L’invasion métastatique des tumeurs humaines est un mécanisme complexe qui repose sur l’acquisition de nouvelles fonctionnalités par les cellules tumorales. Les protéines ADAM et plus particulièrement la protéine ADAM9, grâce à leur domaine extracellulaire se composant d’une activité métalloprotéasique et disintégrine, possèdent des fonctions importantes et nécessaires au processus d’invasion. Cependant, les mécanismes de régulation de la protéine restent globalement méconnus dans la pathologie cancéreuse. L’objectif de ce travail a consisté à évaluer le rôle de l’expression d’ADAM9 dans les mécanismes d’agressivité tumorale tels que l’adhérence cellulaire, la migration cellulaire ou l’angiogénèse ainsi que l’étude des mécanismes de régulation de l’expression de cette protéine. Compte tenu du fait que le peroxyde d’hydrogène est connu pour induire l’expression d’ADAM9, les premiers travaux ont eu pour objectif d’établir le lien entre stress oxydant, ADAM9 et adhérence tumorale. L’exposition des cellules d’adénocarcinome pulmonaire au peroxyde d’hydrogène induit une augmentation dose dépendante de l’expression de la protéine ADAM9 transmembranaire et de sa forme sécrétée. Les études in vitro ont permis d’établir que les capacités d’adhérence et d’invasion tumorale induites par le stress oxydant sont principalement médiées par les deux isoformes de la protéine ADAM9. Par ailleurs, l’expression d’ADAM9 provoque un accroissement de la néo-angiogénèse par l’intermédiaire d’un accroissement non transcriptionel de la biosynthèse d’IL8. Cette cytokine proangiogénique va interagir avec le récepteur CXCR2 et va permettre la mise en place d’une néovascularisation in vitro. Le développement d’un modèle de xénogreffe de cellule d’adénocarcinome pulmonaire a permis de confirmer le rôle majeur d’ADAM9 dans les processus de dissémination métastatique et d’angiogénèse tumoraux. L’étude de la modulation pharmacologique d’ADAM9 a reposé sur deux stratégies pharmacologiques différentes : d’une part l’interaction directe avec les différentes isoformes d’ADAM9 au moyen d’un anticorps neutralisant et d’autre part une action sur les mécanismes de transduction cellulaire tels que la protéine SRC ou la protéine kinase C. Ce travail a permis de mieux comprendre l’implication de la protéine ADAM9 au cours du processus de cancérogenèse de part sa participation aux étapes majeures que sont la dissémination métastatique induite par le stress oxydant et l’angiogenèse / Tumor invasion is a complex mechanism that is based on the acquisition of tumor cells new functions. ADAM proteins, especially protein ADAM9, through their extracellular domain consisting of a disintegrin and metalloprotease activity, have important functions and processes necessary for invasion. However, the mechanisms regulating protein remain largely unknown in cancer pathology. The objective of this work was to evaluate the role of ADAM9 expression in tumor aggressiveness such as cell adhesion, cell migration and angiogenesis and to study the mechanisms regulating this protein expression. Given the fact that hydrogen peroxide is known to induce the expression of ADAM9 protein, the first work aimed to establish the relationship between oxidative stress, adhesion and tumor ADAM9 expression. Hydrogen peroxide induces a dose-dependent increase of both expression and activity of ADAM9 on adenocarcinoma pulmonary cells. Oxidative stress induced ADAM9 expression and activity are mainly supported by the secreted form of ADAM9 protein. In vitro studies have shown that capacity of adhesiveness and invasiveness induced by oxidative stress are mainly mediated by the two forms of ADAM9 protein. In addition, ADAM9 protein expression induces neoangiogenesis through increased production of interleukin 8. This proangiogenic cytokine that interacts with the CXCR2 receptor is able to stimulate neovascularization in vitro studies. Development of a lung adenocarcinoma xenograft model confirmed that ADAM9 protein have an important role on metastasis process and tumor angiogenesis. The study of pharmacological modulation of ADAM9 expression was based on two different pharmacological strategies: the first interacts with different isoforms of ADAM9 using a neutralizing antibody and the second strategy modulate cell transduction mechanism such as SRC protein or protein kinase C (PKC). This work aims to understand the involvement of ADAM9 protein during the process of carcinogenesis, such as tumor invasion induced by oxidative stress and neoangiogenesis

Optical imaging methods incorporating observation of the mucosal surface of organs with narrowband filtered light are diagnostic tools with a significant development in recent years and have become an integral and inseparable part of the diagnostic process of benign and malignant pathologies of the mucosal surface of various anatomical systems of the human body. Malignant and premalignant lesions of the upper aero-digestive tract (UADT) are no exception. The present work demonstrates the benefits of evaluation of changes in microvascular architecture by narrowband imaging. Its major advantage is a more accurate diagnosis of premalignant and malignant mucosal pathologies in the head and neck region based on the identification of significant changes in superficial vascularity. There is a very strong correlation of these vascular changes with the final histopathological analysis. The present data have shown that videoendoscopic examination with narrowband imaging significantly improves the distinction between benign and malignant mucosal lesions even in the UADT pathologies with a similar tendency to neoangiogenesis (squamous cell papilloma vs. squamous cell carcinoma). It also refines the determination of surface extension of tumoral changes and helps to localize and accurately diagnose tumors of...

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La néoangiogenèse tumorale est un élément pronostique de l’évolution de nombreux cancers. L’intégrine alphaVbeta3 ainsi que la métalloprotéase matricielle 9 (MMP-9), sont des marqueurs de ce processus. Leur ciblage offre la perspective d’une information diagnostique pour la détection précoce, l’évaluation de l’agressivité de pathologies et la sélection de patients répondeurs aux nouvelles thérapies anti-angiogéniques. Dans ce contexte, notre travail s’attèle à mettre au point les techniques nécessaires à la caractérisation de radiotraceurs. Des modèles de tumeurs richement néovascularisées ont été sélectionnés : le mélanome malin et le gliome malin. Nous nous sommes dans un premier temps intéressés à la détection de l’intégrine alphaVbeta3. Un traceur technétié, le 99mTc-DTPA-bis-c(RGDfK) a servi de support à la validation de nos techniques d’analyse. Cette méthodologie d’évaluation a ensuite été adaptée à des projets collaboratifs. L’étude du 18F-ribofuranose-RGD est réalisée avec le Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (INSERM UMR 1037) et l’Institut des Sciences Moléculaires (CNRS UMR 5255). Un radioligand de la MMP-9, l’111In- DOTA-F3B, fait l’objet d’un partenariat avec l’ARNA (ARN : Régulations Naturelle et Artificielle, INSERM UMR 869) et l’Institut Lumière Matière (CNRS UMR 5306). Le composé technétié a démontré une bonne affinité et spécificité pour alphaVbeta3. In vivo, chez l’animal, les radioligands technétiés et fluorés ont permis l’identification de tumeurs alphaVbeta3 positives. L’111In-DOTA-F3B a, quant à lui, permis la visualisation de tumeurs chez l’animal et sur coupes tissulaires. Ces traceurs constituent une piste intéressante pour l’imagerie de la néoangiogenèse tumorale. / Tumor neoangiogenesis is a predictive element of the evolution of numerous cancers. AlphaVbeta3 integrin and matrix metalloprotease 9 (MMP-9) are markers of tumor neoangiogenesis. Their targeting appears of great interest either for early detection, aggressiveness staging of the disease or for selection of responders to new-targeted therapies. In this context, our objective is to develop methodologies needed for radiotracers characterization. Tracers have been investigated in different tumor models for which vascularization is very important: melanoma and glioma. First of all 99mTc-DTPA-bis-c(RGDfK) has been assessed in our laboratory and helped us to develop analytical methods. These methodologies were used in different partnership, the evaluation of 18F-ribofuranose-RGD targeting alphaVbeta3 with INSERM UMR 1037 and CNRS UMR 5255, and 111In-DOTA-F3B for molecular imaging of MMP-9 with INSERM UMR 869 and CNRS UMR 5306.The technetium peptide has demonstrated good affinity and specificity for alphaVbeta3. In vivo analysis in mice showed that both tracers were able to identify some alphaVbeta3-positive tumors. 111In-DOTA-F3B allowed us to detect hMMP-9 positive tumors in mice and in tumor tissue sections. In conclusion, these tracers still require to be investigated but represent promising tracers for tumor neoangiogenesis.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.

Die rheumatoide Arthritis ist eine chronisch-entzündliche Bindegewebserkrankung mit symmetrischem Befall der Gelenke. Die genaue Ätiologie ist bisher unbekannt. Aktivierte synoviale Fibroblasten sollen durch gesteigerte Adhäsion und Produktion von proinflammatorischen Zytokinen und Matrix-lysierenden Proteasen maßgeblich an der Gelenkdestruktion beteiligt sein. Ziel dieser Arbeit war es, ein neues in-vivo-Knorpeldestruktions-Modell zu etablieren, in welchem unter immunkompetenten Bedingungen, die Invasion und Destruktion von Gelenkknorpel durch die Fibroblasten-Zelllinie LS48 über einen längeren Zeitraum simuliert werden kann. Die am Institut für klinische Immunologie der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig etablierte Zelllinie LS48 wurde in die ipsilateralen Kniegelenke von BALB/c-Mäusen injiziert. Die dadurch induzierte Gewebsdestruktion wurde über zehn Wochen in zweiwöchigem Abstand histopathologisch beurteilt und klassifiziert. Als vergleichende Fibroblasten-Zelllinie wurden nicht-invasive NIH/3T3-Zellen eingesetzt. An Hand der Score-Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion wurde eine mäßige bis schwer-wiegende Gewebsdestruktion durch die LS48-Zellen bereits ab der zweiten Untersuchungswoche lichtmikroskopisch nachgewiesen, ohne dass dabei pathologische Effekte in den kontralateralen Kniegelenken aufgetreten sind. Polarisationsmikroskopisch wurden für den Parameter Knorpeldestruktion vergleichbare Ergebnisse erzielt. Damit wurde gezeigt, dass das Modell BALB/c LS48 ein erfolgversprechendes Instrument darstellt, das zur Testung neuer therapeutischer Strategien gegen die Gelenkdestruktion verwendet werden kann. Inwieweit die Auseinandersetzung der LS48-Zellen mit dem spezifischen Immunsystem der BALB/c-Maus Auswirkungen auf den Verlauf der Gewebsdestruktion hat, sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden.:Bibliographische Zusammenfassung II Inhaltsverzeichnis III Abkürzungsverzeichnis IV 1 Einleitung 1 1.1 Rheumatische Erkrankungen 1 1.2 Die rheumatoide Arthritis 2 1.2.1 Immunologische Grundlagen der rheumatoiden Arthritis 2 1.2.1.1 Hypothese der Fibroblasten-Abhängigkeit 3 1.2.1.2 Hypothese der T-Zell-Abhängigkeit 4 1.3 Allgemeine Anatomie und Histologie des Kniegelenks 6 1.4 Die Histopathologie der rheumatoiden Arthritis 9 1.4.1 Verschiedene Synovialmembrantypen bei rheumatoider Arthritis 10 1.5 Tiermodelle zur Untersuchung der rheumatoiden Arthritis 11 1.5.1 Das Tiermodell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 12 1.6 Histopathologische Score-Systeme der rheumatoiden Arthritis in Tiermodellen 13 1.7 Ziel 13 1.7.1 Fragestellungen 14 2 Material und Methoden 16 2.1 Zelllinien und Versuchstiere 16 2.1.1 Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3 16 2.1.2 Die Fibroblasten-Zelllinie LS48 16 2.1.3 Die BALB/c-Maus 17 2.2 Tierversuchsplan 18 2.3 Zellkultur 19 2.3.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 19 2.3.2 Reagenzien 20 2.3.3 Durchführung 21 2.4 Isolation der murinen Kniegelenke 22 2.5 Histologische Aufarbeitung 23 2.5.1 Geräte und Verbrauchsmaterialien 23 2.5.2 Reagenzien 24 2.5.3 Entkalkung, Entwässerung, Einbettung und Schneiden der Präparate 26 2.5.4 Azanfärbung nach Heidenhain (Kernechtrubin-Anillinblau-Orange G-Färbung) 27 2.6 Klassifikation mit dem Durchlichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.7 Klassifikation mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (Balb/c-LS48) 29 2.8 Statistik 30 3 Ergebnisse 31 3.1 Score-Erhebung mit dem Lichtmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 31 3.1.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Zellinvasion 32 3.1.2 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Pannusformation 35 3.1.3 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 38 3.2 Datenanalyse der lichtmikroskopisch untersuchten Parameter Zellinvasion, Pannusformation und Knorpeldestruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 41 3.2.1 Zellinvasion 41 3.2.2 Pannusformation 45 3.2.3 Knorpeldestruktion 48 3.2.4 Gesamtscore 51 3.3 Score-Erhebung mit dem Polarisationsmikroskop für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 56 3.3.1 Bewertungsmodus für den Score-Parameter Knorpeldestruktion 56 3.4 Datenanalyse des polarisationsmikroskopisch untersuchten Parameters Knorpel-destruktion für das Modell der Fibroblasten-induzierten Knorpeldestruktion (BALB/c-LS48) 59 3.5 Statistischer Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Analysemethoden für den Parameter Knorpeldestruktion 62 3.6 Statistischer Vergleich der medialen und lateralen histologischen Sagittalschnitte der Kniegelenke 63 4 Diskussion 64 4.1 Die Bedeutung der histopathologischen Score-Parameter für das Modell der Fibroblasten-induzierten Gelenkdestruktion in der BALB/c-Maus 65 4.1.1 Der Score-Parameter Zellinvasion 65 4.1.1.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Zellinvasion 67 4.1.1.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Zellinvasion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 69 4.1.2 Der Score-Parameter Pannusformation 70 4.1.2.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Pannusformation 71 4.1.2.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Pannusformation für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 73 4.1.3 Der Score-Parameter Knorpeldestruktion 74 4.1.3.1 Die pathophysiologische Bedeutung des Score-Parameters Knorpeldestruktion 75 4.1.3.2 Interpretation der lichtmikroskopischen Befunde des Score-Parameters Knorpeldestruktion für die Zelllinie LS48 im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 76 4.1.4 Interpretation des lichtmikroskopisch erhobenen Gesamtscores für das Knorpeldestruktionsmodell (BALB/c-LS48) im ipsilateralen Kniegelenk im Verlauf von zehn Wochen 78 4.1.4.1 Verlaufsvergleich zu anderen Tiermodellen 81 4.2 Die histopathologischen Auswirkungen der Zelllinien LS48 und NIH/3T3 im ipsilateralen Kniegelenk der BALB/c-Maus im Vergleich 83 4.3 Vergleich der medialen und lateralen Sagittalebenen der histologischen Präparate der Kniegelenke 85 4.4 Beurteilung histopathologischer Veränderungen in den kontralateralen Kniegelenken im Verlauf von zehn Wochen 86 4.5 Vergleich der licht- und polarisationsmikroskopischen Untersuchungsergebnisse 87 4.6 Schlussfolgerungen und Ausblick 89 Zusammenfassung 94 Literaturverzeichnis 99 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 116 Eigenständigkeitserklärung VIII Danksagung IX