Angiogeneseinhibitoren haben innerhalb weniger Jahre die Medizin revolutioniert. Auf dem Gebiet der Augenheilkunde ist es v.a. das Bevacizumab (Avastin ®), welches bei verschiedenen Krankheitsbildern eingesetzt wird, um den Verlust an Sehschärfe zu bekämpfen, der u.a. durch eine Vergrößerung der Netzhautdicke zustande kommt. Diese Arbeit untersucht die Veränderungen von Visus und Netzhautdicke (Makulaödem) an Patienten mit diabetischer Retinopathie (DR) und retinalem Venenverschluss (RVO). Verschiedene Studien zeigen, dass nicht alle Patienten von dieser neuen Therapieform profitieren. Mit dem Ziel herauszufinden, welche Patienten auf die Bevacizumabbehandlung ansprechen, werden Einflussfaktoren analysiert, die mit einer Visusverbesserung und einer Verringerung der Netzhautdicke in Verbindung gebracht werden können. Zu diesen Einflussfaktoren zählen: der Untersuchungszeitpunkt, die Art und Ausprägung der Erkrankung und der Visus vor einer Behandlung. Ein zusätzlich untersuchter Einflussfaktor bei Patienten mit RVO ist die Verschlussdauer. Die Arbeit weist nach, dass sowohl Patienten mit DR als auch Patienten mit RVO auf die Behandlung ansprechen. Subgruppenanalysen können diese Ergebnisse auch für die Entitäten nicht proliferative DR (NPDR), Astvenen- (BRVO) und Zentralvenenverschluss (CRVO) belegen. Die Analyse der Einflussfaktoren zeigt, dass Patienten mit einer geringen Sehschärfe vor der Behandlung größere Verbesserungen der Sehschärfe nach der Behandlung aufweisen als Patienten mit initial guter Sehschärfe. Die Verschlussdauer hingegen erweist sich nur bedingt als signifikanter Einflussfaktor auf die Bevacizumabtherapie. Die Ergebnise dieser Arbeit können eine Entscheidungshilfe für den Einsatz der Bevacizumabbehandlung bei Patienten mit DR und RVO darstellen.

Die diabetische Retinopathie (DR) gilt als häufigste chronische mikrovaskuläre Komplikation bei Diabetes mellitus sowie als häufigste Erblindungsursache bei Erwachsenen im Arbeitsalter in Industrieländern. Die diabetische Stoffwechsellage führt langfristig zu Schädigungen des Gefäßendothels, was den Zusammenbruch der Blut-Retina-Schranke verursachen kann. Die Entwicklung eines diabetischen Makulaödems mit Ablagerung von harten Exsudaten steht ebenfalls in engem Zusammenhang mit Sehverlusten. Die wichtigsten Risikofaktoren der DR sind eine Hyperglykämie sowie systemische Hypertonie. Hauptursache für die diabetische Degeneration der Retina ist die Aktivierung des Polyolwegs, der bei erhöhter Glukose-Konzentration vermehrt abläuft. Im ersten Schritt entsteht durch die Aktivität der Aldosereduktase (AR) aus Glukose Sorbitol, das bei diabetischer Stoffwechsellage akkumuliert und toxisch auf die Retinazellen wirkt. Im zweiten Schritt des Polyolwegs wird durch die Sorbitoldehydrogenase Sorbitol in Fruktose umgewandelt. Durch diätetische Kochsalz (NaCl)-Aufnahme erhöht sich die extrazelluläre Osmolarität und bewirkt dadurch akute Blutdruck-Erhöhungen. Bluthochdruck führt über erhöhten Blutfluss und Endothelzellschäden zur Progression der DR. Als Therapie sind derzeit Anti-VEGF-Medikamente, Laserphotokoagulation und intravitreal applizierte Kortikosteroide bekannt. Das retinale Pigmentepithel (RPE) bildet die äußere Blut-Retina-Schranke (BRS) und hat vielfältige Funktionen für das Sehen. Es absorbiert Licht, phagozytiert Außensegmente der Fotorezeptoren, transportiert Nährstoffe und Ionen, trägt zur Ionenhomöostase und pH-Regulation bei, wandelt all-trans-Retinal für den Sehzyklus um und sezerniert verschiedene Signalmoleküle. Die Ruptur der BRS, die bei der DR beobachtet wird, kann zu erhöhter lokaler extrazellulärer Osmolarität durch Metabolit- und Ioneneinstrom und damit hyperosmolaren Stress im RPE führen. Die Plasmaosmolarität hängt vor allem vom NaCl-Spiegel im Blut ab. Reguliert wird die hohe extrazelluläre Ionenkonzentration durch organische Osmolyte, die den intrazellulären osmotischen Druck erhöhen. Dies führt zu einer Kompensation des osmotischen Gradienten über der Zellmembran und somit zu einer Stabilisierung des Zellvolumens. Unter anderem wird vermehrt Sorbitol produziert, welches in den RPE-Zellen akkumuliert. Durch Aktivierung des Polyolwegs kann es dadurch bei der DR zu Zellschädigungen kommen. Hyperosmolarer Stress verändert außerdem den transepithelialen Widerstand, das Netzhautpotenzial, die RPE-Zellzahl sowie die Proliferation und Zellzyklusphasen. Durch hohe NaCl-Spiegel werden vermehrt angiogene Wachstumsfaktoren exprimiert, die zu chorioidalen Neovaskularisationen beitragen. Schließlich kann der erhöhte osmotische Druck in der Retina zu einer exsudativen Netzhautablösung und zu retinalen Ödemen führen, wodurch das Sehen stark beeinträchtigt wird. NFAT5 ist der hauptsächliche Transkriptionsfaktor, der die Genexpression in Reaktion auf hyperosmotischen Stress reguliert. NFAT5 wird unter hypertonen Bedingungen aktiviert und führt zu einer gesteigerten AR-Expression, wodurch die Sorbitol-Produktion stimuliert wird. Es gibt Hinweise, dass eine erhöhte extrazelluläre Osmolarität über eine Aktivierung von NFAT5 die Pathogenese der DR fördert. Deshalb befasst sich diese Arbeit mit der Untersuchung der Wirkung hoher extrazellulärer NaCl-Konzentrationen auf die Gen- und Proteinexpression der Sorbitolproduzierenden und -umwandelnden Enzyme, Aldosereduktase und Sorbitol-dehydrogenase (SDH), sowie mit der Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 bei kultivierten humanen RPE-Zellen. Es ergaben sich folgende Ziele: • Regulation der Expression von AR und SDH unter verschiedenen pathogenen Bedingungen wie Hyperglykämie, Hypoxie, oxidativer Stress, extrazelluläre Hyperosmolarität • Funktion intra-und extrazellulärer Signalwege und Transkriptionsfaktoren bei der AR- und SDH-Genexpression unter hyperosmolaren bzw. hypoxischen Bedingungen • Rolle der AR- und NFAT5-Aktivitäten für die Vitalität und das Proliferationsverhalten der RPE-Zellen unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen Zur Bestimmung der Genexpression der Enzyme wurden PCR-Experimente durchgeführt. Die AR-Genexpression in RPE-Zellen wurde durch hohe extrazelluläre Glukose (25 mM), CoCl2-induzierte chemische Hypoxie (150 μM), H2O2-induzierten oxidativen Stress (20 μM) und NaCl- oder Sucrose-induzierte extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Durch die gleichzeitige Stimulation mit NaCl und CoCl2 wurde die AR-Genexpression additiv erhöht, was dafür spricht, dass (teilweise) verschiedene intrazelluläre Signalwege die Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen vermitteln. Extrazelluläre Hyperosmolarität, aber nicht Hypoxie, erhöhte außerdem die AR-Proteinmenge, die mittels Western-Blot-Analyse bestimmt wurde. Um zu ermitteln, welche Signalwege und Transkriptionsfaktoren die Expressionen von AR und SDH vermitteln, wurden jeweils spezifische Inhibitoren eingesetzt. Dabei wurde festgestellt, dass unter Kontroll- und hyperosmolaren Bedingungen die JNK-Aktivität die AR-Expression erhöht, was auf eine hemmende Funktion des Signalwegs hindeutet. Die Hemmung der p38-MAPK, ERK1/2 und PI3K-Signalwege reduzierten die Expression des AR-Gens bei extrazellulärer Hyperosmolarität und Hypoxie, was nahelegt, dass diese Signalwege die AR-Genexpression verstärken. Zudem ist die JNK-Aktivität unter hypoxischen Bedingungen an der Vermittlung der NaCl-induzierten AR-Genexpression beteiligt. Es ist bekannt, dass extrazelluläre Hyperosmolarität die Sekretion von angiogenen Wachstumsfaktoren wie VEGF, bFGF und TGFβ aus RPE-Zellen induziert. Deshalb wurde untersucht, ob eine Aktivierung von Rezeptoren für diese Wachstumsfaktoren für die NaCl-induzierte AR-Genexpression in RPE-Zellen notwendig ist. Die Hemmung des VEGF-Rezeptors 2 erhöhte unter Kontrollbedingungen die AR-Genexpression. Dies deutet daraufhin, dass RPE-Zellen unter Kontrollbedingungen kontinuiertlich VEGF freisetzen. Unter hyperosmolaren Bedingungen wurde die Expression des AR-Gens durch einen Hemmer von Rezeptoren für TGFβ1 sowie einen Hemmer von MMPs vermindert. Die AR-mRNA wurde durch die Hemmung des VEGF Rezeptor-2 und der FGF-Rezeptortyrosinkinase vermehrt exprimiert. Dies deutet auf eine negative Regulation der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen durch auto- bzw. parakrine Aktivierung von VEGF- und FGF-Rezeptoren hin. Unter hypoxischen Bedingungen vermitteln die PDGF- und EGF-Rezeptortyrosinkinasen und die Kinaserezeptoren für TGFβ1 die AR-Genexpression. Für die Rolle von Transkriptionsfaktoren an der Regulation der AR wurde gezeigt, dass NFκB unter Kontrollbedingungen die AR-Expression hemmt. Unter hypoxischen Bedingungen konnte eine Rolle von HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der AR-Genexpression nachgewiesen werden. Die verwendeten Transkriptionsfaktorhemmer hatten unter hyperosmolaren Bedingungen keinen Effekt auf die AR-Expression. Für die Untersuchung der NFAT5-Aktivität wurde der Transkriptionsfaktor mit Hilfe einer siRNA ausgeschaltet. Die Transfektion mit der NFAT5-siRNA reduzierte unter hyperosmolaren sowie hypoxischen Bedingungen die NFAT5-Expression in den RPE-Zellen um etwa 60 %. Diese verringerte NFAT5-Aktivität bewirkte eine Reduktion der AR-Expression unter hyperosmolaren Bedingungen, aber nicht unter Hypoxie. Die AR-Genexpression scheint spezifisch unter hyperosmolaren Bedingungen durch NFAT5 reguliert zu werden. Um zu untersuchen, wie sich die NFAT5- bzw. die AR-Aktivität auf das Überleben und die Proliferation von RPE-Zellen auswirkt, wurde NFAT5 mittels siRNA ausgeschaltet und die AR-Aktivität mit dem spezifischen Inhibitor EBPC gehemmt. Die Herunterregulation der NFAT5-Expression oder die Inhibition der AR-Aktivität verminderte die Zellvitalität unter hyperosmolaren, aber nicht unter hypoxischen Bedingungen und verstärkte die hyperosmolare Hemmung der Zellproliferation. Dies deutet darauf hin, dass eine Herunterregulation der NFAT5-Expression den Zellzyklusarrest unter hyperosmolaren Bedingungen verstärkt, während die Aktivität der AR protektiv auf die Zellen wirkt. Die SDH-Genexpression wurde durch Hypoxie und oxidativen Stress, nicht aber durch extrazelluläre Hyperosmolarität erhöht. Hyperosmolarität und Hypoxie veränderten die SDH-Proteinmenge in den Zellen nicht. Unter Kontrollbedingungen verringerte die Aktivität der JNK die SDH-Genexpression. Der PI3-Akt-Signalweg ist für die Vermittlung der Hypoxie-induzierten SDH-Genexpression von Bedeutung. Außerdem verringerte das entzündungshemmende Glukokortikoid Triamcinolon die hypoxische Expression des SDH-Gens. Weiterhin wurde eine erhöhte SDH-Genexpression durch den VEGF-Rezeptor-2-Hemmer unter Kontrollbedingungen nachgewiesen, was auf einen hemmenden Effekt der VEGF-Rezeptoraktivierung hindeutet. Die SDH-Expression wurde durch die Inhibitoren der PDGF- bzw. EGF-Rezeptortyrosinkinasen unter Hypoxie reduziert, was eine Funktion dieser Rezeptoren an der Induktion der SDH-Expression unter diesen Bedingungen nahelegt. Der Transkriptionsfaktor NFκB hemmte unter Kontrollbedingungen die SDH-Expression, während die Transkriptionsfaktoren HIF-1 und STAT3 bei der Erhöhung der SDH-Expression unter hypoxischen Bedingungen eine Rolle spielen.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit / Aus den Ergebnissen kann geschlussfolgert werden, dass Sorbitol in RPE-Zellen unter hyperosmolaren Bedingungen akkumuliert, während es unter hypoxischen Bedingungen oder bei oxidativem Stress zu keiner Sorbitolakkumulation kommt. Man kann annehmen, dass die NFAT5- und AR-vermittelte Sorbitolakkumulation die RPE-Zellen unter osmotischem Stress schützt, weil es die intrazelluläre Osmolarität erhöht. Es sollten zukünftig weitere Untersuchungen zur Vitalität der Zellen bei AR-Hemmung unter verschiedenen pathogenen Bedingungen durchgeführt werden. Derzeit befinden sich eine Vielzahl vielversprechender neuer Therapiemöglichkeiten der DR in der Entwicklung, die auf biochemische Signalwege abzielen, die mikrovaskulären Schaden verursachen. Wichtig ist zudem die weitere klinische Forschung, um die Rolle dieser neuen Therapien bei der Behandlung der DR zu ermitteln.:Abkürzungsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1.1 Die diabetische Retinopathie (DR) 1.1.1 Epidemiologie und Relevanz 1.1.2 Pathogenese, Klinik und Stadien 1.1.3 Systemische Risikofaktoren 1.1.3.1 Hyperglykämie 1.1.3.2 Bluthochdruck 1.1.4 Prävention 1.1.5 Therapie 1.2 Das retinale Pigmentepithel (RPE) 1.3 Epithel-Veränderungen durch hyperosmolaren Stress im Rahmen der DR 1.4 Rolle des Transkriptionsfaktors NFAT5 2 AUFGABENSTELLUNG 3 MATERIAL UND METHODEN 3.1 Materialien 3.1.1 Chemikalien 3.1.2 Geräte und sonstige Materialien 3.1.3 Kits 3.1.4 Substanzen zur Zellstimulation 3.1.5 Antikörper 3.1.6 Primer 3.2 Zellbiologische Methoden 3.2.1 Zellkultivierung 3.2.2 Vitalitätsbestimmung mittels Trypanblau-Methode 3.2.3 Bestimmung der Proliferationsraten 3.3 Molekularbiologische Methoden 3.3.1 RNA-Präparation und DNAse-Behandlung 3.3.2 RNA-Quantifizierung 3.3.3 Reverse Transkription (cDNA-Synthese) 3.3.4 Real-Time Polymerase-Chain-Reaction (RT-PCR) 3.3.5 Bestimmung der PCR-Effizienz 3.3.6 Agarose-Gelelektrophorese 3.3.7 siRNA-Transfektion 3.4 Immunologische Methoden 3.4.1 Western Blot 3.4.1.1 Proteinextraktion und quantitative Bestimmung der Proteine nach Bradford 3.4.1.2 SDS-PAGE 3.4.1.3 Western Blot 3.5 Statistische Auswertung 4 ERGEBNISSE 4.1 Regulation der Aldosereduktase (AR)- und Sorbitoldehydrogenase (SDH)-Gen- und Proteinexpression 4.1.1 AR-Genexpression unter hyperosmolaren und hypoxischen Bedingungen 4.1.1.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.1.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.1.3 Rolle der Transkriptionsfaktor-Aktivität 4.1.1.4 Rolle von AR- und NFAT5-Aktivität bei der Zellvitalität und -proliferation 4.1.2 SDH-Genexpression unter hypoxischen Bedingungen 4.1.2.1 Beteiligung intrazellulärer Signalwege 4.1.2.2 Beteiligung extrazellulärer Signalwege 4.1.2.3 Rolle von Transkriptionsfaktor-Aktivitäten 5 DISKUSSION 5.1 Wirkung pathologischer Bedingungen auf die Genexpression von AR und SDH 5.1.1 Aldosereduktase 5.1.2 Sorbitoldehydrogenase 5.2 Intrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.3 Extrazelluläre Signalwege regulieren die AR-Genexpression 5.4 Transkriptionsfaktoren regulieren die AR-Genexpression 5.5 Einfluss von AR- und NFAT5-Aktivität auf die Zellvitalität und -proliferation 5.6 Hypoxie-induzierte SDH-Genexpression 5.7 Diskussion der Methodik 5.8 Klinische Relevanz der gewonnenen Ergebnisse 5.9 Aktueller Forschungsstand der Therapie mit AR-Inhibitoren 5.10 Zusammenfassende Darstellung der Regulation der Polyolweg-Enzyme und Ausblick 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 ANLAGEN 8.1 Tabellenverzeichnis 8.2 Abbildungsverzeichnis 8.3 Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit

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Purpose: Facing the lack of time, busy retina consultants should be aware of how the patients would prefer that time is spent and whether they wish the specialist to talk more at the expense of other medical activities. Methods: 810 persons with diabetes were asked to divide the time of 10 min between examination, consultation and treatment when envisioning a real-life scenario of diabetic retinopathy (NCT02311504). Results: With the increasing duration of diabetes, patients wanted significantly more time for diagnostics (p = 0.028), while age was found to be associated with less time for treatment (p = 0.009). Female subjects tended to prefer only little more time for talking (p = 0.051) in comparison with males, who slightly favored therapy (p = 0.025). Conclusions: The large majority recognized the need for diagnostics in their allocation of time. If individual patients are confronted with the health care perspective of time constraints, this might improve the understanding of prioritization.

Angiogeneseinhibitoren haben innerhalb weniger Jahre die Medizin revolutioniert. Auf dem Gebiet der Augenheilkunde ist es v.a. das Bevacizumab (Avastin ®), welches bei verschiedenen Krankheitsbildern eingesetzt wird, um den Verlust an Sehschärfe zu bekämpfen, der u.a. durch eine Vergrößerung der Netzhautdicke zustande kommt. Diese Arbeit untersucht die Veränderungen von Visus und Netzhautdicke (Makulaödem) an Patienten mit diabetischer Retinopathie (DR) und retinalem Venenverschluss (RVO). Verschiedene Studien zeigen, dass nicht alle Patienten von dieser neuen Therapieform profitieren. Mit dem Ziel herauszufinden, welche Patienten auf die Bevacizumabbehandlung ansprechen, werden Einflussfaktoren analysiert, die mit einer Visusverbesserung und einer Verringerung der Netzhautdicke in Verbindung gebracht werden können. Zu diesen Einflussfaktoren zählen: der Untersuchungszeitpunkt, die Art und Ausprägung der Erkrankung und der Visus vor einer Behandlung. Ein zusätzlich untersuchter Einflussfaktor bei Patienten mit RVO ist die Verschlussdauer. Die Arbeit weist nach, dass sowohl Patienten mit DR als auch Patienten mit RVO auf die Behandlung ansprechen. Subgruppenanalysen können diese Ergebnisse auch für die Entitäten nicht proliferative DR (NPDR), Astvenen- (BRVO) und Zentralvenenverschluss (CRVO) belegen. Die Analyse der Einflussfaktoren zeigt, dass Patienten mit einer geringen Sehschärfe vor der Behandlung größere Verbesserungen der Sehschärfe nach der Behandlung aufweisen als Patienten mit initial guter Sehschärfe. Die Verschlussdauer hingegen erweist sich nur bedingt als signifikanter Einflussfaktor auf die Bevacizumabtherapie. Die Ergebnise dieser Arbeit können eine Entscheidungshilfe für den Einsatz der Bevacizumabbehandlung bei Patienten mit DR und RVO darstellen.

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