La neuropatía diabética (ND) es una de las complicaciones a largo plazo más comunes que presentan los pacientes con diabetes mellitus (DM). Los pacientes presentan como síntomas más significativos un deterioro de la función nerviosa con disfunción sensorial y dolor en las extremidades. Los mecanismos patológicos, que llevan al desarrollo de la complicación pueden ser múltiples y no están claros por lo que no existe un tratamiento único y satisfactorio. El descubrimiento de un tratamiento eficaz requiere una mayor comprensión de las causas que desencadenan la complicación, entre ellas qué tipo celular está primariamente afectado, lo que permitiría tratar la enfermedad en las primeras etapas de la complicación.El sistema nervioso periférico (SNP) contiene principalmente dos tipos celulares: neuronas y células de la glia, concretamente las células de Schwann (SC) que son las responsables de la producción de las proteínas de la mielina. En la primera parte de este trabajo nos centramos en la caracterización molecular de los efectos de la concentración de glucosa sobre las SC in vitro, en cultivos establecidos y primarios y también en cocultivos de SC y neuronas sensoriales primarias. Más tarde se realizaron estudios in vivo en muestras de nervios ciáticos de tres modelos animales diferentes, ratones ICR adultos y jóvenes a los que se les indujo la diabetes experimental mediante inyección de estreptozotocina (STZ) y también en ratones NOD, modelo de diabetes tipo I que desarrolla la enfermedad espontáneamente. En el estudio se analizaron tanto las proteínas de la mielina como factores de transcripción implicados en mielinización, demostrándose alteraciones en la expresión de estas proteínas. En la segunda parte de esta tesis, se estudiaron los cambios inducidos por la hiperglucemia en la expresión de NRG1typeIII, un factor esencial para la mielinización en sistema nervioso periférico. Se realizaron estudios in vitro con neuronas sensoriales primarias purificadas o en cocultivo con SC y cultivos primarios de neuronas motoras, cultivadas en diferentes concentraciones de glucosa. In vivo se analizaron muestras de ganglios de la raíz dorsal y de médula espinal de los tres modelos animales que hemos comentado anteriormente. En todos los casos se demostró una disminución de la expresión de NRG1typeIII.En la parte final de este trabajo, y como prueba de concepto, se administraron vectores virales con el factor promielinizante NRG1typeIII en un modelo de neuropatía diabética donde los estudios, tanto a nivel molecular como electrofisiológicos y morfológicos, demostraron una mejora significativa comparándolos con animales diabéticos no tratatados o tratados con vectores virales irrelevantes, por lo que parecería que el tipo celular primariamente afectado en la ND son las neuronas del SNP.Hasta la actualidad no existe un tratamiento óptimo para la neuropatía diabética. Nuestros resultados sugieren que los mecanismos moleculares que desencadenan esta complicación de la diabetes aparecen ya desde los primeros días de hiperglucemia, y que un tratamiento alternativo para esta complicación podría basarse en estrategias de terapia génica con vectores virales. / Diabetic neuropathy (DN) is one of the long-term complications most commonly presented in patients with diabetes mellitus (DM), with a estimated prevalence of 60% of patients. Patients have significant symptoms as a deterioration of nerve function with sensory dysfunction and pain in the extremities. The pathological mechanisms that lead to the development of the complication may be multiple and are unclear as there is no satisfactory treatment. The discovery of an effective treatment requires a greater understanding of the causes that lead to the complication, including which cell type is primarily affected, which would treat the disease in the early stages of the complication, unlike the current treatment that is performed when symptoms are well established. The peripheral nervous system (PNS) contains two main cell types: neurons and glia cells, particularly Schwann cells (SC) that are responsible for the production of myelin proteins in PNS. In the first part of this work we focus on the molecular characterization of the effects of glucose on the SC in vitro in established and primary cultures and in cocultures of SCs and primary sensory neurons. Later in vivo studies were conducted on samples of sciatic nerves from three different animal models, ICR mice adults and young (18 postnatal days) that were induced experimental diabetes by injection of streptozotocin (STZ) and in NOD mice, a type I diabetes model that spontaneously develops the disease. The study analyzed both the myelin proteins as key transcription factors involved in myelination, demonstrating altered expression of these proteins.In the second part of this thesis, we studied the changes induced by hyperglycemia in NRG1typeIII expression, an essential factor for myelination in PNS. Studies were conducted in vitro with purified or primary sensory neurons in coculture with SCs and primary cultures of motor neurons, grown in different concentrations of glucose. In vivo samples from dorsal root ganglia and spinal cord of three animal models that we discussed earlier. In all cases, showed a decreased expression of NRG1typeIII. In the final part of this work, and as a proof of concept, viral vectors coding for NRG1typeIII were administered in a mouse model of diabetic neuropathy where studies, both molecular and electrophysiological and morphological, showed a significant improvement compared with control diabetic animals or the same animals treated with viral vectors irrelevant, it would seem that the cell type primarily affected in the ND neurons are SNP, since the early days of hyperglycemia. To date there is no optimal treatment for diabetic neuropathy. Our results suggest that the molecular mechanisms that trigger this complication of diabetes appear since the early days of hyperglycemia, and an alternative treatment for this complication could be based on gene therapy strategies using viral vectors.

Diversas líneas de evidencia asignan al factor de crecimiento neuronal (NGF), expresado en el espacio endoneural por células de Schwann activadas tras una lesión nerviosa, un papel en el mecanismo del dolor neuropático periférico. Se ha sugerido, pues, que el NGF podría promover sprouting en la zona de la lesión y generar cambios plásticos en la primera neurona sensorial y sus proyecciones centrales, colaborando de este modo al inicio del dolor neuropático. El objetivo general de esta investigación fue evaluar estos posibles mecanismos. Para realizar el estudio se utilizó un abordaje metodológico directo: la administración endoneural de NGF o vehículo. Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho de 250 a 300 g, cuyos nervios ciáticos izquierdos fueron inyectados con 10 µl de solución. Se realizaron pruebas conductuales de dolor neuropático estímulo-dependiente (hiperalgesia térmica y alodinia mecánica), de dolor inflamatorio (prueba de la formalina), se realizó un estudio histológico del nervio ciático inyectado y un estudio inmunohistoquímico para los péptidos sensoriales SP y péptido relacionado al gen de la calcitonina (calcitonin gene-related peptide, CGRP) en el ganglio de la raíz dorsal (dorsal root ganglion, DRG) y el asta posterior de la médula espinal. La administración endoneural de NGF (1 a 30 ng) produjo hiperalgesia térmica, pero no alodinia mecánica. Además, el NGF produjo desmielinización, una modesta degeneración de fibras e indujo la formación de brotes axonales. Estos efectos conductuales e histológicos del NGF fueron comparables y vinculables en cuanto a su relación dosis-efecto como en cuanto a su curso temporal, lo que sugiere que ambos efectos pueden estar relacionados. La administración endoneural de 30 ng de NGF produjo un aumento significativo tanto del porcentaje de células medianas a grandes que contienen CGRP en el DRG, como del área ocupada por fibras que contienen CGRP en las láminas III y IV del asta medular posterior, que corresponden a neuronas sensoriales medianas a grandes. Ambos efectos fueron limitados en el tiempo, prolongándose por 5 días. No se observaron cambios en el contenido de SP ni en el DRG ni en la médula espinal. Finalmente, la administración de 30 ng de NGF produjo un aumento en la fase 2 de la prueba de la formalina el día 3 posinyección de NGF, pero no los días 5 ni 10. En conjunto, estos resultados otorgan un importante apoyo a las hipótesis que asignan un papel al NGF endoneural en el inicio del dolor neuropático. Tanto la hiperalgesia como los efectos histológicos del ciático inyectado y los cambios en la expresión de CGRP han sido descritos en modelos animales de dolor neuropático. Estos resultados además ilustran acerca de los efectos del NGF sobre axones no lesionados, lo que debe ser tomado en cuenta antes de pensar en un eventual uso terapéutico del NGF, que ha sido propuesto por otros autores. Finalmente, los resultados de la prueba de la formalina colaboran a la comprensión de la escasamente conocida relación entre el dolor neuropático y el dolor inflamatorio. / Neuroimmune interactions and neuropathic pain: role of nerve growth factorSeveral lines of evidence suggest that nerve growth factor (NGF), expressed in the endoneurial milieu by activated Schwann cells, has an important role on peripheral neuropathic pain mechanism. Specifically, it has been hypothesized that NGF acts on neuropathic pain by inducing axonal sprouting at the injury site and by generating plastic changes at primary sensory neurons and their central processes. The main objective of this investigation was to evaluate these possible mechanisms. For this study a direct methodological approach was used: the endoneurial administration of NGF or vehicle. Male Sprague-Dawley rats of 250 to 300 g were injected on their left sciatic nerves with 10 µl of solution. Behavioral tests were conducted to evaluate thermal hyperalgesia and mechanical allodynia as neuroapthic pain behaviors, and also to evaluate inflammatory pain (formalin test). Additionally, a histological study of the injected sciatic nerve and an immunohistochemical study for sensory neuropeptides SP and calcitonin gene-related peptide (CGRP) in the dorsal root ganglion (DRG) and the dorsal horn were also carried out. Endoneurial administration of NGF (1 to 30 ng) produced thermal hyperalgesia, but not mechanical allodynia. Moreover, NGF produced demielinization, sporadic fiber degeneration, and induced axonal sprouting. The behavioural and histological effects of NGF were both dose-dependent, and the timecourses of both effects were similar. NGF administration increased the percentage of medium- to large- sized CGRP-positive neuron profiles, and increased CGRP content in laminae III and IV of the dorsal horn, the area occupied by medium to large neuron processes. Both effects were time-limited, lasting for 5 days. NGF did not induce changes on SP content nor in the DRG neither in the dorsal horn. Finally, 30 ng of NGF produced an increase in the phase 2 of formalin test on day 3, but not on subsequent days. Taken together, these results give an important support to the hypotheses that propose that endoneurial NGF has an important role in the onset of neuropathic pain. Thermal hyperalgesia, histological effects on the sciatic nerve and CGRP-expression changes have been also described using animal models of neuropathic pain. Otherwise, these results illustrate about the effects of NGF on uninjured axons. This has to be considered before applying neurotrophic factors therapeutically, as it has been suggested by other authors. Finally, the formalin test results collaborate to the understanding of the largely unknown relation between neuropathic pain and inflammatory pain.

Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 92/0811 y FIS 95/0053.1)

Tesis para optar al grado de Magíster en Salud Pública / Según la Asociación Internacional para el estudio del dolor (IASP) dolor se define como "una experiencia sensorial y emocional desagradable, asociada a un daño tisular existente o potencial, o descrita en términos de ese daño". El dolor neuropático es un tipo de dolor crónico que posee características fisiopatológicas y semiológicas particulares, así como también lo son los pacientes que lo padecen. Una de las tantas etiologías de este tipo de dolor es la neuropatía diabética dolorosa. A pesar de la alta prevalencia existente por estudios internacionales, en Chile no se conoce la prevalencia, ni tampoco es contemplada como complicación en el GES de diabetes. Dentro de los tratamientos estándar se encuentran: anticonvulsivantes, como la pregabalina, antidepresivos triciclicos como la amitriptilna y duales como la duloxetina. Sin embargo, muchos enfermos persisten con dolor, y aún más enfermos no pueden optar a este tratamiento en Chile por su elevado costo. Es por ello que se propone un tipo de terapia coadyuvante a este tipo de manejo, y en algunos casos según la disponibilidad, como único tratamiento. Ob"etivo General: Determinar la eficacia de la infiltración de lidocaina subcutánea en disminuir el dolor neuropático en pacientes con neuropatia diabética en extremidades superiores e inferiores. Metodolo ía: Se realizará un ensayo clfnico, aleatorizado, doble ciego, en un consultorio de la atención primaria de salud en Santiago de Chile. Sin embargo, antes de realizar el estudio propiamente tal, es necesario levantar datos epidemiológicos que no se encuentran disponibles en los consultorios de atención primaria en Chile, de esta manera: 1.- primero se cuantificarán a todos los pacientes diagnosticados con diabetes, pertenecientes al grupo de "pacientes crónicos". 2.- Luego se detectarán los potenciales pacientes con dolor neuropático a través del cuestionario DN4 - examen flsico y con criterios de ingreso al estudio 3.- El estudio real durará 6 semanas: al inicio se cuantificará el dolor y su repercusión en las actividades de la vida diaria (con la escala Eva, índice de discapacidad de Oswestry, cuestionario del sueño MOS, depresión - ansiedad, la localización del dolor a través del mapa del dolor y SF - 12 Calidad de vida). Luego al finalizar la 3era semana de tratamiento se evalúa nuevamente, agregándose la escala PGI - 1 I CGI - I; y luego al completar la sexta semana finalmente. Resultados Es erados: Disminución en un 30% del dolor con terapia neural/infiltración de lidocaína se. Disminución de un 50% de las otras variables.