La thérapie génique sans transfert de gène utilisant les endonucléases de restriction spécifiques est une des approches thérapeutiques qui visent à la mise au point d’un traitement curatif de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Afin de corriger le gène de la dystrophine avec les nucléases à doigt de zinc (ZFNs) en ciblant l’exon 50, nous avons produit les protéines ZFNs dans les bactéries et les avons purifiées. Les résultats obtenus après les essais in vitro montrent que les ZFNs produites reconnaissent d’une manière spécifique la séquence cible située au niveau de l’exon 50 du gène DYS et peuvent y générer d’une manière précise les coupures double-brin. Ils montrent également que les protéines ZFNs produites peuvent être transfectées, avec ou sans agent de transfection, dans les myoblastes des patients dystrophiques Duchenne en culture. / Gene therapy without gene transfer using specific restriction endonucleases is a therapeutic approaches aimed at the development of a cure for Duchenne muscular dystrophy (DMD). To correct the dystrophin gene with zinc finger nucleases (ZFNs) targeting exon 50of DYS gene, we produced ZFNs proteins in bacteria and purified them. The results obtained after in vitro assays show that ZFNs produced specifically recognize a target sequence located in exon 50 of the gene DYS and can be generated in a precise manner the double strand breaks. They also show that ZFNs produced proteins can be transduced with or without agent transduction, in cultured myoblasts of patients’ Duchenne dystrophy.

Au cours de la différenciation neuronale, les gènes proneuraux induisent l'expression de nombreux gènes appartenant à différentes familles. Deux de ces familles constituent l'intérêt de cette étude à savoir les facteurs de transcription à doigts à zinc Myt/NZF et IA1/INSM1. Chez le xénope, il a été démontré que XMyT1 coopère avec les facteurs bHLH afin d'induire la neurogenèse de manière insensible à la voie de signalisation Delta/Notch (Bellefroid et al., 1996). Son mode d'action n'est pas connu et nécessite d'être approfondi afin de mieux comprendre son rôle au cours de la neurogenèse. Lors d'expériences utilisant un gène rapporteur, la protéine XMyT1 a été décrite comme activateur de la transcription tandis que la protéine orthologue NZF3 chez le rat se comporte comme répresseur de la transcription (Yee et al., 1998). Récemment, il a été rapporté que les protéines NZF1 et NZF2 chez la souris interagissent avec le corépresseur Sin3 (Romm et al., 2005). Néanmoins aucunes données n'existent concernant l'interaction entre Myt/NZF et d'autres co-facteurs. Suite à la recherche de partenaires protéiques en utilisant la technique du double hybride en levures, nous avons identifié le corépresseur XCtBP. Nous avons confirmé in vivo et in vitro que XMyT1 interagit avec XCtBP. Cette interaction est propre à la région centrale de XMyT1 et trois motifs de recrutement de CtBP ont été identifiés dans celle-ci à savoir PGDLS, PENLS et TLDLS. Le motif de liaison TLDLS constitue un site dégénéré non décrit dans la littérature. Ce motif est conservé évolutivement parmi les trois membres NZF1, NZF2 et NZF3. Aussi, le motif TLDLS présente le plus d'affinité pour XCtBP. Les parties N-terminale, C-terminale et centrale de XMyT1 se comportent comme répresseur de la transcription et la région centrale continue de réprimer la transcription même lorsqu'elle n'est plus capable de recruter XCtBP. Cette activité est antagoniste à celle exercée par la protéine sauvage XMyT1. En effet, dans des expériences de gain de fonction, nous avons montré que XMyT1 induit l'expression des gènes XIA1, XPak3 et elrC. Nous avons montré que leur expression est induite de manière ectopique lorsque XMyT1 et XAsh3 sont surexprimés en même temps. Nous avons montré en embryons de xénope que XIA1 est exprimé dans les neurones primaires à partir du stade neurula précoce et qu'il a un profil d'expression similaire à XMyT1. Nos résultats ont permis de mettre en lumière une fonction biologique de l'interaction entre XMyT1 et XCtBP. Le recrutement de XCtBP réduit l'activation de l'expression de XIA exercée par la protéine XMyT1 seule ou combinée à XAsh3 et ce aux stades précoces de la différenciation neuronale. Ainsi, XCtBP jouerait un rôle dans la régulation transcriptionnelle de XMyT1 durant la neurogenèse. Cette étude suggère que XMyT1 pourrait également interagir avec des co-activateurs pour contrebalancer l'effet des co-répresseurs étant donné que la protéine sauvage a été décrite, à ce jour, aussi bien dans des expériences in vivo qu'in vitro, comme activatrice de la transcription.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les membres de la famille des GAT A sont des facteurs de transcription à doigt de zinc exprimés dans une grande variété de tissus. Les facteurs GAT A jouent des rôles essentiels dans l 'hématopoïèse, le développement cardiaque et la formation de l'endoderme et des gonades. La régulation de ces divers processus biologiques par les facteurs GA T A dans différents tissus, incluant le testicule, ne peut se faire sans l'aide d' autres partenaires. Mes travaux de thèse avaient donc pour but d' étudier l'expression et l' implication de partenaires transcriptionnels qui pourraient moduler l'activité des facteurs GA TA et conséquemment l'expression de gènes testiculaires. Des analyses de types hybridation in situ et d'immunohistochimie ont permis de mettre en évidence la présence du messager et de la protéine des cofacteurs Friend of GAT A (FOG) 1 et FOG2 tout au long du développement testiculaire .. Des transfections transitoires in vitro ont ensuite permis de constater que l'interaction physique entre les protéines FOG et les facteurs de transcription GA TA résulte en une inhibition de l'activité de promoteurs testiculaires régulés par les facteurs GA TA. Ainsi, les partenaires FOG seraient des répresseurs de l'activité des facteurs GA TA dans le testicule. Un nouveau partenaire pour les facteurs GATA, le récepteur nucléaire LRH-I/NR5A2, a aussi été identifié. J' ai montré qu'il interagit directement avec les facteurs GAT A4 et GAT A6 et que cette interaction se traduit par une synergie transcriptionnelle sur les gènes lnha et Cyp19al codant pour la sous-unité a de l'inhibine et l'enzyme stéroïdogénique aromatase respectivement. Les modifications posttraductionnelles sont d'autres moyens utilisés par la cellule pour moduler l'activité d'un facteur de transcription sur un gène. Notre laboratoire a montré que la phosphorylation du facteur GAT A4 par la protéine kinase A (PKA), en réponse à l' activation de la voie de signalisation de l' AMPc, augmente son activité transcriptionnelle sur le promoteur Star. Mes travaux ont révélé que la phosphorylation de GAT A4 et GATA6 par PKA permet aussi une stimulation accrue des promoteurs lnha et Cyp19al. 111 En somme, la présence des partenaires FOG 1, FOG2 et LRHl/NR5A2 dans le testicule de même que des modifications posttraductionnelles de type phosphorylation modulent le potentiel de transactivation des facteurs GA TA sur des promoteurs testiculaires. Ceci suggère que les facteurs de transcription GATA et leurs partenaires sont d'importants régulateurs du développement et de la fonction testiculaire.

D'après notre stratégie de clonage, nous avons obtenu des protéines recombinantes dérivées de la PARP-1 correspondantes au premier doigt de Zn (Znl), au deuxième doigt de Zn (Zn2), au troisième doigt de Zn (Zn3), au domaine DB-WRG-CAT et au domaine WRG-CAT. Pour démontrer que Znl et Zn2 interagissent avec l'ADN simple brin nous avons utilisé des essais de retard sur gel (EMSA). Nos résultats suggèrent que Znl et Zn2 ont la capacité de se lier à l'ADN simple brin avec une haute préférence pour poly (dA), poly (T) et poly (dC). Parmi les sondes d'ADN simple brin, Zn3 a montré une affinité pour poly(T), poly(dG) et poly(dC). Remarquablement, Zn3 a montré une forte Uaison aux sondes d'ARN. Ce résultat nous pennet de suggérer un rôle de Zn3 dans le processus de transcription. L'enzyme pourrait être en contact avec des hybrides ARN-ADN lors de ce processus. Cependant le rôle précis de Zn3 reste encore à établir. Les doigts de Znl, Zn2 et Zn3 ainsi que le fragment WGR-CAT n'ont montré aucune affinité pour l'ADN double brin. Par ailleurs, nous avons clone une région de 60 acides aminés situés entre le domaine BRCT et le domaine WRG de la protéine PARP-1; nous l'avons baptisée région DB. Le fragment DB-WRG-CAT a montré une forte affinité par l'ADN double brin. Ce résultat suggère que la région DB est responsable de l'interaction de la protéine PARP-1 avec l'ADN double brin. Pour déterminer si la PARP-1 se lie à une structure de l'ADN simple brin et double brin, et pour démontrer si cette interaction est capable d'activer l'enzyme, nous avons construit différentes structures d'ADN qui comportent une boucle d'adénine ou de thymidine. Nos résultats suggèrent que l'ADN qui comporte une jonction entre simple et double brin agit comme un activateur potentiel de la PARP-1. Finalement, nous proposons un modèle qui pennet de comprendre l'interaction de la PARP-1 avec l'ADN qui est retrouvé dans plusieurs processus biologiques.

La PARP-1 est une enzyme modulaire très conservée, dont la structure comprend: 1) un domaine amino-terminal de liaison à l'ADN (DBD), contenant un signal de localisation nucléaire et trois doigts de zinc Znl, Zn2 et le Zn3 récemment découverts, ces trois doigts agissent comme détecteur moléculaire de cassures dans l'ADN; 2) un domaine régulateur central contenant un motif BRCT et des sites accepteurs de poly (ADP-ribose) permettant d'inactiver la PARP-1 (réaction d'automodification) ; et 3) un domaine carboxy-terminal catalytique renfermant le site actif. Dans notre étude, après avoir clone différentes protéines recombinantes par PCR, nous avons fait des essais de poly (ADP) ribosylation sur des extraits crus des cellules. En outre, nous avons fait des essais de retardement sur gel (EMSA) avec des oligonucleotides pour évaluer les interactions des peptides, correspondants aux fragments du domaine DBD, avec ces oligonucleotides afin d'essayer d'expliquer le mode d'activation de l'enzyme.

Miz-1 est un facteur de transcription qui active la transcription de gènes cytostatiques tels que p15[indice supérieur 1NK4B] ou p21[indice supérieur CIP1]. Il s’agit d’une protéine de la famille BTB/POZ, qui possède un ensemble de 13 doigts de zinc de type Cys?His? dans sa portion C-terminale. L’activation de ces gènes par Miz-1 peut être régulée par les protéines SMAD. SMAD3 et 4 peuvent toutes deux se lier aux doigts de zinc 1 à 4 de Miz-1, et les autres doigts de zinc sont pressentis pour être responsables de la liaison à l’ADN. Les séquences reconnues par Miz-1 sur les promoteurs des deux gènes mentionnés ci-haut ont été identifiées, mais n’ont pas d’homologie entre elles. L’oncogène c-Myc a la possibilité de se lier à Miz-1, et cette interaction cause la répression des gènes normalement activés par Miz-1, favorisant ainsi la prolifération cellulaire. Cette interaction cruciale, de même que celle entre Miz-1 et l'ADN, est toutefois assez mal caractérisée. Le but du projet dont fait partie ce mémoire est d’éclaircir tout ce mécanisme de liaison. Ce mémoire étudie la structure et les propriétés dynamiques des doigts de zinc 5 à 8 de Miz-1, qui, selon l’hypothèse initiale, seraient impliqués dans la liaison au promoteur des gènes-cibles de Miz-1. La résonance magnétique nucléaire est la technique qui a été utilisée dans le but d’obtenir ces résultats, et une partie importante de ce mémoire est dévouée à la théorie derrière cette puissante technique. La détermination de la structure de ces doigts de zinc est en fait une seule des nombreuses étapes du projet de l’élucidation du mécanisme de transrépression par c-Myc/Miz-1. Suite à la présentation des structures de ces doigts de zinc, ce mémoire s’intéresse à leurs caractéristiques dynamiques très particulières pour ce type de domaine protéique. Nous avons en effet découvert que les doigts de zinc 5 à 8 présentaient un niveau très élevé d’échange conformationnel, et qu’une portion du doigt de zinc 6 ne peut être caractérisée structurellement à cause de mouvements dans l’échelle de la micro/milliseconde, eux-mêmes dus à des répulsions électrostatiques. En conclusion, nous proposons que le ZF 6 ait un rôle de charnière entre deux ensembles de ZFs dans Miz-1. Ces résultats permettent l’actualisation du modèle de liaison de Miz-1 au promoteur de p15[indice supérieur INK4B] qui avait été élaboré comme hypothèse, et ils nous rapprochent de la compréhension de la transrépression par c-Myc. [symboles non conformes]

Au cours de la différenciation neuronale, les gènes proneuraux induisent l'expression de nombreux gènes appartenant à différentes familles. Deux de ces familles constituent l'intérêt de cette étude à savoir les facteurs de transcription à doigts à zinc Myt/NZF et IA1/INSM1. Chez le xénope, il a été démontré que XMyT1 coopère avec les facteurs bHLH afin d'induire la neurogenèse de manière insensible à la voie de signalisation Delta/Notch (Bellefroid et al. 1996). Son mode d'action n'est pas connu et nécessite d'être approfondi afin de mieux comprendre son rôle au cours de la neurogenèse. Lors d'expériences utilisant un gène rapporteur, la protéine XMyT1 a été décrite comme activateur de la transcription tandis que la protéine orthologue NZF3 chez le rat se comporte comme répresseur de la transcription (Yee et al. 1998). Récemment, il a été rapporté que les protéines NZF1 et NZF2 chez la souris interagissent avec le corépresseur Sin3& / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Très répandues dans le monde vivant, les protéines à doigt de zinc constituent une super-famille dont les membres possèdent un site à zinc de formule générale [ZnII(Cys)4-X(His)X] (x=0, 1 or 2). Tandis que la majorité de ces sites joue un rôle purement structural, certains présentent une fonction réactive, comme la détection de stress oxydant par exemple. En effet, les sites doigt de zinc de Hsp33 et de RsrA ont été décrits comme des interrupteurs rédox[1,2] : transmettant l'information « stress oxydant » sous forme d'un signal structural, via l'oxydation/réduction des cystéines coordonnées au zinc, détruisant/reformant le domaine doigt de zinc. Cependant, certains aspects de l'étape d'oxydation restent mal compris.Étant donné le grand nombre des protéines à doigt de zinc et leurs rôles clés, il est de tout intérêt d'identifier les facteurs contrôlant leur réactivité afin de comprendre pourquoi certaines espèces réactives de l'oxygène (ERO) sont capable d'oxyder des doigts de zinc in vivo, contrairement à H2O2. Durant ce projet, nous avons décidé de nous focaliser sur deux ERO très puissantes et jouant un rôle important en biologie : l'acide hypochloreux (HOCl) et l'oxygène singulet (1O2). Nous étudierons la réactivité des doigts de zinc vis-à-vis de ces deux oxydant en utilisant des modèles peptidiques, reproduisant parfaitement la structure de doigts de zinc courants. / Widely spread in the living world, zinc finger proteins constitute a large superfamily, with a zinc site of general formula [ZnII(Cys)4-X(His)X] (x=0, 1 or 2) as a common feature. Whereas the majority of such sites plays a purely structural role, a few of them exhibit a reactive function (e.g. oxidative stress detection). Indeed, zinc finger sites of Hsp33 and RsrA have been shown to act as redox switches[1,2]: transmitting the information “oxidative stress” as a structural signal, by means of oxidation/reduction of its ZnII-coordinating cysteines. However, the precise mechanism of the oxidation step remains poorly understood.Given the occurrence of zinc finger proteins and their key roles, it is of high biological interest to identify factors controlling their reactivity and to understand why some ROS are able to oxidize them in vivo, on the contrary to H2O2. In this project, we decided to focus on two major ROS: hypochlorous acid (HOCl), a key player of the immune response, and singlet oxygen (1O2), produced in significant amount by photosynthetic organisms. By use of peptide model complexes, reproducing perfectly the structure of some archetypal zinc fingers, we investigated the reactivity of zinc fingers toward those ROS.

Les complexes d'or(I) tels que l'auranofine et l'aurothiomalate ont été utilisés dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde depuis plusieurs décennies. Plus récemment, de nombreux complexes d'or(I) et d'or(III) ont révélé des activités anti-cancéreuses in vitro importantes. Cependant, du fait de la forte affinité de l'or pour les thiols et les sélénols, ces complexes interagissent dans les cellules avec de nombreuses protéines de façon non spécifique. Ce qui explique les effets secondaires observés chez les patients soumis à des traitements prolongés de chrysothérapie et rend plus difficile la compréhension des mécanismes d'actions de ces complexes. Parmi les cibles thérapeutiques proposées, les protéines à doigts de zinc représentent des cibles très intéressantes. En effet, ces protéines sont très abondantes (environ 8 % du protéome humain) et se retrouvent dans des processus clés de la machinerie cellulaire (régulation de gènes, transcription, apoptose, réparation de l'ADN, résistance au stress oxydant…). Ces protéines possèdent un site Zn(Cys)4-x(His)x (x = 0-2) où le zinc permet d'assurer le bon repliement de la protéine et son bon fonctionnement. Nous nous sommes donc intéressés à déterminer l'interaction de complexes d'or(I) et d'or(III) avec les protéines doigts de zinc à l'aide de modèles peptidiques de ces sites à zinc. Nous avons caractérisé les produits issus de la réaction entre les peptides et l'or et déterminé les cinétiques de déplacement du zinc par l'or. / Gold(I) complexes such as auranofine and aurothiomalate have been used as therapeutic agents for the treatment of rheumatoid arthritis for several decades. More recently, several gold(I) and gold(III) complexes have shown important in vitro anticancer properties. However, because of the high affinity of gold for sulfur and selenium ligands, these complexes interact with lots of proteins in a non-specific manner. This explains some of the side effects observed in patients treated with gold complexes and also why the mechanism of action of these complexes remains misunderstood. Among all the therapeutic target of gold salts that has been proposed, zinc fingers proteins are very interesting targets. Indeed, these proteins are very abundant (ca. 8 % of human proteome) and are involved in key processes of the cell (genes regulation, transcription, apoptose, DNA repair, resistance to oxidant stress…). These proteins contains a Zn(Cys)4-x(His)x (x = 0-2) center where zinc assure the proper fold and function of the protein. We were interested to study the interaction of some gold(I) and gold(III) complexes with zinc finger proteins by using peptidic models these zinc sites. By using different spectroscopic methods, we have characterized the products obtained by reaction between the zinc fingers and the gold salts and determined the kinetics of zinc displacement by gold.