperaturabhŠngige Dissoziationskonstanten von KaiAC und KaiBC Komplexen Phasenverschiebungen erzeugen, die sich gegenseitig kompensieren. Drittens muss die Phase des Oszillators sich dem Tagesrhythmus anpassen kšnnen. Diese Anpassung folgt aus einem Šu§eren Warm-Kalt-Rhythmus, der die drei temperaturabhŠngigen Phasenverschiebungen nur zum Teil einschaltet und damit die Kompensation verhindert. Eine in silico Evolutionsanalyse zeigt, dass eine zweite phosphorylierbare AminosŠure einen evolutionŠren Vorteil bringt und die Verteilung der PhosphorylierungszustŠnde optimiert ist, um eindeutig die Zeit zu bestimmen. Das Ergebnis weist darauf hin, dass diese Verteilung die physiologisch wichtige Ausgangsgrš§e der Uhr ist und die vier PhosphroylierungszustŠnde die Funktionen der zirkadianen Uhr von Cyanobakterien sichern. / Biological activities in cyanobacteria are coordinated by an internal clock. The rhythm of the cyanobacterium Synechococcus elongatus PCC 7942 originates from the kai gene cluster and its corresponding proteins. In a test tube, the proteins KaiA, KaiB and KaiC form complexes of various stoichiometry and the average phosphorylation level of KaiC exhibits robust circadian oscillations in the presence of ATP. The characteristic cycle of individual KaiC proteins is determined by phosphorylation of serine 431 and threonine 432. Differently phosphorylated KaiC synchronize due to an interaction with KaiA and KaiB. However, the details of this interaction are unknown. Here, I quantitatively investigate the experimentally observed characteristic phosphorylation cycle of the KaiABC clockwork using mathematical modeling. I thereby predict the binding properties of KaiA to both KaiC and KaiBC complexes by analyzing the two most important experimental constraints for the model. In order to reproduce the KaiB-induced dephosphorylation of KaiC a highly non-linear feedback loop has been identified. This feedback originates from KaiBC complexes, which are exclusively phosphorylated at the serine residue. The observed robustness of the KaiC phosphorylation level to concerted changes of the total protein concentrations demands an inclusion of two KaiC binding sites to KaiA in the mathematical model. Besides the formation of KaiAC complexes enhancing the autophosphorylation activity of KaiC, the model accounts for a KaiC binding site, which constantly sequestrates a large fraction of free KaiA. These theoretical predictions have been confirmed by the novel method of native mass spectrometry, which was applied in collaboration with the Heck laboratory. The mathematical model elucidates the mechanism by which the circadian clock satisfies three defining principles. First, the highly non-linear feedback loop assures a rapid and punctual switch to dephosphorylation which is essential for a precise period of approximately 24 h (free-running rhythm). Second, the dissociation of the protein complexes increases with increasing temperatures. These perturbations induce opposing phase shifts, which exactly compensate during one period (temperature compensation). Third, a shifted external rhythm of low and high temperature affects only a part of the three compensating phase perturbations, which leads to phase shifts (phase entrainment). An in silico evolution analysis shows that the existing second phosphorylatable residue of KaiC is not necessary for the existence of sustained oscillations but provides an evolutionary benefit. The analysis demonstrates that the distribution of four phosphorylated states of KaiC is optimized in order for the organism to uniquely distinguish between dusk and dawn. Consequently, this thesis emphasizes the importance of the four phosphorylated states of KaiC, which assure the outstanding performance of the core oscillator.

Ce travail de thèse repose sur le développement de méthodes en spectrométrie de masse native et mobilité ionique pour la caractérisation structurale de protéines d’intérêt thérapeutique et de complexes multiprotéiques. L’optimisation fine et conséquente de la préparation d’échantillon et des conditions analytiques ont permis la caractérisation de protéines membranaires solubilisées en milieu détergent, protéines hydrophobes habituellement réfractaires à l’analyse par MS. D’autre part, une nouvelle approche de mobilité ionique appelée Collision Induced Unfolding a été évaluée et mise en place au laboratoire. Elle a permis une caractérisation conformationnelle approfondie et originale de plusieurs formats d’anticorps monoclonaux thérapeutiques. Enfin, les techniques de MS native et de mobilité ionique ont été utilisées pour caractériser des complexes multiprotéiques d’hétérogénéité variable mettant ainsi en lumière leurs avantages et les progrès réalisés dans le domaine de la MS structurale. / This PhD work focuses on developments in native mass spectrometry and ion mobility methods for the structural characterization of therapeutic proteins and multiprotein complexes. First, careful optimizations of sample preparation and analytical conditions allowed the characterization of membrane proteins, which are hydrophobic proteins difficult to analyze by MS approaches in detergent environment. Then, a new ion mobility-based activation approach called Collision Induced Unfolding has been set up and evaluated. CIU allowed extensive and original conformational characterization of several therapeutic monoclonal antibody formats. Finally, native MS and ion mobility techniques were used for the characterization of heterogeneous multiprotein complexes depicting their benefit when combined to other biophysical techniques for the structural characterization of multiprotein complexes.

Ce travail de thèse porte sur le développement de méthodes de spectrométrie de masse (MS) structurale pour la caractérisation de systèmes protéiques complexes, souvent réfractaires aux approches biophysiques classiques. Dans ce contexte, les développements entrepris furent notamment focalisés sur la caractérisation de complexes impliqués dans la biogénèse des ribosomes et dans la régulation transcriptionnelle, fonctions cellulaires essentielles pouvant être liées à de nombreuses pathologies humaines dont certains cancers. Ainsi, les approches par MS native, pontage chimique et d’HDX-MS ont permis de renseigner sur la connectivité, les proximités spatiales ou encore la dynamique conformationnelle retrouvées au sein des complexes étudiés. Parmi ces techniques, l’HDX-MS permet une approche comparative basée sur les mesures d’incorporations en deutérium renseignant sur la dynamique conformationnelle d’une protéine sous différents états. Aussi, la combinaison d’approches de MS structurale a permis d’approfondir la caractérisation des systèmes complexes étudiés, démontrant ainsi l’intérêt d’une approche intégrative dans ce contexte. / This PhD thesis focuses on developing methods in structural mass spectrometry (MS) to characterize complex protein systems, given their size and their heterogeneity, frequently inaccessible by classical biophysic approaches. In this context, methodological developments have particularly focused on the characterization of protein complexes involved in ribosomes biogenesis and transcriptional regulation. These fundamental cellular processes are related to numerous diseases such as cancers and genetic diseases. Thus native MS, crosslink, and hydrogen/deuterium exchange coupled to MS (HDX-MS) allowed gaining insights about the stoechiometry, spatial proximities and conformational dynamics of studied systems. Among these approaches, HDX-MS enables a comparative approach based on deuterium incorporation measurements giving information about the conformational dynamics of labeled proteins in various experimental conditions. Finally, the combination of structural approaches enables to deeply characterize complex protein systems, highlighting the advantages of an integrative approach in this context.