Universiẗat, Diss., 2005--Heidelberg.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-08Bitstream added on 2014-06-13T20:29:46Z : No. of bitstreams: 1 savassa_sm_me_araiq_parcial.pdf: 560908 bytes, checksum: 7322d6c1907899887286e7c9514807e4 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-07-02T12:36:14Z: savassa_sm_me_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-02T12:37:34Z : No. of bitstreams: 1 000719185_20180101.pdf: 541449 bytes, checksum: 71b832c9a74978e0b6356b081a51d520 (MD5) Bitstreams deleted on 2018-01-02T17:04:40Z: 000719185_20180101.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2018-01-02T17:05:45Z : No. of bitstreams: 1 000719185.pdf: 3296921 bytes, checksum: 3209de8217c724ff260135d1572d7752 (MD5) / O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo muito utilizado para estudos de diversos aspectos da biologia dos eucariotos. Nosso laboratório tem utilizado este fungo para o estudo dos mecanismos moleculares e bioquímicos da regulação do metabolismo de glicogênio. A presente proposta de trabalho é uma consequência de experimentos anteriores realizados com o objetivo de identificar proteínas (fatores de transcrição ou não) que se ligam à região promotora do gene gsn, o qual codifica a enzima glicogênio sintase, regulatória do processo de síntese do carboidrato. Esses estudos combinaram experimentos de ensaios de retardamento em gel utilizando fragmentos do promotor gsn e proteínas do extrato total do fungo, acoplados à análise proteômica e identificação das proteínas por espectrometria de massas. Os experimentos resultaram na identificação de algumas proteínas do fungo, as quais podem ou não estar envolvidas na regulação da expressão do gene. Alguns estudos preliminares com estas proteínas foram anteriormente realizados no laboratório e apontaram um provável papel das mesmas na regulação do metabolismo do carboidrato em N. crassa. Duas dessas proteínas, as codificadas pelas ORFs NCU3482 e NCU06679 foram objeto de estudo neste trabalho. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização das linhagens mutantes nestas ORFs, além da produção e purificação das proteínas na forma recombinante. Foram realizadas análises morfológicas da linhagem mutante na ORF NCU06679, tais como: crescimento colonial e radial, crescimento linear e análise microscópica das extremidades das hifas. Esses experimentos foram realizados em comparação com a linhagem selvagem do fungo e, mostraram esta proteína está envolvida no processo de desenvolvimento do... / The fungus Neurospora crassa has been widely used as a model organism for fundamental aspects of eukaryotic biology. We have been studying the biochemical and molecular mechanisms involved in glycogen metabolism regulation in this fungus. The present work is a consequence of previous experiments performed in the laboratory to identify proteins that bind to the promoter region of the gsn gene which encodes glycogen synthase, the regulatory enzyme in glycogen synthesis. Previous studies were performed by using a combination of DNA gel shift assay coupled to proteomic analysis, followed by identification of proteins by mass spectrometry. The assays resulted in the identification of proteins likely involved in the regulation of gene expression. Preliminary studies with these proteins have previously been carried out and suggested that they might have a role in the regulation of glycogen metabolism in N. crassa. Two of them, the ORFs NCU3482 and NCU06679 gene products were object of study in this work. The main objective was to characterize the mutant strains in both proteins and to produce and purify the recombinant proteins. Morphological analyzes were performed in the ORF NCU06679 mutant strain such as colony and radial linear growth and microscopic examination of the ends of the hyphae. These experiments showed that this protein is involved in the fungus development since growth and ability to conidiate were deficient when compared to the wild-type strain. The expression of gsn and gpn (encodes glycogen phosphorylase, the regulatory enzyme in glycogen degradation) genes were analyzed by qPCR and the results showed differences in gene expression of both genes during vegetative growth of the NCU06679 mutant strain when compared to the wild-type strain. The protein encoded by ORF NCU06679 was produced as a recombinant protein and the purification... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Banca: Ana Paula Ulian de Araújo / Banca: Fábio Marcio Squina / Banca: Rolf Alexander Prade / Resumo: Este trabalho descreve a caracterização funcional de alguns fatores de transcrição possivelmente envolvidos na regulação do metabolismo do glicogênio no fungo filamentoso Neurospora crassa. Em uma análise sistemática realizada com 69 linhagens mutantes em genes codificadores para fatores de transcrição, foram identificadas e selecionadas sete linhagens que apresentaram perfis diferentes de acúmulo de glicogênio, em relação à linhagem selvagem, tanto durante o crescimento vegetativo (30°C) como no estresse térmico (45°C). Com o objetivo de verificar o envolvimento dos fatores de transcrição selecionados na expressão dos genes gsn (glicogênio sintase) e gpn (glicogênio fosforilase), experimentos de Northern blot foram realizados e revelaram variações ao nível transcricional em algumas linhagens. A análise por Blast revelou que alguns fatores de transcrição haviam sido previamente estudados em N. crassa (CSP-1, RCO-1, NIT2) ou em outros organismos (PacC, FlbC, Fkh1) e participam na regulação de diferentes processos biológicos. O fator de transcrição PACC e a influência do pH externo sobre a regulação do metabolismo do glicogênio foram investigados mais detalhadamente neste trabalho. Os resultados mostraram que na linhagem selvagem o acúmulo de glicogênio e a expressão do gene gsn foram reprimidos em condições de pH alcalino, enquanto que o gene pacC foi superexpresso nesta condição. A linhagem mutante pacCKO mostrou perder a regulação sobre o acúmulo de glicogênio e expressão do gene gsn, tanto durante o crescimento em pH fisiológico (5,8) como alcalino (7,8). A análise de ligação DNA-proteína mostrou que a proteína PACC de N. crassa recombinante produzida em E. coli foi capaz de se ligar ao motif de DNA para a proteína PACC, presente na região promotora do gene gsn... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This work describes the functional characterization of transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation in the filamentous fungus Neurospora crassa. In a systematic analysis performed with 69 strains knocked-out in genes encoding transcription factors, seven strains were identified and selected by presenting profiles of glycogen accumulation different from that existent in the wild-type strain during vegetative growth (30°C) and under heat stress (45°C). In order to verify the involvement of the selected transcription factors in regulation of gsn (codes for glycogen synthase) and gpn (codes for glycogen phosphorylase) genes, Northern blot assays were performed. Differences in gene expression were observed in some strains compared to the wild-type strain. Blast analysis showed that transcription factors have been previously studied either in N. crassa (CSP-1, RCO-1, NIT2) or in other organisms (PacC, FlbC, Fkh1) participating in the regulation of different biological processes. The transcription factor PACC and the influence of the external pH under the regulation of the glycogen metabolism were further investigated. The results showed that in the wild-type strain the glycogen content and the gsn gene expression were repressed under alkaline conditions, while the pacC gene was overexpressed in this condition. The pacCKO strain showed impairments in the glycogen accumulation and gsn gene expression under normal pH (5.8) and alkaline (7.8) conditions. Protein-DNA binding analysis showed that N. crassa PACC recombinant protein produced in E. coli cells was able to bind to the pacC motif present in the gsn promoter. Binding specificity was confirmed by competition assays using an oligonucleotide containing the DNA motif and by binding to a DNA fragment containing the motif mutated by site-directed mutagenesis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Vanderlei Perez Canhos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-26T05:43:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Costa_ArgentinaSampaio_D.pdf: 3583472 bytes, checksum: 141d7e7d0a97209e763b1d63b2769a7b (MD5) Previous issue date: 1999 / Resumo: Foi efetuado um estudo taxonômico de vinte e duas linhagens de Neurospora isoladas de beiju de mandioca e vegetação queimada nos Estados do Maranhão e São Paulo. As linhagens estudadas foram caracterizadas quanto à sua morfologia, perfil de proteínas totais, polimorfismos e fragmentos do rDNA 188,288, região espaçadora 188­288 e do gene histona H3-1, e produção de aroma. Foram incluídas neste estudo 7 linhagens de referência de 4 espécies de Neurospora: N crassa NRRL 2223, CCT 2680 (=ATCC 24698); N. sitophila ATCC 46892 (produtora de aroma), NRRL 2884 (=ATCC 36935, =CCT 0045); N. intermedia NRRL 5506 (N. sitophila ATCC 56753) e N. tetrasperma NRRL 2164. Os resultados obtidos na análise das características morfológicas sugerem que os isolados pertencem a 7 espécies diferentes. As linhagens obtidas do Maranhão foram identificadas como N. sitophila, com exceção de AC9, identificada como N crassa, enquanto que os isolados do Estado de 8ão Paulo apresentaram uma maior diversidade de espécies: N. sitophila, N. crassa, N tetrasperma, N. dodgei, N. galapogensis, N. africana e N. lineolata. As análises dos perfis de proteínas totais corroboraram os resultados da análise morfológica. Os resultados da análise de proteínas totais, assim como os de digestão da região espaçadora 188-288 com a endonuclease Ava II, permitiram agrupar a linhagem N. sitophila ATCC 46892 produtora de aroma e isolados obtidos do mesmo susbstrato (beiju de mandioca) e local (Maranhão). Estas linhagens formaram um grupo distinto das linhagens de referência e dos demais isolados. A digestão do rDNA 18S com a enzima de restrição Hae III resultou em padrões diferentes para as três linhagens de referência em estudo. A linhagem produtora de aroma N sitophila A TCC 46892 apresentou o mesmo padrão de restrição que as linhagens de referência N crassa NRRL 2223 e CCT 2680, assim como a maioria dos demais isolados. As linhagens AC4 e AC15 apresentaram padrão de restrição igual ao de N tetrasperma NRRL 2164. Os perfis de restrição do gene da proteína histona, his-3 obtido com as enzimas Dde I e Hae III, permitiram a diferenciação das duas espécies N. sitophila NRRL 2884, CCT 0045 e N. crassa NRRL 2223, CCT 2680. A linhagem N sitophila ATCC 46892 produtora de aroma, as linhagens N crassa NRRL 2223, CCT 2680, e as linhagens de Neurospora isoladas do mesmo local (Maranhão) apresentaram perfis idênticos de restrição. Os fragmentos amplificados na região conservada 288 não apresentaram polimorfismo com nenhuma das enzimas em estudo. Os resultados da avaliação sensorial indicaram que as linhagens de Neurospora isoladas do beiju de mandioca, apresentam características aromáticas muito semelhantes à da linhagem produtora de aroma de frutas N sitophila ATCC 46892. Os métodos moleculares e a taxonomia polifásica forneceram informações referentes ao grupo de linhagens de Neurospora obtidas do mesmo substrato da linhagem produtora de aroma N. sitophila ATCC 46892, reforçando o uso desses métodos na caracterização de microrganismos associados à produção de aroma, podendo auxiliar na escolha de linhagens para futuros estudos envolvendo a produção e aplicação tecnológica / Abstract: Polyphasic taxonomic studies were done with twenty-two Neurospora strains isolated from cassava beiju and burned vegetation in Maranhão and São Paulo states. Strains were characterized regarding morphology, protein profiles and polymorphisms of 18S, 28S and 18S-28S rDNA spacer fragment, histone H3-1 gene, and aroma production. References strains: N crassa NRRL 2223, CCT 2680 (=ATCC 24698); NRRL 2884 (=ATCC 36935), CCT 0045 (=NRRL 2884); N. intermedia (N. sitophila ATCC 36935) N. sitophila ATCC 46892 (aroma producer) and N. tetrasperma NRRL 2164, were also studied. Results obtained from morphological analyses suggested that the isolates comprised 7 different species. Strains from Maranhão were identified as N. sitophila but, except for strain AC9, identified as N. crassa, whereas isolates from São Paulo were assigned to N. africana, N. crassa, N. dodgei, N. galapogensis, N. lineolata, N. sitophila, and N. tetrasperma. The analyses of total protein profiles agreed with the results from morphological analysis. Analysis of total protein profiles as well as spacer region digestion with Ava II endonuclease allowed the grouping of N sitophila A TCC 46892 aroma producer strain with the isolates of Neurospora spp. originated of same substrate (cassava beiju) and local (Maranhão). These strains formed a group distinct from the reference strains and from the others isolates. Digestion of 18S rDNA with restriction enzyme Hae III resulted in different patterns for the three reference strains in study. N sitophila ATCC 46892 aroma producer strain, reference strains N. crassa NRRL 2223, CCT 2680 and most of the isolates presented the same restriction patterns. AC4 and AC15 strains and the N. tetrasperma NRRL 2164 reference strain presented identical restriction patterns. Restriction profiles of the histone protein gene, his-3 obtained with Dde I and Hae III enzymes allowed the differentiation of the two species N. sitophila NRRL 2884, CCT 0045 and N. crassa NRRL 2223, CCT 2680. N. sitophila ATCC 46892 aroma producer strain, N crassa NRRL 2223, CCT 2680 strains and Neurospora strains isolated from same local (Maranhão) presented identical restriction pattern. Amplified fragments from 28S rDNA conserved region with studied enzymes did not present polymorphism. Sensorial evaluation indicated that Neurospora strains isolated of cassava beiju show aromatic characteristics similar to that of N sitophila ATCC 46892, producer of fruit aroma strain. Molecular methods and the polyphasic taxonomy provided information for the Neurospora group originated from the same substrate of the N. sitophila ATCC 46892 aroma producer strains. These methods corroborate characterization of microorganisms associated to production of aroma, and could was be collaborate useful with selection of strains for future studies related with technological production and application / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

<p> This thesis proposed to analyse the recombination, complementation and biosynthetic implications of a series of hitherto unstudied carotenoidless mutant strains of Neurospora crassa and to confirm the reports of previous authors through analysis of a number of their mutant strains. A new selective technique permitted the fine structure analysis of the locus. Complementation studies with an extensive range of mutants including several recently discovered phenotypes permitted the resolution of new cistronic limits within the locus. A speculative model of the gene products was proposed to embrace the recombination, complementation and biochemical paradigms.</p> / Thesis / Doctor of Philosophy (PhD)

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Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Paulo Sergio Rodrigues Coelho / Banca: Otavio Henrique Thiemann / Banca: Gustavo Henrique Goldman / Banca: Aline Maria da Silva / Resumo: Resultados prévios, em nosso laboratório, permitiram identificar fatores de transcrição provavelmente atuando como reguladores do metabolismo de glicogênio no fungo Neurospora crassa utilizando uma coleção de linhagens mutantes do fungo contendo ORFS codificadoras de fatores de transcrição individualmente nocauteadas. O presente trabalho teve como objetivo realizar análises funcionais de alguns dos fatores de transcrição anteriormente identificados, tais como o regulador transcricional XlnR, descrito em outros fungos filamentosos como regulador de genes codificadores de enzimas xilanolíticas e/ou celulolíticas e o produto da ORF NCU04390, uma proteína sem função conhecida. Inicialmente foram realizadas análises de acúmulo de glicogênio e da expressão dos genes gsn (codificador da enzima glicogênio sintase) e gpn (codificador da enzima glicogênio fosforilase) durante o crescimento vegetativo (30ºC) e sob condição de estresse térmico (45ºC) nas linhagens mutantes e comparadas à linhagem selvagem. Ambas as linhagens mutantes apresentaram alterações tanto no conteúdo de glicogênio como na expressão dos genes citados anteriormente, o que indicou o possível envolvimento dos fatores de transcrição na regulação do metabolismo do carboidrato. Foram realizados experimentos com o objetivo de investigar a função do fator de transcrição XlnR na regulação do metabolismo de glicogênio. Foi verificado que esta proteína regula os níveis do carboidrato, bem como a expressão do gene gsn quando o fungo foi crescido em fontes alternativas de carbono. Entretanto, o fator de transcrição XLR-1 de N. crassa produzido na forma recombinante em E. coli (inteiro e truncado) não foi capaz de ligar ao motif presente no promotor gsn. Genes codificadores de duas endoxilanases foram identificados no genoma de N. crassa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Previous results from our laboratory using a collection of Neurospora crassa strains mutated in genes encoding transcription factors allowed us to identify transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation. The present work aimed to perform a functional analysis of some transcription factors previously identified, such as the transcriptional regulator XlnR, described in many filamentous fungi as a transcriptional regulator of xylanolitic and/or cellulolitic genes and a protein with unknown function, the ORF NCU04390 product. Initially, analysis of glycogen accumulation and gsn (coding glycogen synthase) and gpn (coding glycogen phosphorylase) gene expression were performed under vegetative growth (30 °C) and under heat shock cond ition (45 ºC) in the two mutant strains and compared to the wild-type strain. Both mutant strains showed changes in the glycogen levels as well as in the gsn and gpn expression, suggesting an involvement of these transcription factors in the regulation of glycogen metabolism. Additional analysis was performed in order to investigate the function of the XlnR transcription factor. It was observed that this transcription factor regulates the glycogen levels as well as the gsn expression under alternative carbon sources. However, the recombinant XLR-1 transcription factor produced in E. coli (entire and truncated proteins) was not able to bind to the XLR-1 motif present in the gsn promoter. Two endoxylanases coding genes were identified in the N. crassa genome database and analysis of their gene expression showed the upregulation of both genes during growth in xylan instead of xylose as carbon sources. This result suggested that the XLR-1 transcription factor is not the only protein that regulates the endoxylanases genes. The transcription factor encoded by NCU04390 ORF was... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-07-11Bitstream added on 2014-06-13T20:41:02Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_rd_dr_araiq_parcial.pdf: 284569 bytes, checksum: f7e48a4c9ff942697ece9e42f05b6fea (MD5) Bitstreams deleted on 2015-06-25T13:01:23Z: goncalves_rd_dr_araiq_parcial.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-25T13:03:34Z : No. of bitstreams: 1 000713132_20161231.pdf: 275112 bytes, checksum: 63f307a03521b081835abe229f60fbf4 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-01-02T15:03:46Z: 000713132_20161231.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-01-02T15:05:06Z : No. of bitstreams: 1 000713132.pdf: 8332325 bytes, checksum: 76068ad08200d9297dc8e7da373fb7ed (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Resultados prévios, em nosso laboratório, permitiram identificar fatores de transcrição provavelmente atuando como reguladores do metabolismo de glicogênio no fungo Neurospora crassa utilizando uma coleção de linhagens mutantes do fungo contendo ORFS codificadoras de fatores de transcrição individualmente nocauteadas. O presente trabalho teve como objetivo realizar análises funcionais de alguns dos fatores de transcrição anteriormente identificados, tais como o regulador transcricional XlnR, descrito em outros fungos filamentosos como regulador de genes codificadores de enzimas xilanolíticas e/ou celulolíticas e o produto da ORF NCU04390, uma proteína sem função conhecida. Inicialmente foram realizadas análises de acúmulo de glicogênio e da expressão dos genes gsn (codificador da enzima glicogênio sintase) e gpn (codificador da enzima glicogênio fosforilase) durante o crescimento vegetativo (30ºC) e sob condição de estresse térmico (45ºC) nas linhagens mutantes e comparadas à linhagem selvagem. Ambas as linhagens mutantes apresentaram alterações tanto no conteúdo de glicogênio como na expressão dos genes citados anteriormente, o que indicou o possível envolvimento dos fatores de transcrição na regulação do metabolismo do carboidrato. Foram realizados experimentos com o objetivo de investigar a função do fator de transcrição XlnR na regulação do metabolismo de glicogênio. Foi verificado que esta proteína regula os níveis do carboidrato, bem como a expressão do gene gsn quando o fungo foi crescido em fontes alternativas de carbono. Entretanto, o fator de transcrição XLR-1 de N. crassa produzido na forma recombinante em E. coli (inteiro e truncado) não foi capaz de ligar ao motif presente no promotor gsn. Genes codificadores de duas endoxilanases foram identificados no genoma de N. crassa... / Previous results from our laboratory using a collection of Neurospora crassa strains mutated in genes encoding transcription factors allowed us to identify transcription factors likely involved in glycogen metabolism regulation. The present work aimed to perform a functional analysis of some transcription factors previously identified, such as the transcriptional regulator XlnR, described in many filamentous fungi as a transcriptional regulator of xylanolitic and/or cellulolitic genes and a protein with unknown function, the ORF NCU04390 product. Initially, analysis of glycogen accumulation and gsn (coding glycogen synthase) and gpn (coding glycogen phosphorylase) gene expression were performed under vegetative growth (30 °C) and under heat shock cond ition (45 ºC) in the two mutant strains and compared to the wild-type strain. Both mutant strains showed changes in the glycogen levels as well as in the gsn and gpn expression, suggesting an involvement of these transcription factors in the regulation of glycogen metabolism. Additional analysis was performed in order to investigate the function of the XlnR transcription factor. It was observed that this transcription factor regulates the glycogen levels as well as the gsn expression under alternative carbon sources. However, the recombinant XLR-1 transcription factor produced in E. coli (entire and truncated proteins) was not able to bind to the XLR-1 motif present in the gsn promoter. Two endoxylanases coding genes were identified in the N. crassa genome database and analysis of their gene expression showed the upregulation of both genes during growth in xylan instead of xylose as carbon sources. This result suggested that the XLR-1 transcription factor is not the only protein that regulates the endoxylanases genes. The transcription factor encoded by NCU04390 ORF was... (Complete abstract click electronic access below)