Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der antigenen Eigenschaften aktueller Isolate (PPV-143a und PPV-27a) des porzinen Parvovirus (PPV). Des Weiteren sollten die Virulenzeigenschaften dieser Isolate sowie zweier Virusstämme (PPV-NADL-2 und PPV-IDT [Master Seed Virus]), die zur Produktion von inaktivierten Vollvirus-Vakzinen genutzt werden, bestimmt werden. In der in vitro-Studie wurden die untersuchten PPV-Isolate sowie ein weiteres Isolat (PPV-Challenge [Engl.]) zur Herstellung von Hyperimmunseren im Kaninchen und - nach experimenteller Infektion von Sauen (s.u.) – zur Herstellung von Postinfektionsseren genutzt. Die Seren wurden im Neutralisationstest gegen die verschiedenen Isolate geprüft und eine Kreuzneutralisation bewertet. Das Serum-IDT (MSV) zeigte generell eine begrenzte Neutralisation gegen die heterologen PPV-Isolate. Des Weiteren ergab die Untersuchung, dass alle Seren gegen das Isolat PPV-27a als Testvirus einen geringeren Neutralisationstiter aufwiesen als gegen die anderen Isolate. Interessanterweise wurde PPV-27a durch homologe Antiseren deutlich schlechter neutralisiert als alle anderen getestete Viren. Dieser offensichtliche „Immune Escape“ wurde bei den Seren aller beiden Kaninchen und aller drei Sauen gesehen. Die experimentellen Infektionen erfolgten bei 12 tragenden Jungsauen am 40. Trächtigkeitstag (3 Tiere pro Isolat PPV-143a, PPV-27a, PPV-NADL-2, PPV-IDT [MSV]). Es konnten neben dem Serum der infizierten Sauen fetale Gewebeproben von Lunge und Niere sowie Nabelvenenblut von insgesamt 157 Feten aus diesen Trächtigkeiten untersucht werden. Zur Antikörperbestimmung wurde der HAH-Test angewendet. Spezifische Antikörper konnten bei den Feten jeder Infektionsgruppe (PPV-143a, PPV-27a, PPV-IDT [MSV]) und PPV-NADL-2) detektiert werden. Somit konnte eine transplazentare Übertragung für alle PPV-Isolate gezeigt werden. Der Antigennachweis erfolgte durch Untersuchung der Hämagglutination aus dem Gewebe beziehungsweise nach Anzucht des Erregers in Zellkultur durch Bewertung des cytopathischen Effekts und Bestätigung durch direkte Immunfluoreszenz. Der Virusnachweis gelang ausschließlich bei den Feten der Gruppe Sauen die mit PPV-27a infiziert wurden. Die fetale Mortalitätsrate der Feten der Infektionsgruppe PPV-27a lag bei 85 % und war signifikant höher im Vergleich zu den anderen Infektionsgruppen (5-18 %). Schlussfolgernd konnte in vivo lediglich für PPV-27a eine Virulenz nachgewiesen werden. In vitro zeigte sich nur für PPV-27a ein differenziertes Kreuzneutralisations-Verhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Isolat PPV-27a tasächlich eine neue antigene Variante des porzinen Parvovirus darstellt, gegen die derzeit verfügbare Impfstoffe möglicherweise nur unvollständig schützen.

Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der antigenen Eigenschaften aktueller Isolate (PPV-143a und PPV-27a) des porzinen Parvovirus (PPV). Des Weiteren sollten die Virulenzeigenschaften dieser Isolate sowie zweier Virusstämme (PPV-NADL-2 und PPV-IDT [Master Seed Virus]), die zur Produktion von inaktivierten Vollvirus-Vakzinen genutzt werden, bestimmt werden. In der in vitro-Studie wurden die untersuchten PPV-Isolate sowie ein weiteres Isolat (PPV-Challenge [Engl.]) zur Herstellung von Hyperimmunseren im Kaninchen und - nach experimenteller Infektion von Sauen (s.u.) – zur Herstellung von Postinfektionsseren genutzt. Die Seren wurden im Neutralisationstest gegen die verschiedenen Isolate geprüft und eine Kreuzneutralisation bewertet. Das Serum-IDT (MSV) zeigte generell eine begrenzte Neutralisation gegen die heterologen PPV-Isolate. Des Weiteren ergab die Untersuchung, dass alle Seren gegen das Isolat PPV-27a als Testvirus einen geringeren Neutralisationstiter aufwiesen als gegen die anderen Isolate. Interessanterweise wurde PPV-27a durch homologe Antiseren deutlich schlechter neutralisiert als alle anderen getestete Viren. Dieser offensichtliche „Immune Escape“ wurde bei den Seren aller beiden Kaninchen und aller drei Sauen gesehen. Die experimentellen Infektionen erfolgten bei 12 tragenden Jungsauen am 40. Trächtigkeitstag (3 Tiere pro Isolat PPV-143a, PPV-27a, PPV-NADL-2, PPV-IDT [MSV]). Es konnten neben dem Serum der infizierten Sauen fetale Gewebeproben von Lunge und Niere sowie Nabelvenenblut von insgesamt 157 Feten aus diesen Trächtigkeiten untersucht werden. Zur Antikörperbestimmung wurde der HAH-Test angewendet. Spezifische Antikörper konnten bei den Feten jeder Infektionsgruppe (PPV-143a, PPV-27a, PPV-IDT [MSV]) und PPV-NADL-2) detektiert werden. Somit konnte eine transplazentare Übertragung für alle PPV-Isolate gezeigt werden. Der Antigennachweis erfolgte durch Untersuchung der Hämagglutination aus dem Gewebe beziehungsweise nach Anzucht des Erregers in Zellkultur durch Bewertung des cytopathischen Effekts und Bestätigung durch direkte Immunfluoreszenz. Der Virusnachweis gelang ausschließlich bei den Feten der Gruppe Sauen die mit PPV-27a infiziert wurden. Die fetale Mortalitätsrate der Feten der Infektionsgruppe PPV-27a lag bei 85 % und war signifikant höher im Vergleich zu den anderen Infektionsgruppen (5-18 %). Schlussfolgernd konnte in vivo lediglich für PPV-27a eine Virulenz nachgewiesen werden. In vitro zeigte sich nur für PPV-27a ein differenziertes Kreuzneutralisations-Verhalten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Isolat PPV-27a tasächlich eine neue antigene Variante des porzinen Parvovirus darstellt, gegen die derzeit verfügbare Impfstoffe möglicherweise nur unvollständig schützen.

Neutralisierende Antikörper sind entscheidend in der Eindämmung der Virusinfektion, indem sie den Eintritt in die Wirtszelle hemmen bzw. die Aktivierung der Komplementkaskade initiieren. Distinkte wirtseigene Oberflächenrezeptoren für die Fc-Domäne von IgG (FcyR) sind für die Kommunikation von humoraler und zellulärer Immunantwort verantwortlich. Auch Mitglieder der Herpesviren kodieren für Fc-bindende Proteine, die Kandidaten für immunevasive Funktionen darstellen könnten. Der Nachweis der HCMV-kodierten Fc-bindenden Proteine gp34 und gp68 als Bestandteil der Virushülle lies auf eine immunevasive Funktion hinsichtlich neutralisierendem IgG und Komplement-vermittelter Virolyse schließen, wie für den HSV-1-kodierten FcyR gE beschrieben. Weder für gp34 noch für gp68 konnte in vitro ein hemmender Effekt auf Neutralisation und Virolyse beobachtet werden. In unserem Labor wurde jedoch gezeigt, dass gp34 und gp68 selektiv die IgG-abhängige Aktivierung zellulärer FcyR inhibieren. Die glykosylierungsunabhängige Ligandenbindung von gp34 und gp68 wies auf unterschiedliche Interaktionsmechanismen zwischen den zellulären und den viralen FcyR hin. Mithilfe eines mutierten Fc-Fragments konnte für gp68 eindeutig eine mit HSV-1 gE überlappende Bindestelle an IgG identifiziert werden. Die für die Ligandenbindung erforderlichen Aminosäuren 71-292 von gp68 binden Fc in einer 2:1 Stöchiometrie, wobei die N-, nicht aber die O-Glykosylierung des vFcyRs essentiell sind. Darüber hinaus formt gp34 auf infizierten Zellen und auf der Virushülle kovalente Homooligomere. gp34-Cysteinpunktmutanten auf Basis der für die Bindung notwendigen Aminosäuren 24-140 lassen vermuten, dass die Oligomerisierung Voraussetzung für die Fc-Bindung ist. Im Gegensatz zu gp68 scheint der Mechanismus der Fc-Bindung von gp34 einzigartig unter den bekannten Fcy-Rezeptoren zu sein. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass trotz redundanter Expression der HCMV-FcyR der Bindungs- und Wirkungsmechanismus selektiv ist. / Neutralizing IgGs play a key role in diminishing virus infectivity by inhibiting the entry into host cells. Additionally, IgG-bound particles may be inactivated by virolysis through the activation of complement. Surface receptors specific for the Fc domain of IgG represent host proteins, connecting humoral and cellular immune responses. Also members of the herpes virus family code for proteins with Fc binding properties, implying functions that could intervene with antibody-dependent effector mechanisms. The presence of gp34 and gp68 on the virion membrane raised the question whether they are able to inhibit neutralising IgG and complement-mediated virolysis. The HSV-1-encoded FcyR gE was described to affect neutralisation and virolysis. Despite extensive analysis, there were no implications found that gp34 or gp68 interfere with neutralising IgG or virolysis in vitro. However, our lab could demonstrate that gp34 and gp68 selectively inhibit the IgG-dependent activation of the different host FcyRs. In contrast to the cFcyRs Fc recognition by gp34 and gp68 occurs independently of N-linked glycosylation of IgG, which points to a different binding mechanism among host and viral FcyRs. By taking advantage of a mutated Fc fragment, overlapping binding regions of the HSV-1 gE and gp68 were identified. For gp68 the amino acids 71-292 including the N-glycans are strictly required for Fc binding in a 2:1 stoichiometry. Interestingly, gp34 forms covalently linked homo-oligomers in infected cells and on the virion. Based on the minimal binding domain comprising the amino acids 24-140 of gp34, targeted cysteine exchange mutants revealed that oligomer formation by gp34 is absolutely required for Fc binding. In contrast to gp68, the Fc binding characteristics of gp34 appears to be unique among the known FcyRs. These findings allow us to postulate that even if the HCMV-encoded FcyRs are redundantly expressed the mechanistic details and binding properties are selective.

Die Transplantation von porzinen Organen könnte eine Lösung des akuten Mangels von Allotransplantaten in der Transplantationsmedizin darstellen. Bevor die Xenotransplantation klinische Realität werden kann, sind jedoch zahlreiche Hürden zu überwinden. Insbesondere die mögliche Übertragung porziner endogener Retroviren (PERVs), die integraler Bestandteil des porzinen Genoms sind, stellt ein mikrobiologisches Risiko dar. PERVs können humane Zellen in vitro produktiv infizieren. Mögliche Strategien zur Abwehr von Xenosen sind die Verwendung von PERV-knockout Tieren oder die Entwicklung eines effektiven Impfstoffes, durch den der Transplantatrezipient vor einer möglichen Übertragung geschützt werden kann. Dazu wurden Antiseren gegen die Hauptstrukturproteine von PERV generiert. Es konnte gezeigt werden, dass in Ziegen und Ratten durch Immunisierung mit der rekombinant generiereten Ektodomäne des transmembranen Hüllprotein p15E neutralisierende Antikörper induziert werden konnten. Die Epitopkartierung der induzierten Antikörper zeigt eine Bindung an eine Domäne im N-terminalen, nahe des Fusionspeptids (E1, GPQQLEK) und eine Domäne im C-terminalen, membranproximalen (E2, FEGWFN) Bereich der p15E-Ektodomäne. Diese Sequenzen sind in allen PERVs identisch und innerhalb der Gammaretroviren hochkonserviert. Aus AIDS-Patienten isolierte neutralisierende Antikörper (mAb2F5: ELDKWA, mAb4E10: LWNWFN) binden ebenfalls an den C-terminalen Bereich der Ektodomäne des Transmembranproteins gp41. Der Bindungsmechannismus dieser Antikörper wurde in ELISA-Experimenten und in vitro-Inhibitionsassays analysiert. Die Ergebnisse legen die Bindung eines Konformationsepitopes nahe, das aus der E1 und der E2 Domäne gebildet wird. Die Aufklärung des Bindungsmechnismus breit neutralisierender Antikörper gegen Transmembranproteine von Retroviren könnte die Basis für neue Impfstoffansätze darstellen. / Porcine xenotransplants may offer a potential solution to the problem posed by the limited supply of allotransplants. However, xenotransplantation may be associated with the risk of transmission of microorganisms, in particular of porcine endogenous retroviruses (PERVs) that are an integral part of the porcine genome and able to infect human cells in vitro. Possible strategies to prevent virus transmission include the development of PERV knockout animals or of effective vaccines. When antisera prepared against the main structural proteins of PERV were screened, goat and rat antisera against the recombinant ectodomain of the transmembrane envelope protein p15E were found to neutralize PERV infectivity. Epitope mapping using overlapping peptides revealed two epitopes, one near the fusion peptide (E1, GPQQLEK) and the other near the transmembrane domain (E2, FEGWFN). These sequences are identical for all PERVs and are highly conserved among all gammaretroviruses. Interestingly, neutralizing antibodies isolated from AIDS patients that recognize regions partially homologous with E2 (mAb4E10, LWNWFN) or located in close proximity to E2 (mAb2F5, ELDKWA) are known to neutralize a broad range of HIV-1 strains. The binding mechanisms of these HIV neutralizing antibodies were analyzed in ELISA experiments and in vitro inhibition assays. The results indicate that the two most broadly reactive HIV-1 envelope gp41 human mAbs are specific for a discontinuous epitope composed of the E1 and the E2 domain. If so, these two transmembrane protein domains in different retroviruses act as effective targets for neutralizing antibodies and may provide the basis for effective antiretroviral vaccines.