Au cours de la différenciation neuronale, les gènes proneuraux induisent l'expression de nombreux gènes appartenant à différentes familles. Deux de ces familles constituent l'intérêt de cette étude à savoir les facteurs de transcription à doigts à zinc Myt/NZF et IA1/INSM1. Chez le xénope, il a été démontré que XMyT1 coopère avec les facteurs bHLH afin d'induire la neurogenèse de manière insensible à la voie de signalisation Delta/Notch (Bellefroid et al., 1996). Son mode d'action n'est pas connu et nécessite d'être approfondi afin de mieux comprendre son rôle au cours de la neurogenèse. Lors d'expériences utilisant un gène rapporteur, la protéine XMyT1 a été décrite comme activateur de la transcription tandis que la protéine orthologue NZF3 chez le rat se comporte comme répresseur de la transcription (Yee et al., 1998). Récemment, il a été rapporté que les protéines NZF1 et NZF2 chez la souris interagissent avec le corépresseur Sin3 (Romm et al., 2005). Néanmoins aucunes données n'existent concernant l'interaction entre Myt/NZF et d'autres co-facteurs. Suite à la recherche de partenaires protéiques en utilisant la technique du double hybride en levures, nous avons identifié le corépresseur XCtBP. Nous avons confirmé in vivo et in vitro que XMyT1 interagit avec XCtBP. Cette interaction est propre à la région centrale de XMyT1 et trois motifs de recrutement de CtBP ont été identifiés dans celle-ci à savoir PGDLS, PENLS et TLDLS. Le motif de liaison TLDLS constitue un site dégénéré non décrit dans la littérature. Ce motif est conservé évolutivement parmi les trois membres NZF1, NZF2 et NZF3. Aussi, le motif TLDLS présente le plus d'affinité pour XCtBP. Les parties N-terminale, C-terminale et centrale de XMyT1 se comportent comme répresseur de la transcription et la région centrale continue de réprimer la transcription même lorsqu'elle n'est plus capable de recruter XCtBP. Cette activité est antagoniste à celle exercée par la protéine sauvage XMyT1. En effet, dans des expériences de gain de fonction, nous avons montré que XMyT1 induit l'expression des gènes XIA1, XPak3 et elrC. Nous avons montré que leur expression est induite de manière ectopique lorsque XMyT1 et XAsh3 sont surexprimés en même temps. Nous avons montré en embryons de xénope que XIA1 est exprimé dans les neurones primaires à partir du stade neurula précoce et qu'il a un profil d'expression similaire à XMyT1. Nos résultats ont permis de mettre en lumière une fonction biologique de l'interaction entre XMyT1 et XCtBP. Le recrutement de XCtBP réduit l'activation de l'expression de XIA exercée par la protéine XMyT1 seule ou combinée à XAsh3 et ce aux stades précoces de la différenciation neuronale. Ainsi, XCtBP jouerait un rôle dans la régulation transcriptionnelle de XMyT1 durant la neurogenèse. Cette étude suggère que XMyT1 pourrait également interagir avec des co-activateurs pour contrebalancer l'effet des co-répresseurs étant donné que la protéine sauvage a été décrite, à ce jour, aussi bien dans des expériences in vivo qu'in vitro, comme activatrice de la transcription.

Au cours de la différenciation neuronale, les gènes proneuraux induisent l'expression de nombreux gènes appartenant à différentes familles. Deux de ces familles constituent l'intérêt de cette étude à savoir les facteurs de transcription à doigts à zinc Myt/NZF et IA1/INSM1. Chez le xénope, il a été démontré que XMyT1 coopère avec les facteurs bHLH afin d'induire la neurogenèse de manière insensible à la voie de signalisation Delta/Notch (Bellefroid et al. 1996). Son mode d'action n'est pas connu et nécessite d'être approfondi afin de mieux comprendre son rôle au cours de la neurogenèse. Lors d'expériences utilisant un gène rapporteur, la protéine XMyT1 a été décrite comme activateur de la transcription tandis que la protéine orthologue NZF3 chez le rat se comporte comme répresseur de la transcription (Yee et al. 1998). Récemment, il a été rapporté que les protéines NZF1 et NZF2 chez la souris interagissent avec le corépresseur Sin3& / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’identification de biomarqueurs des maladies mentales telles que l’autisme, la schizophrénie ou la maladie d’Alzheimer, est d’une importance capitale non seulement pour établir un diagnostic objectif, mais aussi pour suivre l’effet des traitements. La création et le maintien de fonctions neuronales sub-cellulaires, telle que la plasticité synaptique, sont fortement dépendants du transport intraneuronal, essentiel pour acheminer d’importants composants à des positions spécifiques. Un transport actif défaillant semble être partiellement responsable d’anomalies de la plasticité synaptique et de la morphologie neuronale présentes dans de nombreuses maladies neuropsychiatriques. Cette thèse décrit (i) la mise au point d’une méthode de quantification du transport intraneuronal reposant sur le suivi de nanoparticules de diamants fluorescents (fNDs); (ii) l’application de cette technique simple et faiblement invasive à l’analyse fonctionnelle de variants génétiques associés à des maladies neuropsychiatriques. Ce manuscrit comporte quatre chapitres. Le premier détaille l’architecture polygénique complexe des maladies mentales et démontre la pertinence d’étudier le transport intraneuronal. Les deuxième et troisième chapitres sont dédiés à la méthode et détaillent les stratégies d’internalisation des fNDs, les outils de quantification du transport intraneuronal et la validation de la technique. La forte brillance, la photo-stabilité parfaite et l’absence de toxicité cellulaire font des fNDs un outil de choix pour étudier la dynamique du transport intraneuronal sur une durée d’observation de plusieurs heures avec une haute résolution spatiotemporelle et une bonne puissance statistique. Enfin, dans le quatrième chapitre, nous appliquons cette nouvelle méthode d’analyse fonctionnelle pour étudier l’effet de variants génétiques associés à l’autisme et à la schizophrénie. Pour cela, nous utilisons des lignées de souris transgéniques ayant une faible surexpression des gènes MARK1 et SLC25A12, ainsi que des AAV-shRNA pour induire une haplo-insuffisance du gène AUTS2. Notre méthode de diagnostic moléculaire s’avère suffisamment sensible pour déceler des variations fines de la dynamique du transport intraneuronal, ouvrant la voie à de futurs développements en nanomédecine translationnelle. / The identification of molecular biomarkers of brain diseases as diverse as autism, schizophrenia and Alzheimer’s disease, is of crucial importance not only for an objective diagnosis but also to monitor response to treatments. The establishment and maintenance of sub-cellular neuronal functions, such as synaptic plasticity, are highly dependent on intracellular transport, which is essential to deliver important materials to specific locations. Abnormalities in such active transport are thought to be partly responsible for synaptic plasticity and neuronal morphology impairment found in many neuropsychiatric and neurodegenerative diseases. This thesis reports (i) the development of a quantification technic of intraneuronal transport based on fluorescent nanodiamonds (fNDs) tracking; (ii) the application of this simple and minimally invasive approach to the functional analysis of neuropsychiatric disease-related genetic variants.This manuscript falls into four chapters. The first one details the complex polygenic architecture of mental disorders and demonstrates the disease relevance of monitoring the intraneuronal transport. The second and the third chapters are dedicated to the nanodiamond-tracking assay and describe the fNDs internalisation strategies, the spatiotemporal quantitative readouts and the validation of the technic. The high brightness, the perfect photostability and the absence of cytotoxicity make fNDs a tool of choice to perform high throughput long-term bioimaging at high spatiotemporal resolution. Finally, in the fourth chapter, we apply this new functional analysis method to study the effect of genetic variants associated to autism and schizophrenia. We established transgenic mouse lines in which MARK1 and SLC25A12 genes were slightly overexpressed, and AAV-shRNA to induce AUTS2 gene haploinsufficiency. Our molecular diagnosis assay proves sufficiently sensitive to detect fine changes in intraneuronal transport dynamic, paving the way for future development in translational nanomedicine.

Le but des recherches du laboratoire de génétique du développement est de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui contrôlent le développement neural des vertébrés. C’est la raison pour la quelle, j’ai identifié deux EST (BC071005 et BC077938) spécifiques de l’expression génique chez le Xenopus laevis. Sur base de la littérature, ces deux gènes présentent des profils d’expression intéressants, caractéristiques des gènes impliqués dans la neurogenèse.<p><p>Le premier clone d’ADNc code pour l’homologue du facteur de transcription Homez, contenant trois homéodomaines et deux motifs leucine zipper et dont la fonction est inconnue. Mes résultats ont montré que chez l’embryon de xénope au stade neurula, Homez est exprimé préférentiellement dans la plaque neurale, l’expression la plus forte étant détectée dans les domaines où les neurones primaires apparaissent. Plus tard, Homez est détecté dans le tube neural dans des cellules neurales postmitotiques en cours de différenciation. En accord avec ce profil d’expression, j’ai observé que Homez est régulé positivement par l’atténuation des signaux BMPs et par le facteur proneural Ngnr1 et négativement par la voie Notch. Bien que le facteur Homez ne soit pas suffisant pour induire une expression ectopique de marqueurs neuronaux dans l’embryon de xénope, j’ai pu montrer, en utilisant une approche de morpholino antisens, que celui-ci est requis en aval du facteur Ngnr1 pour la différenciation des précurseurs neuraux en neurones primaires. <p><p>Le deuxième clone code pour l’homologue du facteur CBFβ qui s’associe avec une famille de protéines CBFα1-3/Aml1-3/Runx1-3 pour former un complexe hétérodimérique liant l’ADN. Alors que chez la souris, les facteurs Runx1 et Runx3 jouent un rôle important dans la neurogenèse dans les ganglions spinaux et que chez le xénope, Runx1 est requis pour la formation des neurones Rohon-Beard, le rôle de CBFβ au cours du développement du système nerveux est actuellement mal connu. Mes résultats ont montré que chez l’embryon de xénope au stade neurula, CBFβ est coexprimé avec les facteurs Runx1-3 en bordure de la plaque neurale, mais de manière plus étendue et plus précoce. Comme attendu pour un marqueur de la bordure de la plaque neurale, j’ai observé que l’expression de CBFβ est régulée par les signaux BMP, Wnt, FGF et Notch. De manière intéressante, son expression est induite par les facteurs proneuraux alors que celle de Runx1 est inhibée. Des expériences de perte de fonction à l’aide de morpholinos antisens bloquant la traduction de CBFβ ont été réalisées. Ces expériences suggèrent que le facteur CBFβ est nécessaire à la mise en place de la CN et à la différenciation des neurones de Rohon-Beard. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished