En los seres humanos, la supervivencia del infante depende de forma considerable de los esfuerzos de la madre y la calidad de su cuidado contribuirá significativamente al desarrollo neurobiológico, cognitivo y socio-emocional del niño (Shonkoff et al., 2012). Además, casi todas las mujeres experimentarán un embarazo a lo largo de su vida, lo cual es reconocido por predisponer a la madre a cierta vulnerabilidad mental (Brunton and Russell, 2008). Sin embargo, se sabe muy poco sobre los efectos del embarazo en el cerebro de la mujer. Cambios endocrinos menos extremos ocasionan modificaciones morfológicas cerebrales (Erickson et al., 2010; Woolley and McEwen, 1993, 1992) y diversos estudios en mamíferos demuestran adaptaciones neuronales con el fin de garantizar el embarazo, el parto y el puerperio, lo cual que sugiere una plasticidad cerebral inherente a la reproducción en los seres humanos (Brunton and Russell, 2008; Kinsley and Amory-Meyer, 2011; Swain et al., 2014). Aunque esta cuestión se ha abordado previamente evaluando cambios a nivel cerebral global, los resultados aquí presentes son los primeros en revelar las características precisas de los cambios morfológicos cerebrales asociados a la reproducción exitosa en las madres humanas. El objetivo de este estudio es examinar en mujeres si el embarazo se asocia con cambios morfológicos cerebrales y en qué áreas. Se trata de un estudio longitudinal de casos y controles, donde obtuvimos imágenes de alta resolución mediante resonancia magnética del cerebro de 25 mujeres primíparas y sus parejas masculinas (n = 19) en dos momentos: antes y después del embarazo. También se adquirieron exploraciones longitudinales de 20 mujeres nulíparas controles y sus parejas masculinas (n = 17). Se aplicó un análisis morfométrico longitudinal basado en vóxeles para calcular los cambios en la sustancia gris (SG) entre los dos momentos de medición a nivel individual y posteriormente comparar estos cambios entre los grupos de sujetos (primíparas versus controles). Las comparaciones entre grupos revelan un patrón simétrico y altamente significativo de reducciones volumétricas de SG en las mujeres que pasaron por un embarazo en comparación con las mujeres control nulíparas. No se encontraron diferencias significativas entre las muestras masculinas. Estas reducciones de volumen de SG asociadas al embarazo se observan en la línea media posterior (cingulado posterior y precuneus), la corteza frontal medial (córtex prefrontal medial y cingulado anterior), la corteza prefrontal lateral bilateral (clústeres en la corteza prefrontal ventrolateral y dorsolateral) y la corteza temporal bilateral (surco temporal superior bilateral que se extiende a secciones laterales circundantes así como a estructuras temporales mediales tales como el giro fusiforme). Todos los valores de p son inferiores a 0,05 con corrección familywise-error. Los cambios son muy consistentes a través de la muestra y el total de las mujeres participantes pueden ser clasificadas de forma significativamente acertada en haber tenido un embarazo o no en base a la distribución de la SG en el cerebro. Los resultados aquí presentes son los primeros en demostrar que el embarazo está relacionado a cambios morfológicos cerebrales específicos en los seres humanos, proporcionando conocimientos primarios sobre la forma en que el cerebro de la mujer es modificado durante el embarazo. Los resultados se discuten a la luz de estudios que evalúan las áreas cerebrales implicadas y los posibles mecanismos neurobiológicos subyacentes a estas reducciones de volumen de SG. Aunque el mecanismo y el significado fisiológico de estos hallazgos son especulativos en la actualidad, este estudio proporciona claves primordiales sobre la base neural de la maternidad, la salud mental perinatal y la plasticidad cerebral en general. / In humans, the survival of the young is dependent to a significant degree on the exertions of the mother, and the quality of her care will contribute to the foundation of the infant’s neurobiological, cognitive and socio-emotional development (Shonkoff et al., 2012). Furthermore, almost every women will experience pregnancy which is recognized to predispose the mother to a period of mental vulnerability (Brunton and Russell, 2008). Nevertheless, very little is known on how pregnancy affects the human brain. It has been proven that less extreme endocrine changes render morphological brain modifications (Erickson et al., 2010; Woolley and McEwen, 1993, 1992) and several studies in mammals show adaptations in various brain systems in order to ensure pregnancy, delivery and postnatal care, suggesting in humans a brain plasticity inherent to reproduction itself (Brunton and Russell, 2008; Kinsley and Amory-Meyer, 2011; Swain et al., 2014). Although this question has been previously addressed assessing whole brain changes in size (Oatridge et al., 2002), the current findings are the first to explicitly show the precise morphologic brain changes associated with successful reproduction in human mothers. The aim of this study is to examine whether pregnancy is associated with morphological brain changes in women. In this longitudinal case-control study, we obtained high-resolution brain MRI scans of 25 primiparous women and their male partners (n=19) before and after pregnancy. Longitudinal scans of 20 nulliparous control women and their male partners (n=17) were also acquired. A longitudinal voxel based morphometric analysis was applied to calculate changes in grey matter (GM) between the two different time-points and compare these changes between the groups of subjects (primiparous versus controls). Group comparisons of these within-subject GM changes indicate a symmetrical pattern of highly significant GM volumetric reductions in the women who underwent pregnancy in comparison to the nulliparous control women. The comparison between the male samples does not yield significant differences. These GM volume reductions associated with pregnancy are observed in the posterior midline (posterior cingulate and precuneus), the medial frontal cortex (medial prefrontal cortex and anterior cingulate), bilateral lateral prefrontal cortex (clusters in the ventrolateral and dorsolateral prefrontal cortex) and bilateral temporal cortex (bilateral superior temporal sulcus extending to surrounding lateral temporal sections as well as medial temporal structures such as the fusiform gyrus). All p values are below 0.05 familywise-error corrected. The changes are remarkably consistent across subjects and the women can significantly be classified as having undergone pregnancy or not, based on the distribution of GM changes across the brain. The current findings are the first to demonstrate that pregnancy is related to specific morphological brain changes in humans, providing primary insights into the way a woman’s brain is modified during pregnancy. The results are discussed in the light of studies assessing the implicated brain areas and the potential neurobiological mechanisms underlying these GM volume reductions. Although the mechanism and physiological meaning of these findings are speculative at the present time, these findings provide primary clues regarding the neural basis of motherhood, perinatal mental health and brain plasticity in general.

Los traumatismos craneoenfálicos (TCE) y los infartos malignos de la arteria cerebral media (IMACM) provocan importantes desequilibrios iónicos, generando una entrada masiva de iones en las células, con el consecuente arrastre osmótico de agua y la formación de edema cerebral. La alteración de las concentraciones iónicas induce la acumulación de agua en el espacio intra y extracelular (EEC), causando hinchazón del tejido cerebral lesionado y deterioro clínico de estos pacientes. Estos trastornos iónicos están directamente relacionados con la sobreexpresión de distintos canales iónicos, constitutivos o de nueva expresión como el canal formado por el receptor de la sulfonilurea 1 (SUR1) y el receptor de potencial transitorio de la melastatina 4 (TRPM4) conocido como SUR1-TRPM4. Las técnicas actuales de neuromonitorización permiten el estudio de los procesos que tienen lugar tras una lesión cerebral aguda. Entre ellos, la microdiálisis (MD) cerebral es una técnica de neuromonitorización avanzada que permite el muestreo continuo del EEC. Los objetivos principales de esta tesis fueron: 1) estudiar la expresión del SUR1 en distintos tipos celulares (neuronas, células endoteliales, astrocitos, microglía reactiva/macrófagos y neutrófilos) en el tejido cerebral pericontusional determinado, además, si su grado de expresión estaba relacionado con el tiempo postraumatismo, 2) determinar la recuperación relativa (RR) in vitro de Na+, K+, Cl-, albúmina y cistatina C con membranas de MD de 100 kDa (CMA71) a una velocidad de perfusión de 0,30 µL/min, 3) estimar el perfil iónico y molecular del EEC cerebral en las distintas áreas cerebrales en las que se insertó el catéter de MD en pacientes con lesiones cerebrales agudas y 4) definir la aparición de edema vasogénico a partir de la detección de albúmina y cistatina C en el EEC del encéfalo. En primer lugar, para el estudio de la expresión del SUR1 en el tejido pericontusional, se analizó un grupo de 26 muestras de contusiones cerebrales de pacientes tratados quirúrgicamente y 3 controles de tejido cerebral normal mediante inmunohistoquímica de fluorescencia. Los resultados objetivaron que el SUR1 se sobreexpresaba en todos los tipos celulares cerebrales estudiados. Sin embargo, el patrón temporal de expresión del SUR1 era distinto para cada tipo celular. En segundo lugar, para el cálculo de la RR de iones se llevaron a cabo 9 experimentos in vitro con catéteres de MD CMA-71 aplicando las condiciones estándar utilizadas en un entorno clínico, determinándose las concentraciones iónicas, tanto en el dializado y como de la matriz. Un modelo de regresión lineal permitió calcular las concentraciones iónicas reales en la matriz. Por último, para el análisis de perfil iónico del EEC cerebral se analizaron los microdializados de 34 pacientes con un TCE o IMACM que recibieron monitorización multimodal durante las primeras 48 horas tras el TCE o del inicio de los síntomas del IMACM. Se determinó la concentración iónica en 12 muestras por paciente mediante espectrometría de masas con plasma acoplado inductivamente, considerando que el perfil iónico de los pacientes depende de la zona de inserción del catéter de MD. Los resultados mostraron que los niveles de K+ en el EEC guardan relación con la viabilidad del tejido, mientras que los Na+ con la permeabilidad de barrera hematoencefálica. La MD ofrece la posibilidad única de observar las transformaciones dinámicas de los iones en el cerebro a través del tiempo y abre una nueva vía para explorar el perfil iónico del cerebro, sus cambios en el edema cerebral y cómo este perfil se puede modificar con diferentes terapias. Definir el perfil molecular del edema puede servir como índice cuantitativo de progresión del edema, permitiendo la modulación farmacológica de sus distintas etapas y potenciales tratamientos dirigidos al bloqueo selectivo de SUR1. / Traumatic brain injury (TBI) and malignant middle cerebral artery infarction (MMCAI) cause significant ionic imbalances, generating massive ionic fluxes with the consequent osmotic water movement across the cells and the cerebral edema formation. Changes in ionic concentrations induce water accumulation in the intracellular and extracellular space and cause swelling of the injured brain tissue and neurological worsening in patients. These ionic disorders are directly related to the overexpression of different ion channels, that can be constitutive or newly synthesized as the channel formed by the sulfonylurea receptor 1 (SUR1) and transient receptor potential of melastatin 4 (TRPM4) known as SUR1-TRPM4. Current neuromonitorization techniques allow the study of the processes occurring after acute brain injury. Cerebral microdialysis (MD) is an advanced neuromonitorization technique that allows continuous sampling of the cerebral parenchyma. The main objectives of this thesis were: 1) to study SUR1 expression in different cell types (neurons, endothelial cells, astrocytes, reactive microglia/macrophages and neutrophils) in pericontusional brain tissue and whether SUR1 up-regulation was related to time post injury, 2) to calculate the in vitro relative recovery (RR) of Na+, K+, Cl-, albumin and cystatin C with membranes of 100 kDa MD (CMA71) at an infusion rate of 0.30 µL/min, 3) to determine the ionic and molecular profile of brain extracellular space in different brain areas in which MD catheter was inserted in patients with acute brain injury and 4) to define the development of vasogenic edema by the albumin and cystatin C detection in the brain extracellular space. First, to study SUR1 expression in pericontusional tissue, 26 samples obtained from brain-injured patients who underwent surgical treatment and 3 normal brain tissue samples as a control were analyzed using inmunofluorescence. The results showed that SUR1 is overexpressed in all studied cell types. However, the temporal pattern of SUR1 expression was found to be different in each cell type. Secondly, to calculate the RR of ions, 9 experiments were performed in vitro with MD CMA-71 catheters under standard conditions for clinical settings. Ionic concentrations were determined in both the dialysate and the matrix. A linear regression model was used to calculate the true ionic concentrations in the matrix. Finally, to analyze the ionic profile of brain extracellular space, microdialysate samples of 34 patients were analyzed. The patient group had presented with moderate or severe TBI or MMCAI, and received multimodal monitoring during the first 48 hours after injury or start of symptoms. Ionic concentrations were determined in 12 samples for each patient using inductively coupled plasma mass spectrometry. Ionic profile was studied according to where the MD catheter was inserted. The results showed that K+ levels in the extracellular space were related to tissue viability, while the Na+ concentration was related to blood-brain barrier permeability. MD offers a unique opportunity to observe the dynamic transformations of ions in the brain over time and opens up a new path to explore the ionic profile of the brain in terms of how it changes during brain edema and how it may be modified through different therapies. A definition of the molecular profile in brain edema can be used as a quantitative index of edema progression, which may allow different stages to be managed pharmacologically and potential treatments directed at selectively blocking SUR1 to be developed.

Introducción En las últimas décadas, los investigadores de programas de trasplante cardiaco (TC) han tratado de identificar la existencia de factores psicosociales que pueden influir en el resultado clínico, antes y después del trasplante. Entre estos factores, los que han mostrado una mayor relevancia son: la morbilidad psiquiátrica, los trastornos relacionados con el consumo de sustancias, los rasgos de personalidad, las variables psicológicas y las estrategias de afrontamiento, el funcionamiento cognitivo, el apoyo familiar y social recibido y el cumplimiento de las pautas médicas. Objetivos Los principales objetivos de la presente investigación son: 1) describir y analizar los aspectos psiquiátricos y los factores psicosociales de una muestra de receptores de TC; 2) realizar un estudio evolutivo de los factores psiquiátricos y psicosociales a lo largo del proceso; 3) identificar factores predictores de psicopatología a los 12 meses del TC y 4) evaluar y cuantificar el incumplimiento de las pautas médicas durante el periodo post-TC. Métodos Se llevó a cabo un estudio de cohortes prospectivo, consistente en una evaluación durante la fase de lista de espera y en un seguimiento 12 meses después del TC. La muestra se obtuvo de los pacientes incluidos consecutivamente en el programa de TC del Hospital Clínic de Barcelona, entre 2006 y 2012. La evaluación basal pre-trasplante consistió en: registro de variables clínicas, escala de ansiedad y depresión en patología médica (HADS), entrevistas clínicas estructuradas del DSM-IV (SCID), cuestionario de estrategias de afrontamiento (COPE), inventario de factores de personalidad (NEO-FFI-R), cuestionario de funcionamiento familiar (Apgar) y escala de locus de control (MHLC). A los 12 meses del trasplante se evaluó: HADS, COPE, Apgar y MHLC. También se aplicó un instrumento de medición del incumplimiento de pautas, diseñado específicamente para este estudio. Resultados Se exponen los resultados de las distintas publicaciones llevadas a cabo. Se realizó la evaluación psicosocial basal a un total de 125 candidatos. Fueron 78 de estos pacientes los que se sometieron al trasplante y accedieron a realizar el programa de seguimiento. En la evaluación basal, un 32,1% de los pacientes presentaba un trastorno psiquiátrico. A los 12 meses de la cirugía se observaron menores puntuaciones en la escala HADS, menor necesidad de apoyo externo y deshago emocional, así como una mayor percepción de autocontrol del proceso. El Neuroticismo y la dimensión de afrontamiento Desvinculación medidos en el pre-trasplante, mostraron un valor predictivo para la aparición de psicopatología a los 12 meses. El valor porcentual medio de incumplimiento a los 12 meses del TC fue del 27,2%. Las puntuaciones elevadas del factor Responsabilidad del NEO-FFI-R se asociaron a un mejor cumplimiento. Conclusiones Ante la relevancia que desempeñan los factores psicosociales a lo largo de todo el proceso de TC, el abordaje psiquiátrico de los candidatos juega un papel importante. El Neuroticismo y las estrategias de afrontamiento de Desvinculación pueden servir como marcadores, para identificar pacientes susceptibles de intervenciones psiquiátricas y psicológicas específicas. Pese a la situación de gravedad clínica y la complejidad que implica el TC, la incidencia global de incumplimiento de pautas médicas es elevada. / Introduction In the last decades, researchers of heart transplantation (HT) programs have attempted to identify the existence of psychosocial factors that might influence the clinical outcome before and after the transplantation. These are the factors that have shown a higher relevance: psychiatric morbidity, substance-related disorders, personality traits, psychological factors and coping strategies, cognitive function, family and social support and compliance with medical recommendations. Objectives The main objectives of this research are: 1) describe and analyse the psychiatric patterns and the psychosocial factors of a sample of HT recipients; 2) make an evolutional assessment of psychiatric and psychosocial factors throughout the process; 3) identify predictors of psychopathology 12 months after HT and 4) assess and quantify noncompliance with medical recommendations during the post-transplantation period. Methods A prospective cohort study was performed. Recipients were assessed during waiting list period and 12-month after HT. The sample was obtained from patients enrolled consecutively in HT program of Hospital Clinic of Barcelona between 2006 and 2012. Pre-transplant baseline assessment consisted in clinical form, Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS), Structured Clinical Interviews for Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (SCID), Coping questionnaire (COPE), personality inventory (NEO-FFI-R), Apgar-Family questionnaire and Multidimensional Health Locus of Control (MHLC). The follow- up assessment was performed one year after heart transplantation with HADS, COPE, Apgar and MHLC. A specific instrument designed for this study to assess noncompliance was also applied. Results Results of the different published papers of this research are exposed. Baseline psychosocial assessment was performed in 125 HT candidates. 78 of these patients underwent transplantation and accepted to continue the follow-up program. At baseline evaluation 32.1% of patients had a psychiatric disorder. Lower scores on HADS, less necessity of publicly venting of feelings and a trend to an internal locus of control were observed at 12-month after the surgery. Neuroticism and Disengagement coping dimension pre-HT were predictors of psychopathology in the follow-up assessment. The overall rate of incompliance of medical regimen 12 months after HT was 27.2%. Higher scores of NEO-FFI-R Conscientiousness factor were associated with better compliance. Conclusions Due to the relevance of psychosocial factors throughout HT process, the psychiatric approach of candidates has an important role. Neuroticism and Disengagement coping styles, can serve as markers to identify patients who may benefit from psychiatric and psychological interventions. Despite the complexity and severity that involves a HT, the overall incidence of noncompliance is high.

Las semaforinas se describieron como moléculas de guía axonal durante el desarrollo del sistema nervioso central (SNC) aunque en la actualidad se sabe que también se expresan en tejidos adultos y que participan en procesos fisiológicos y patológicos. Las semaforinas implicadas en la regulación de la respuesta inmune se las ha denominado inmunosemaforinas. De entre ellas, algunas han sido ampliamente estudiadas en la esclerosis múltiple (EM), enfermedad desmielinizante y neurodegenerativa cuya patogenia está mediada principalmente por el sistema inmune. Sin embargo, otras como la semaforina (sema)3A y la sema7A han sido menos estudiadas y por su función en el mantenimeinto del SNC adulto y en la regulación de la respuesta inmune, podrían ser relevantes en el contexto de la EM. En esta tesis doctoral se ha estudiado la expresión de la sema3A, la sema7A y la de sus receptores en muestras de pacientes con enfermedades que cursan con desmielinización en el SNC, observando una mayor expresión en las lesiones de EM, especialmente en los astrocitos reactivos y en la microglía/macrófagos, respecto a las lesiones de infarto agudo y de leucoencefalopatía multifocal progresiva. Además, al estudiar diferentes tipos de lesiones de EM, observamos que el aumento de la expresión de las semaforinas y de sus receptores estaba relacionada con el grado de la actividad inflamatoria de la lesión. Utilizando un modelo animal de EM, la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), se caracterizó la expresión de la sema3A, la sema7A y la de sus receptores en el SNC y el sistema inmune a lo largo del curso clínico de la enfermedad. La expresión de la sema3A y de sus receptores aumentó a partir de la inducción de la EAE en las células del infiltrado y en la sustancia blanca perilesional del SNC, mientras que disminuyó en las células inmunes de la periferia. Sin embargo, observamos un aumento en la expresión de la sema7A y de sus receptores tanto en el SNC como en las células inmunes periféricas. Ya que la aproximación terapéutica más sencilla sería inhibir la función de la sema7A de forma generalizada, indujimos la EAE en animales deficientes en la sema7A y observamos una alteración en el inicio y desarrollo de la enfermedad, así como en la capacidad proliferativa de las células inmunes, la producción de citocinas pro-inflamatorias y la formación de las lesiones en el SNC, siendo inferior respecto a los animales control. Por todo ello, la inhibición de la vía de señalización de la sema7A podría ser una diana terapéutica en la EM, ya que regula la respuesta inmune y favorece la capacidad regenerativa del SNC. / Semaphorins have been described as guide axonal cues during the development of the central nervous system (CNS). Nowadays they have also been found to be expressed in adult tissues taking part in physiological and pathological processes. Semaphorins involved in the regulation of immune response are called immunosemaphorins, some of which have been studied in Multiple Sclerosis (MS), a demyelinating and neurodegenerative disease that is mediated mainly by the immune system. Other semaphorins, such as semaphorin (sema)3A and sema7A, have been less studied and they could be relevant in the MS context because of their function in the adult CNS maintenance and immune response modulation. In this doctoral thesis has been studied the expression of sema3A, sema7A and their receptors in samples of patients with demyelinating diseases, reaching higher expression in MS lesions, mainly in reactive astrocytes and miroglia/macrophages, compared to acute infarct and progressive multifocal leukoencephalopathy. Besides, when different kinds of MS lesions were studied, we observed that the increased expression of semaphorins and their receptors were related to the degree of the inflammatory activity in the lesion. Employing an animal model of MS, experimental autoimmune encephalopathy (EAE), we characterised the expression of sema3A, sema7A as well as their receptors in the CNS and the immune system during the clinical course of the disease. The expression of sema3A and its receptors increased upon EAE induction in the infiltrated cells and in the perilesional white matter of CNS, while it decreased in the peripheral immune cells. However, we observed an increase in the expression of sema7A and its receptors in both the CNS and the peripheral immune cells. Because the simplest therapeutic approach would seem to be the inhibition of the sema7A function, we induced EAE in animals deficient for sema7A. We found an alteration in the onset and development of disease. The proliferative capability of immune cells, the production of pro-inflammatory cytokines and the formation of the lesions in the CNS was lower in sema7AKO mice compared to control animals. Therefore, the inhibition of sema7A pathway might be a therapeutic target in MS as it regulates the immune response and promotes the regenerative capacity of the CNS.

El principal factor de risc en la malaltia d’Alzheimer, la demència senil més freqüent, és l’edat i presenta major incidència en les dones. En la seva aparició, se li atribueixen també altres factors de risc, tant biològics (genètics i no genètics) com ambientals. La seva forma familiar heretada genèticament (< 5% dels casos), i l’esporàdica (majoritària, d’etiologia desconeguda) difereixen en l’edat d’inici i la taxa de progressió del procés neurodegeneratiu. Tot i això, el fet que comparteixin els mateixos símptomes cognitius i els conductuals i psicològics associats a la demència (BPSD) així com processos neuropatològics subjacents, ha permès a nivell experimental, la utilització de models animals portadors dels transgens humans per a l’avenç en l’estudi de la malaltia. Els ratolins 3xTg-AD (PS1/M146V, APPSwe i tauP301L), creats pel laboratori de Laferla (UCI, USA, 2003), desenvolupen de forma progressiva els trets neuropatològics βA i tau característics de la malaltia, amb un perfil temporal i neuroanatòmic similar al dels pacients. Ells han permès estudiar l’impacte del factor genètic i del gènere (Estudi I) en l’expressió de les conductes bizarres, fins ara no caracteritzades, com a part del seu patró de tipus BPSD primerenc. Alhora, s’han avaluat els efectes beneficiosos a llarg termini del handling postnatal, una estimulació ambiental de tipus sensorial tàctil administrada durant l’ontogènia. El tractament va reduir en els dos genotips, no transgènic (NTg) i 3xTg-AD, la conducta de petrificació i, especialment en les femelles, les conductes bizarres en el camp obert alhora que potencià la conducta de valoració del risc en la caixa fosca/clara. A més, va exercir efectes selectius sobre les ‘estratègies per fer front a l’estrès’ sense modificar l'activitat exploratòria per se. Estudi II. La cafeïna exerceix efectes farmacològics estimulants però també ansiogènics i els efectes d’aquest hàbit de vida són més acusats en els homes. Es va verificar si els beneficis cognitius que se li atribueixen en vers a la malaltia serien extensibles si existeix un perfil BPSD accentuat. Els resultats van demostrar que el tractament oral crònic (dosi baixa, 0,3mg/Kg) de cafeïna iniciat als 6 mesos d’edat (inici de la simptomatologia) va modificar a llarg termini la major part de les conductes als 13 mesos d’edat (inici de les fases avançades). La caracterització d’estratègies en el laberint de Morris van permetre definir patrons d’aprenentatge i memòria distintius (3xTg-AD: natació en cercles i estratègies mixtes i no dirigides; NTg: presència de flotació i estratègies úniques i dirigides) que van ser millorats per la cafeïna. Però, la cafeïna va incrementar el perfil ansiós i agreujar el patró BPSD dels 3xTg-AD, incloent el ritme circadià. Estudi III. Donat que l’edat és el principal factor de risc per a desenvolupar l’AD de tipus esporàdic, es va estudiar un model farmacològic d’envelliment accelerat basat en l’increment de l’estrès oxidatiu induït per l’administració crònica s.c. de 100mg/Kg de D-galactosa. En la soca c57bl/6, els efectes només es van observar a nivell d’equilibri en els mascles i en la coordinació motora en ambdós gèneres. Per contra, la D-galactosa va mostrar efectes positius dosi dependents (0-50-100mg/Kg) en altres dimensions com l’activitat exploratòria, les conductes bizarres així com algunes tasques d’aprenentatge i memòria, el què suggereix un efecte dual protector/deleteri dosi dependent. Annex. Per la seva transcendència translacional en l’estudi del dolor en pacients amb dèficit cognitiu i/o demència, s'inclouen resultats preliminars que indiquen que els ratolins 3xTg-AD mostren la mateixa resposta de la sacsejada de la cua en aigua freda que els animals NTg, i que es veu alentida en tots dos genotips per l’edat. / Age is the main risk factor in Alzheimer's disease (AD), the most common senile dementia, with higher incidence in women. Both biological (genetic and non-genetic) and environmental factors are other risk factors related to its onset. Familial Alzheimer’s disease (FAD) is genetically inherited (<5% of cases) and sporadic (>95% of cases and of unknown etiology) differ in age of onset and rate of progression of the neurodegenerative process. However, both types of AD share the same cognitive and behavioral and psychological symptoms associated to dementia (BPSD) as well as underlying neuropathological processes. Experimentally, this fact has allowed using animal models harbouring human transgenes to progress in the study of the disease. 3xTg-AD mice (PS1/M146V, and APPSwe tauP301L), engineered by Laferla’s lab (ICU, USA, 2003) gradually develop βA and tau neuropathological hallmarks of the disease, in a temporal and neuroanatomical manner similar to that found in AD patients. They have allowed us to study the impact of the genetic load and gender (Study I) in the expression of bizarre behaviors, not characterized yet, as part of their early-like BPSD pattern. Moreover, we have studied the long-term beneficial effects of postnatal handling, an environmental sensorial tactile stimulation administered during the ontogeny. Postnatal handling reduced freezing behavior in both genotypes -non-transgenic (NTg) and 3xTg-AD- and most of the bizarre behaviors -especially in females- in the open field whereas potentiated risk assessment in the dark/light box. This early life treatment also exerted selective effects on coping with stress strategies but did not modify the exploratory activity per se. Study II. Caffeine exerts stimulant pharmacological but also anxiogenic effects. The effects of this habit of life are more pronounced in men. In this study we verified whether the cognitive benefits of caffeine attributed to the disease would be extended in the presence of a strong BPSD profile. The long term effects of a chronic oral treatment (low dose, 0,3mg/kg) of caffeine initiated at 6 months of age (onset of symptoms) were found in most of the behaviors assessed at 13 months age (beginning of the advanced stages). The characterization of strategies in the Morris maze allowed to define distinctive learning and memory patterns (3xTg-AD: circling and mixed and non-goal directed strategies, NTg: floating and single and goal directed strategies) that were improved by caffeine. However, caffeine increased the anxious profile and worsened the BPSD pattern of 3xTg-AD, including circadian rhythm. Study III. Since age is the main risk factor for developing sporadic type of AD, we studied a pharmacological model of accelerated aging based on the increased oxidative stress induced by a chronic administration of D-galactose (100 mg/kg, s.c). In c57bl/6 mice, the aging effects induced by D-galactose were only observed in the equilibrium of males and motor coordination in both genders. In contrast, D-galactose showed positive dose dependent (0-50-100mg/kg) effects in other behavioral domains such as exploratory activity, bizarre behaviors and learning and memory tasks, suggesting a dual and dose dependent protective/deleterious effect. Appendix. Preliminary results have been included in this thesis due to the relevance at the translational level in the study of pain in patients with cognitive impairment and/or dementia. These results indicate that 3xTg-AD mice show the same tail flick response in cold water as compared to NTg animals, which is slowed in both genotypes by age.

Introducció: El gener del 2007 es va instal·lar un sistema de Telemedicina entre un hospital comarcal carent de neuròleg de guàrdia i el centre referència per a l’atenció dels pacients amb ictus agut, permetent l’avaluació especialitzada urgent a distància, l’administració supervisada de t-PA in situ i la selecció dels pacients candidats a trasllat urgent per a tractament endovascular. Objectius: 1.) Estudiar l’impacte de la implantació d’un sistema de Telemedicina per a l’atenció dels pacients en la fase aguda de l’ictus isquèmic en un hospital comarcal. 2.) Estudiar l’eficàcia i seguretat de l’administració del tractament fibrinolític endovenós a distància. 3.) Avaluar l’impacte del Tele-ictus per la selecció de pacients amb ictus candidats a tractament endovascular. Mètodes: Durant el primer any del sistema Tele-ictus es van estudiar els pacients amb ictus de l’hospital comarcal i es van comparar amb els de l’any anterior (previ a la implantació del Tele-ictus). Posteriorment es va realitzar un estudi prospectiu dels ictus isquèmics atesos a l’hospital comarcal els primers 3 anys del sistema. Finalment es van comparar els casos d’ictus atesos al centre de referència als quals se’ls va realitzar algun procediment endovascular durant dos anys, amb diferents procedències: els valorats directament al centre de referència (IP:ingrés primari), els procedents d’un comarcal amb Tele-ictus, (STI:sistema Tele-ictus) o els procedents d’un comarcal sense Tele-ictus (no-STI:no sistema Tele-ictus). Resultats: L’any 2007 van augmentar els pacients valorats per un neuròleg especialista (17% vs. 38%; p=0,001) i els trasllats es van reduïr (17% vs. 6%; p=0,004). Es van doblar el nombre de trombòlisis (4,6% vs. 9,6%; p=0,073), reduïnt el temps des de l’inici dels símptomes (210 vs. 162 min; p=0,05), i augmentant el nombre de tractaments dins les primeres 3 hores (40% vs. 63%; p=0,09). Durant els primers 3 anys, es van realitzar 133 “teleconsultes” i 46 pacients van rebre t-PA a distància (temps mig porta-agulla de 53,4 ± 38,2 min). El 60,9% es va tractar dins les primeres 3 hores i el 100% dins les 4,5. El 71,7% va presentar millora neurològica a les 24 hores i el 8,4% transformació hemorràgica (4,3% simptomàtica). Més de la meitat presentaven un mRS <3 als 3 mesos. La mortalitat va ser del 10,9%. El 29,3% es van traslladar al centre de referència. Van rebre tractament endovascular 119 pacients: 74 (63,1%) IP, 25 (20,5%) STI i 20 (16,4%) no-STI. Els pacients STI i IP van presentar milloria clínica similar (61 vs. 63,8%; p=0,51) i milloria funcional (36,8 vs. 35,3%; p=0,722), a diferència dels no-STI (milloria clínica 31,3%) amb pitjor recuperació funcional (15,8%) que els STI (p=0,019 i p=0,046) i els IP (p=0,05 i p=0,013). Els pacients STI van presentar menor temps porta-punxada (47 vs. 69 min; p=0,047). Conclusions: La Telemedicina permet: 1.) l’avaluació especialitzada eficaç, acurada i urgent dels pacients amb ictus agut en un hospital comarcal sense neuròleg de guàrdia; 2.) l’accés segur i ràpid al tractament trombolític administrat a distància; 3.) una acurada selecció per a trasllat al centre de referència de pacients candidats a tractament endovascular. / Introduction: In January 2007, a telestroke system was established between a community hospital lacking a neurologist on call and a stroke centre. The telestroke system allowed urgent remote evaluation of the patient by a specialized neurologist, supervised thrombolytic treatment and a decision for urgent transfer to the stroke centre for endovascular treatment. Objectives: We aimed to: 1.) study the impact of the implementation of a telemedicine system for the acute ischemic stroke care in a community hospital; 2.) study the efficacy and safety of thrombolysis at a distance; 3.) assess the benefits of telemedicine in selecting stroke patients for endovascular treatments. Methods: During the first year of operation of the telestroke system, we studied all acute ischaemic stroke patients admitted to the community hospital and compared the results with the previous year. Subsequently we conducted a prospective study of ischemic stroke patients treated at the local hospital the first three years of the system. Finally we studied all the acute stroke patients treated at referral center to perform any endovascular procedure during two years, according to the patients’ initial admission: primarily admitted (PA) or referred from community hospitals with telemedicine (TMHs) or without telemedicine (nonTMHs). Results: In 2007, the number of stroke patients evaluated by a specialized neurologist increased (17% vs. 38%, p=0.001), interhospital transfers were reduced (17% vs. 6%, p<0.001), thrombolytic treatments were doubled (4.5% vs. 9.6% p=0.073) and the time to t-PA treatment from symptom onset was reduced (210 vs. 162 min, p<0.05) and increased the number of patients treated in the 0–3 hours window (40% vs. 63%, p<0.09). During the first three years 133 “tele-consults” were done and 46 patient received t-PA at a distance (average time door-needle 53.4 ± 38.2 min). 60.9% patients were treated during the first three hours since symptoms onset, and 100% in less than 4.5 hours. 71.7% presented neurological improvement in 24 hours and 8.4% haemorragic transformation (4.3% symptomatic). 53.65% were functionally independent (mRS equal or less than 2) to three months. The mortality was 10.86%. 29.3% patients were transferred to the stroke centre. 119 patients received endovascular treatment: PA patients 74 (63.1%), TMH patients 25 (20.5%) and nonTM patients 20 (16.4%). TMH and PA patients had similar clinical improvement (61 vs. 63.8%; p=0.51) and good functional outcome (36.8 vs. 35.3%; p=0.722). Conversely, nonTMH patients presented a lesser degree of clinical improvement (31.3%) and poorer functional outcome (15.8%) than TMH (p = 0.019 and p = 0.046) and PA patients (p=0.05 and p=0.013). TMH patients had significantly shorter door-to-groin puncture times (47 vs. 69 min; p=0.047). Conclusions: Telemedicine: 1.) improves the quality of care administered to acute stroke patients admitted to a community hospital; 2.) allows to administer thrombolytic treatment at a distance; 3.) is an indispensable tool for select patient to transfer to the stroke centre for endovascular procedures.

El término esquizoafectivo fue introducido por J. Kasanin en 1933, para describir a un grupo de pacientes que no encajaban ni con el diagnóstico de esquizofrenia ni en el de las psicosis maníaco-depresivas. La nosología del trastorno esquizoafectivo siempre ha sido un tema controvertido y se han llevado a cabo pocos estudios que hayan sido útiles para clarificarla. El objetivo de la presente tesis es estudiar las bases neurobiológicas de esta enfermedad, evaluando las alteraciones que aparecen tanto en las fases de descompensación como los cambios a nivel longitudinal. Este trabajo está compuesto por dos estudios que usan la resonancia magnética funcional para examinan a un grupo de pacientes con trastorno esquizoafectivo, tipo bipolar, diagnosticados según los criterios RDC y DSM-IV. Los pacientes fueron comparados con un grupo de sujetos sanos, apareados por edad, sexo y CI pre-mórbido. A todos los sujetos se les realizó al menos un escáner, mientras realizaban una tarea de memoria de trabajo ‘N-back’. Paralelamente, se realizó un estudio neuropsicológico, evaluando la memoria y función ejecutiva. Se obtuvieron los mapas de activación y desactivación cerebral mediante un modelo lineal general y se realizó un análisis longitudinal de medidas repetidas. En el primer estudio transversal, se examinaron los patrones de activación cerebral durante un episodio de descompensación, esquizomaníaco o esquizodepresivo. Los pacientes mostraron una hipoactivación del DLPFC, así como un déficit en desactivar la corteza frontal medial, comparado con los sujetos sanos. Esta última región corresponde al nodo anterior de la red neuronal por defecto o DMN. En el segundo estudio, los mismos pacientes fueron revaluados tras alcanzar la remisión clínica, definida como un periodo de eutimia superior a dos meses. El subgrupo de pacientes esquizomaníacos mostró una hipoactivación frontal en la fase aguda que revirtió al alcanzar la eutimia. Por el contrario, en el subgrupo de pacientes esquizodepresivos no se observaron diferencias entre la fase aguda y la remisión clínica. Al comparar todos los pacientes esquizoafectivos en remisión clínica con los sujetos sanos, los pacientes mostraron un déficit en desactivar la corteza frontal medial, indicando una disfunción del DMN. En el segundo estudio también se evaluó la memoria y función ejecutiva. En ambas pruebas, todos los pacientes en remisión clínica mostraron un menor rendimiento en comparación al grupo de sujetos sanos. En el subgrupo de pacientes esquizomaníacos mejoró la memoria al alcanzar la remisión clínica, sin embargo, no hubo cambios en la función ejecutiva. Por el contrario, en el subgrupo de pacientes esquizodepresivos no se encontraron diferencias significativas entre la fase aguda de la enfermedad y la remisión clínica. Globalmente, los resultados de la presente tesis sugieren que las fases agudas del trastorno esquizoafectivo se caracterizan por una hipoactivación del DLPFC. Esta alteración equipara el trastorno esquizoafectivo con la esquizofrenia y el trastorno bipolar, en los cuales la hipoactivación del DLPFC ha sido también descrita. Por otro lado, el fracaso en desactivar la corteza frontal medial, apareció tanto en la fase aguda como la fase de remisión clínica, independientemente del estado psicopatológico, sugiriendo una disfunción del DMN, como factor de rasgo intrínseco a la enfermedad. La disfunción del DMN ha sido previamente descrita en otras patologías psiquiátricas, entre las que se encuentran la esquizofrenia y el trastorno bipolar. Otro hallazgo de la presente tesis, son las alteraciones cognitivas en los pacientes esquizoafectivos, presentes tanto en las fases agudas, como en los periodos de eutimia. Únicamente se objetivó una mejora parcial en la memoria en el subgrupo de pacientes esquizomaníacos al alcanzar la eutimia. / The term schizoaffective psychosis was introduced by Kasanin in 1933 to describe the apparent occurrence of patients who did not fit into the category of either schizophrenia or manic-depressive psychosis. Ever since, its nosology has been a matter of controversy and studies have been scarce dedicated to shed light into the neurobiology of this disorder. The present thesis aimed to add insight to the literature of neurobiological underpinnings of schizoaffective disorder, taking into account also longitudinal aspects of the disease. Specifically, the thesis reports two fMRI studies which examined a sample of patients meeting both RDC and DSM-IV criteria for schizoaffective disorder, bipolar type. This patient sample was compared with age, sex and premorbid-IQ matched healthy controls. All subjects underwent at least one fMRI scan, during performance of the n-back working memory test. Additionally, memory and executive functioning were assessed. Linear models were used to obtain maps of activations and de-activations in the groups. The first study was a cross-sectional study evaluating patterns of brain activation and de-activation in acute schizomanic or schizodepressive schizoaffective patients. Compared to controls, the schizoaffective patients showed a reduced activation in the DLPFC and also a failure of de-activation in the medial frontal cortex. This latter area corresponds to the anterior node of the DMN. In the second study the same patients were reassessed after at least two months of clinical remission. The subgroup of schizomanic patients were found to show a reversible frontal hypoactivation during n-back performance when compared to clinical remission, while no changes in the brain response to the task were seen in schizodepressive patients in comparison to clinical remission. The whole group of schizoaffective patients in clinical remission showed a failure of de-activation in the medial frontal cortex compared to the healthy controls. The cognitive assessment in the second study showed that schizomanic patients improved in memory but not in executive functioning from active illness to remission, while schizodepressive patients did not show changes in either domain. All schizoaffective patients in clinical remission continued to show memory and executive impairment compared to the controls. Overall, the present thesis suggests that DLPFC hypoactivation is a state feature of schizoaffective disorder. This finding aligns it with schizophrenia but also with bipolar disorder, where reduced DLPFC activity has also been described. Failure of de-activation, and by extension DMN dysfunction, appeared across all different phases of the disorder, as a trait feature of the illness. DMN dysfunction has also been described in a range of psychiatric disorders, including schizophrenia and bipolar disorder. Cognitive impairment was a further finding of this thesis. There was some evidence of memory improvement in euthymic schizomanic patients, but this was partial and the patients still showed deficits in remission, in particular executive dysfunction.

Objetivo: El propósito de este estudio fue conocer las posibles variables predictivas psicopatológicas y cognitivas asociadas a la mala respuesta al tratamiento con metilfenidato (MPH) en niños con Trastorno por Déficit de Atención e Hiperactividad (TDAH). Métodos: La muestra estuvo constituida por setenta y siete pacientes ambulatorios con TDAH de entre 5 y 14 años de edad, sin historia previa de medicación y sin comorbilidad psiquiátrica. Fue un estudio abierto donde todos los sujetos recibieron tratamiento con MPH, durante 4 semanas. Los criterios de respuesta elegidos a priori consistían en (1) Clinical Global Impression-Severity scale ≤ 3 y (2) Children‟s Global Assessment Scale > 70 a las 4 semanas. Las variables psicopatológicas se evaluaron mediante cuestionarios contestados por los padres en The Child Behavior Checklist y síntomas de labilidad emocional en la Conners‟ Parent Rating Scale ítems “llora con facilidad”, “malhumorado y resentido” y “cambios de humor rápido” con puntuaciones ≥ 2. Las pruebas neuropsicológicas utilizadas incluyeron la Wechsler Intelligence Scale for Children y el Conners‟ Continuous Performance Test para medir las variables cognitivas. Mediante un análisis de regresión lineal multivariado, se compararon variables sociodemográficas, características clínicas y función cognitiva en situación basal según la buena o mala respuesta al MPH. Resultados: Cincuenta y dos sujetos (67,5%, 40 varones, edad media 9,27 ± 2,46) cumplieron criterios de buena respuesta, con mejoría significativa en las puntuaciones Clinical Global Impression-Severity scale y Children‟s Global Assessment Scale (p < 0,001). Veinticinco sujetos (32,5%, 19 varones, edad media 7,76 ± 1,5) obtuvieron mala respuesta. Los resultados de las variables psicopatológicas obtenidos en la The Child Behavior Checklist mostraron que los problemas de ansiedad (OR = 6,36, p = 0,016), agresividad (OR = 5,50, p = 0,024), externalización (OR = 5,50, p = 0,024), los problemas totales (OR = 3,96, p = 0,046) y la DESR severa (OR = 4,12, p = 0,048) se asociaron significativamente al grupo de niños con mala respuesta al MPH. Los resultados en la Conners‟ Parent Rating Scale mostraron que la presencia del síntoma ―malhumorado y resentido‖ (OR = 6,56, p = 0,015) y la simultaneidad de los tres síntomas de labilidad emocional grave (OR = 6,96, p = 0,013), se asociaron significativamente al grupo de niños con mala respuesta. En relación a las variables cognitivas, las puntuaciones medias basales no mostraron diferencias significativas entre el grupo de buena respuesta (Capacidad Intelectual Total = 93,31) y el grupo de mala respuesta (Capacidad Intelectual Total = 86,96). Tampoco mostraron diferencias significativas las puntuaciones medias del Conners‟ Continuous Performance Test. En relación a los datos sociodemográficos, las variables con diferencias significativas fueron la edad y el antecedente de institucionalización. Conclusiones: Los datos del estudio demuestran que el MPH es efectivo para el tratamiento del TDAH. Sin embargo, esta efectividad se reduce cuando se trata de niños con TDAH con graves problemas de conducta y de las emociones, percibidos por los padres, en especial la disregulación emocional y la labilidad emocional. Además se demuestra que para los niños de menor edad, la efectividad del MPH es menor. Implicaciones clínicas: Este estudio evidencia que los niños con TDAH y disregulación emocional, presentan menor efectividad al tratamiento con MPH. Además apoya la idea de que un enfoque dimensional en el proceso diagnóstico puede ayudar a determinar la respuesta al MPH. Por otro lado, demuestra que la edad es una variable predictiva de respuesta al MPH. / Objective: The purpose of this study was to determine the possible psychopathological and cognitive predictors associated with poor response to treatment with methylphenidate (MPH) in children with Attention Deficit Hyperactivity Disorder (ADHD). Methods: The sample consisted of seventy-seven outpatients with ADHD aged 5 to 14 years old with no history of medication without psychiatric comorbidity. This was an open study and all subjects received treatment with MPH for 4 weeks. Response criteria chosen a priori were to (1) Clinical Global Impression-Severity scale ≤ 3 and (2) Children‟s Global Assessment Scale > 70 at 4 weeks. Clinical variables were assessed using questionnaires completed by parents as The Child Behavior Checklist and emotional lability scores ≥ 2 and Conners‟ Parent Rating Scale items “cries easily or often”, “angry and resentful” and “mood changes quickly and drastically”. Neurophychological test used for measure cognitive variables were Wechsler Intelligence Scale for Children and Conners‟ Continuous Performance Test. Using a multivariate linear regression analysis, demographic variables, clinical characteristics and cognitive function at baseline were compared according to the good or poor response to MPH. Results: Fifty-two subjects (67.5%, 40 males, mean age 9.27 ± 2.46) met good response criteria, with significant improvement in Clinical Global Impression-Severity scale and Children‟s Global Assessment Scale (p < 0.001) scores. Twenty five subjects (19 males, mean age 7.76 ± 1.5) had poor response. Psychopathological variables results obtained in The Child Behavior Checklist showed that anxiety problems (OR = 6.36, p = 0.016), aggression (OR = 5.50, p = 0.024), externalizing problems (OR = 5.50, p = 0.024), total problems (OR = 3.96, p = 0.046) and severe dysregulation (OR = 4.12, p = 0.048) were significantly associated with poor response to MPH. Conners‟ Parent Rating Scale results showed that “angry and resentful” symptom (OR = 6.56, p = 0.015) and severe emotional lability three symptoms simultaneously (OR = 6.96, p = 0.013) were significantly associated with poor response to MPH. Regarding cognitive variables, mean baseline scores did not show significantly differences between good response group (Total Intellectual Capacity = 93.31) and poor response group (Total Intellectual Capacity = 86.96). Furthermore, Conners‟ Continuous Performance Test did not show significantly differences in both groups. The age and the institutionalization were significantly associated with poor response to MPH. Conclusions: The study data shows that MPH treatment is effective in ADHD disorder. However, this effectiveness decrease in ADHD children with emotion dysregulation based on parent-reported problems in The Child Behavior Checklist and emotional lability in the Conners‟ Parent Rating Scale. Furthermore, the study shows that MPH treatment is less effective with early childhood and with institutionalization background. Clinical Implications: This study shows evidence that children with ADHD and Emotional Dysregulation exhibit poor response to MPH. Additionally; it supports the idea that a dimensional diagnostic process can help to determine MPH response. Furthermore, the age is considered as a predictor of treatment response.

La vía de la fosfoinositol 3 quinasa (PI3K) desempeña un papel crucial en el control de la supervivencia y diferenciación neuronales. PDK1 es una quinasa master esencial que, en respuesta a la activación de PI3K, activa un elevado número que quinasas de la família Agc, incluidas las isoformas de PKB/Akt. La activación de Akt por PDK1 depende de la interacción de los dominios PH presentes en ambas quinasas con PtdIns(3,4,5)P3, el producto de la PI3K. La resolución de la estructura cristalográifca del dominio PH de PDK1 permitió el diseño de una mutación puntual dirigida, Lys 465 a Glu, que impide la interacción del dominio PH de PDK1 con PtdIns(3,4,5)P3. Los ratones PDK1K465E/K456E eran viables aunque pequeños y presentaban una modesta reducción de la activación de Akt comparados con los ratones control. Por el contrario, el resto de quinasas reguladas por PDK1, como RSK, S6K o SGK de activaban con normalidad. Nuestros estudios previos demostraron que la supervivencia neuronal no estaba afectada en el ratón PDK1K465E/K465E, a pesar de que la activación de Akt estaba claramente reducida. Incluso tras el tratamiento con el compuesto inhibidor de Akt1 y Akt2 Akti-1/2, las neuronas corticales eran sorprendentemente capaces de sobrevivir. Es por ello que se propusoq eu Akt3 podria tener un papel central en el control de la supervivencia neuronal. Los resultados de este estudio demuestran que la activación de PKB/Akt en el córtex estaba menos comprometida que en tejidos de respuesta a insulina en el ratón PDK1K465E/K465E. se analizó la actividad de las tres isoformas de Akt, y se demostró que la actividad de PKBγ/Akt3 estaba preservada en comparación con PKBα/Akt1 or PKBβ/Akt2 el ratón PDKK465E/K465E, y que la proporción de actividad Akt3 es más elevada en neuronas que en otros tipos celulares, en el ratón PDK1K465E/k465E. PKBβ/Akt2 representa tan solo una pequeña fracción de la actividad PKB/Akt total en neuronas corticales lo que no hace pensar que tenga un papel esencial en el control de la supervivencia neuronal. Además, experimentos de interferencia de RNA demuestran que la inhibición de Akt1 y Akt3 compromete la supervivencia neuronal en el ratón PDK1K465E/K465E, mientras que la inhibición de Akt2 no tiene consecuencias. Se propone así un modelo cuantitativo de regulación de la supervivencia neuronal por Akt por el que Akt1 y Akt3 juegan un papel más importante en supervivencia porque representan un elevado porcentaje de la actividad Akt total. Además, se demuestra en esta tesis un nuevo mecanismo de activación de PKB/Akt en el ratón PDK1K465E/K465E por el que en ausencia de unión a PtdIns(3,4,5)P3 PDK1 puede aún interaccionar directamente con Akt y activarla. / The phosphoinositide 3-kinase (PI3K) signaling pathway plays a central role in promoting neuronal survival and differentiation. PDK1 is a crucial master kinase that, in response to PI 3-kinase activation, switches on a number of AGC-kinase family members including PKB/Akt. Activation of Akt by PDK1 relies on the interaction of the PH domains present on both kinases with PtdIns(3,4,5)P3, the PI 3-kinase product. Crystal structure high-resolution of the PDK1 PH-domain allowed the design of a specific point mutation, Lys 465 to Glu, impairing the interaction of the PH-domain with PtdIns(3,4,5)P3. The PDK1K465E/K456E mice were shown to be viable but smaller, with a modest reduction in Akt activity compared with the wild type mice. By contrast, other PDK1 target such as RSK, S6K or SGK isoforms remained unaffected. Our former studies have indicated that neuronal survival was not compromised in the PDK1K465E/K465E mice, although activation of Akt was obviously reduced. Even after treated with the Akti-1/2 inhibitor, cortical neurons were still surprisingly capable to survive. Regarding this, I proposed that Akt3 plays key role in regulating neuronal survival. The results of my study indicate that the PKB/Akt activation in cortex was less reduced than in insulin responsive tissues in the PDK1K465E/K465E mice. I further analyze the activity of different Akt isoforms, and I found that PKBγ/Akt3 activity was preserved compared with PKBα/Akt1 or PKBβ/Akt2 in the PDKK465E/K465E mice, and also that the proportion of Akt3 phosphorylation at the PDK1 site is much higher in neurons than in other tissues in the PDK1K465E/k465E mice. The PKBβ/Akt2 only accounted for a small fraction of the total PKB/Akt activity in cortical neurons, which implies unimportant role in regulating the neuronal survival. Furthermore, The data from Akt shRNA interference and Hoechst assays demonstrate that the percentage of apoptotic cells was increased by Akt1 and Akt3 shRNAs infection in cortical neurons In the PDK1K465E/K465E mice, whereas Akt2 down-regulation had no significant effects on neuronal apoptosis. Here I proposed a model that the neuronal survival was regulated by PKB/Akt isoforms in a quantitative manner. Because of the high proportion of Akt phosphorylation at Thr 8/9 sites, Akt1 and Akt3 might play more important roles than Akt2 in neuronal survival. Besides this, I also uncovered a novel mechanism in the activation of PKB/Akt in the PDK1K465E/K465E mice, In which PDK1 can take advantage of the docking site mechanism to activate Akt, in spite of the absence of PtdIns(3,4,5)P3 binding.

En el organismo modelo Xenopus laevis, los oocitos de estadio VI están parados indefinidamente en la profase (G2/M) de la meiosis I hasta que se produce una adecuada estimulación hormonal. Una red de regulación positiva alrededor de la cascada Mos/MEK/ERK asegura la maduración (GVBD) de los oocitos tras la estimulación con progesterona. Sin embargo, el papel de las MAPK de estrés JNK y p38 en la progresión meiótica no es tan claro. Aquí analizamos una proteína de 42 kDa detectada con anticuerpos pJNK (XpJNK-p42) que aparece alrededor del GVBD en oocitos tratados con progesterona. La expresión ectópica de MEKK1 constitutivamente activo acelera la maduración de los oocitos mediante la activación de las vías de señalización de p38 y ERK, pero no de la cascada JNK. Por otra parte, cuatro transcritos diferentes de JNK3 presentes en los oocitos no sintetizan proteína y no se activan durante la maduración inducida por progesterona. El análisis de espectrometría de masas indica que XpJNK-p42 es en realidad ERK2 fosforilado. Curiosamente, el anticuerpo pJNK sólo reconoce pERK2 en oocitos maduros pero no en oocitos expuestos al shock hiperosmótico, lo que sugiere que una modificación post-traduccional de pERK2 tiene lugar durante la progresión meiótica. Es importante destacar que ni la sobreexpresión de ERK2 ni el inhibidor de JNK SP600125 afectan a la fosforilación de c-Jun utilizando extractos de oocitos maduros. En conclusión, las proteínas JNK no están involucradas en la maduración de los oocitos de Xenopus, y la fosforilación de c-Jun detectada en oocitos maduros es independiente de JNK y ERK2. Hemos descrito previamente que el shock hiperosmótico induce apoptosis en oocitos de Xenopus mediante la activación de cuatro vías independientes: p38, JNK, calpainas y liberación de Smac/DIABLO. También hemos descrito que la activación de p38, JNK1-1 y JNK1-2 es claramente pro-apoptótica. Sin embargo, varias horas después del shock hiperosmótico la isoforma JNK1-2 desaparece, sugiriendo algún tipo de degradación. Además, los estudios anteriores no consideraron el papel de los miembros de la familia de Bcl-2 en la apoptosis inducida por estrés osmótico. Aquí mostramos que pJNK1-2 es proteolizada en Asp385 por caspasa-3, y que la proteína resultante acelera la liberación del citocromo c y la activación de caspasa-3, creando así un bucle de retroalimentación positiva. También mostramos que la sobreexpresión de Bcl-xL en oocitos de Xenopus protege a estos de la apoptosis inducida por shock hiperosmótico. Los oocitos que expresan Bid en combinación con Bcl-xL, presentan tres formas distintas de Bid: no ubiquitinada, mono- y biubiquitinada. Todas las formas de Bid se localizan en el citosol y la mitocondria. El shock hiperosmótico incrementa ligeramente, y de forma rápida, las formas mono- y biubiquitinadas de Bid en la mitocondria. Posteriormente, una pequeña parte de Bid es proteolizada en Asp52, probablemente por una caspasa iniciadora, generando un fragmento N-terminal (nBid) y un fragmento C-terminal altamente pro-apoptótico (tBid). Cuando el citocromo c es liberado y se activa la caspasa-3 se produce una proteólisis masiva de Bid (formas no ubiquitinada y monoubiquitinada) en Asp52, mediada por caspasa-3, creando así otro bucle de retroalimentación positiva. Aunque algunos experimentos sugieren que la forma no ubiquitinada de Bid se proteoliza más rápido y es más pro-apoptótica que las otras formas, los efectos funcionales de la ubiquitinación en la regulación de la apoptosis no son tan claros. Sin embargo, la función pro-apoptótica de Bid se atenúa notablemente en el mutante Bid-D52N, que no puede ser proteolizado por caspasas. En conclusión, la activación de caspasa-3 inducida por shock hiperosmótico pone en marcha dos bucles de retroalimentación positiva mediante la proteólisis de JNK1-2 y Bid, promoviendo así la muerte irreversible de los oocitos. / In the model organism Xenopus laevis, oocytes at stage VI are standing in prophase (G2/M) of meiosis I indefinitely until proper hormone stimulation. A positive regulation network around the Mos/MEK/ERK cascade ensures the rapid maturation (GVBD) of the oocytes upon stimulation with progesterone. However, for the stress associated MAPK families, JNK and p38, their involvement in meiotic resumption is not so clear. Here we analyze a protein of 42 kDa detected by pJNK antibodies (XpJNK-p42) that appears around GVBD in progesterone treated oocytes. Ectopic expression of a constitutively active MEKK1 accelerates oocyte maturation through activation of the p38 and ERK signaling pathways, but not the JNK cascade. Moreover, four dormant JNK3 transcripts are described in Xenopus oocytes and none of them are activated during progesterone-induced oocyte maturation. Protein mass spectrometry analysis indicates that XpJNK-p42 is actually phosphorylated ERK2. Intriguingly, the pJNK antibody only recognizes pERK2 in mature oocytes but not in oocytes exposed to hyperosmotic shock, suggesting that a posttranslational modification of pERK2 occurs during meiotic progression. Importantly, neither ERK2 overexpression nor JNK inhibitor SP600125 affects c-Jun phosphorylation detected in mature oocytes extracts. In conclusion, JNK proteins are not involved in Xenopus oocyte maturation, and the phosphorylation of c-Jun detected in mature oocytes is independent of JNK and ERK2. We previously reported that hyperosmotic shock induces apoptosis in Xenopus oocytes through activation of four independent pathways: p38, JNK, calpains and Smac/DIABLO release. We also reported that activation of p38β, JNK1-1, and JNK1-2 is clearly pro-apoptotic. However, several hours after hyperosmotic shock the JNK1-2 isoform disappears, suggesting some type of degradation during cell death. In addition, our previous studies did not address the role of the Bcl-2 family members in the regulation of cytochrome c release. Here we show that Xenopus pJNK1-2 is proteolyzed at Asp385 by caspase-3, and the resulting cleaved protein accelerates cytochrome c release and caspase-3 activation, thus creating a positive feedback loop. We also show that overexpression of Bcl-xL in Xenopus oocytes protect from osmostress-induced apoptosis. In oocytes expressing Bid in combination with Bcl-xL, three different types of Bid are detected: non-ubiquitinated Bid, mono- and bi-ubiquitinated Bid. All Bid types reside both in the cytosol and the mitochondria. Hyperosmotic shock rapidly induces a slight increase of mono- and bi-ubiquitinated Bid in the mitochondria. Subsequently, Bid is cleaved at Asp52 at very low levels, probably by an initiator caspase, generating an N-terminal fragment (nBid) and a highly pro-apoptotic C-terminal fragment (tBid). When cytochrome c is released and caspase-3 is activated a massive proteolysis of non-ubiquitinated and mono-ubiquitinated Bid occurs at Asp52, mediated by caspase-3, thus creating another positive feedback loop. Although some experiments suggest that non-ubiquitinated Bid is proteolyzed faster and is more pro-apoptotic than wild type Bid, the functional effects of Bid ubiquitination are not so clear. However, the pro-apoptotic function of Bid is markedly attenuated in mutant Bid-D52N that is not cleaved by caspases, indicating that Bid proteolysis regulates osmostress-induced apoptosis. In conclusion, caspase-3 activation induced by hyperosmotic shock engages two positive feedback loops through the cleavage of JNK1-2 and Bid, thus promoting an irreversible death of the oocytes.