A associação da obesidade e asma atópica está bem descrita. Embora reconhecidamente uma patologia mediada por eosinófilos, à asma apresenta fenótipos distintos onde os neutrófilos exercem relevante papel na inflamação pulmonar e manutenção da inflamação. Existem dados de que mulheres obesas asmáticas são mais propensas a desenvolver a asma mediada por neutrófilos, cuja característica é ser de difícil controle, e ainda refrataria a corticoterapia. Ainda não existem modelos experimentais de asma neutrofílica, que visem a ligar os mecanismos associados à resistência aos corticoides em mulheres com asma neutrofílica. Neste estudo caracterizamos um modelo experimental de asma neutrofilica em camundongos fêmeas e apresentamos dados do papel da obesidade na inflamação pulmonar. Nossos dados permitem sugerir que o modelo de asma neutrofílica está, sob ponto de vista inflamatório caracterizado, e que o recrutamento de neutrófilos independe da obesidade. Nosso estudo pode contribuir para a compreensão dos mecanismos que regulam a asma de neutrofilica em mulheres obesas. / The association of obesity and atopic asthma is well described. Although admittedly an eosinophil-mediated pathology, asthma presents distinct phenotypes where neutrophils exert a relevant role in lung inflammation and maintenance of inflammation. There are data that obese asthmatic women are more likely to develop neutrophil-mediated asthma, which is difficult to control and still refractory to corticosteroids. There are as yet no experimental models of neutrophilic asthma to link mechanisms associated with resistance to corticosteroids in women with neutrophilic asthma. In this study we characterized an experimental model of neutrophilic asthma in female mice and presented data on the role of obesity in pulmonary inflammation. Our data allow us to suggest that the neutrophilic asthma model is, under a characterized inflammatory point of view, and that neutrophil recruitment is independent of obesity. Our study may contribute to understanding the mechanisms that regulate neutrophilic asthma in obese women.

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do tratamento periodontal não cirúrgico sobre a atividade de elastase e o volume de fluido gengival nos pacientes portadores de periodontite crônica e agressiva generalizadas. Foram avaliados 18 pacientes com periodontite crônica (idade média 48,6 DP 7,5 anos), e 11 com periodontite agressiva (idade média 27,9 DP 6,54 anos). Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB) (mm), nível de inserção (NI) (mm) e sangramento à sondagem (SS). As medidas clínicas e as amostras de fluido gengival foram colhidas a partir dos cinco sítios mais profundos (P) e de cinco sítios rasos com gengivite (G) de cada paciente, antes e 90 dias após o término do tratamento. As etapas clínicas obedeceram ao seguinte cronograma: seleção e exame periodontal; coleta de fluido gengival; tratamento periodontal; reavaliação, compreendendo o exame periodontal e coleta de fluido gengival. O tratamento levou, em média, 4 sessões de 40 minutos cada por paciente, com intervalo de 1 semana entre elas. As consultas para reavaliação foram feitas 90 dias após o término do tratamento. O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar os dados antes e depois do tratamento e o teste não pareado de Mann-Whitney U-test foi utilizado para comparar os grupos de periodontite crônica e agressiva. A amostra analisada antes e após o tratamento não apresentou diferenças significativas entre o grupo com periodontite crônica e agressiva, que responderam de forma similar a todos os indicadores avaliados, exceto para a profundidade de bolsa à sondagem nos sítios rasos com gengivite (p = 0,039) e para o sangramento à sondagem (p = 0,021) nos sítios profundos, ambos mais reduzidos na periodontite crônica após o tratamento. A elastase apresentou, após o tratamento, redução significativa nos sítios profundos, para a periodontite crônica (p = 0,012) e agressiva (p = 0,02). Em relação ao volume de fluido gengival, houve significativa redução após o tratamento nos pacientes com periodontite crônica e agressiva, tanto nos sítios rasos (p = 0,03 e p = 0,03) como nos profundos (p ˂ 0,001 e p = 0,003), respectivamente. Concluindo, os grupos com periodontite crônica e agressiva generalizadas comportaram- se de maneira semelhante frente à terapia mecânica não cirúrgica. Ainda, a terapia periodontal mecânica não cirúrgica mostrou redução significativa do volume de fluido gengival em todos os sítios analisados, e da atividade neutrofílica, nos sítios profundos, associada a reduções significativas em todos os indicadores clínicos analisados após o tratamento. / The aim of this study was to investigate the impact of non-surgical mechanical treatment on elastase activity and gingival crevicular fluids (GCF) volume of patients with untreated generalized chronic and aggressive periodontitis. Eighteen patients with generalized chronic periodontitis (mean age 48,6 SD 7,5 years old) and eleven with generalized aggressive periodontitis (mean age 27,9 SD 6,54 years old) were evaluated. The clinical parameters adopted were pocket probing depth (PPD) (mm); attachment level (AL) (mm) and bleeding on probing (PB). Clinical measures and GCF were collected from the 5 deepest sites (P) and from 5 shallow sites with gingivitis (G) from each patient of each group, before and 90 days after non- surgical periodontal treatment. There were adopted the following clinical steps: patients selection and periodontal exam; GCFs collection; periodontal treatment; re- evaluations, comprising periodontal exams and GCFs collection. The periodontal treatment lasted about about 4 sections with 40 minutes each, 1 section per week. Re-evaluations were performed 90 days after completion of the treatment. Wilcoxons statistic test compared the data before and after treatment and Mann-Whitneys non parametric U-test was used to compared chronic and aggressive periodontitis groups. There were no significant differences for all clinical parameters analysed before and after treatment,except for pocket probing depth on shallow sites (p = 0,039) and for bleeding on probing (p = 0,021) on deep sites, both in lower levels in chronic periodontitis after treatment. The elastases activity showed, after treatment, a significant reduction on deep sites for chronic (p = 0,012) and aggressive (p = 0,02) periodontitis. In concern to GCFs volume, there was significant reduction on both chronic and aggressive periodontitis, in shallow (p = 0,03 e p = 0,03) and in deep pockets (p ˂ 0,001 e p = 0,003), respectively, after treatment. In conclusion, both groups responded simmilarly to the mechanical non- surgical treatment. Moreover, non- surgical periodontal treatment showed significant reductions on GCFs volume on all analysed sites and reduction on neutrophilics activity, on deep sites followed by the significant reduction on clinical indicators after treatment.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T18:54:35Z : No. of bitstreams: 1 kanegae_mpp_me_arafcf.pdf: 328350 bytes, checksum: ee1587bd6ab853b184cea70a4d71dac0 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Em hematologia, a principal aplicação da determinação da atividade da fosfatase alcalina (FA) neutrofílica é no auxílio ao diagnóstico diferencial entre leucemia mielóide crônica (LMC) e reações leucemóides neutrofílicas (RL) decorrentes de doenças mieloproliferativas, como a mielofibrose, policitemia vera ou de inflamações/ infecções. Tradicionalmente esta determinação é realizada por um ensaio citoquímico subjetivo, no qual se atribui uma pontuação (SCORE) para o nível de FA. Neste trabalho apresentamos um método quimiluminescente, objetivo, quantitativo, sensível e barato para a determinação de FA neutrofílica baseado no reagente comercial Immulite®. Leucócitos íntegros obtidos de amostras de sangue periférico de trinta e dois indivíduos saudáveis, nove portadores de LMC e nove portadores de RL foram submetidos ao protocolo otimizado. Através da determinação da emissão de luz por quatro concentrações de neutrófilos, foi possível detectar a atividade de FA por célula (inclinação - SLOPE - da curva obtida por regressão linear). Uma alta correlação foi obtida quando o método quimiluminescente (SLOPE), aqui desenvolvido, foi comparado ao citoquímico (SCORE). Obtivemos uma variação do SLOPE entre 0,61-8,49 (10-5 mV.s/célula) para amostras do grupo controle (indivíduos saudáveis), sendo que o valor da mediana foi 2,04 (10-5 mV.s/célula). Estes resultados foram estatisticamente diferentes das amostras do grupo LMC (variação: 0,07 - 1,75; mediana: 0,79) e do grupo RL (variação: 3,84 - 47,24; mediana: 9,58) (p<0,05). / In haematology the main application of the leukocyte alkaline phosphatase (LAP) assay is in distinguishing chronic myeloid leukaemia (CML) from other myeloproliferative diseases, particularly from myelofibrosis, polycythaemia or other inflammatory/infectious diseases (LR). Traditionally, this is performed by subjective cytochemical assays where a SCORE is attributed to the level of LAP. Here we present a non-subjective, quantitative, sensitive and inexpensive chemiluminescent technique for LAP determination, based on the commercial reagent Immulite®. Intact leukocytes obtained from thirty-two healthy subjects, nine CML and nine LR patients were submitted to the optimized protocol. By measuring the light emission elicited by four concentrations of neutrophils, it was possible to estimate the activity of LAP per cell (the SLOPE of the curve obtained by linear regression). A high linear correlation was found between the chemiluminescent result (SLOPE) and the cytochemical SCORE. The SLOPE for healthy individuals ranged between 0.61 and 8.49 (10-5 mV.s/cell), with a median of 2.04 (10-5 mV.s/cell). These results were statistically different from CML patients (range 0.07 - 1.75, median 0.79) and LR patients (range 3.84 - 47.24, median 9.58) (p<0.05).

O objetivo deste estudo foi avaliar o impacto do tratamento periodontal não cirúrgico sobre a atividade de elastase e o volume de fluido gengival nos pacientes portadores de periodontite crônica e agressiva generalizadas. Foram avaliados 18 pacientes com periodontite crônica (idade média 48,6 DP 7,5 anos), e 11 com periodontite agressiva (idade média 27,9 DP 6,54 anos). Foram utilizados os parâmetros clínicos de avaliação de profundidade de bolsa à sondagem (PB) (mm), nível de inserção (NI) (mm) e sangramento à sondagem (SS). As medidas clínicas e as amostras de fluido gengival foram colhidas a partir dos cinco sítios mais profundos (P) e de cinco sítios rasos com gengivite (G) de cada paciente, antes e 90 dias após o término do tratamento. As etapas clínicas obedeceram ao seguinte cronograma: seleção e exame periodontal; coleta de fluido gengival; tratamento periodontal; reavaliação, compreendendo o exame periodontal e coleta de fluido gengival. O tratamento levou, em média, 4 sessões de 40 minutos cada por paciente, com intervalo de 1 semana entre elas. As consultas para reavaliação foram feitas 90 dias após o término do tratamento. O teste de Wilcoxon foi utilizado para comparar os dados antes e depois do tratamento e o teste não pareado de Mann-Whitney U-test foi utilizado para comparar os grupos de periodontite crônica e agressiva. A amostra analisada antes e após o tratamento não apresentou diferenças significativas entre o grupo com periodontite crônica e agressiva, que responderam de forma similar a todos os indicadores avaliados, exceto para a profundidade de bolsa à sondagem nos sítios rasos com gengivite (p = 0,039) e para o sangramento à sondagem (p = 0,021) nos sítios profundos, ambos mais reduzidos na periodontite crônica após o tratamento. A elastase apresentou, após o tratamento, redução significativa nos sítios profundos, para a periodontite crônica (p = 0,012) e agressiva (p = 0,02). Em relação ao volume de fluido gengival, houve significativa redução após o tratamento nos pacientes com periodontite crônica e agressiva, tanto nos sítios rasos (p = 0,03 e p = 0,03) como nos profundos (p &#706; 0,001 e p = 0,003), respectivamente. Concluindo, os grupos com periodontite crônica e agressiva generalizadas comportaram- se de maneira semelhante frente à terapia mecânica não cirúrgica. Ainda, a terapia periodontal mecânica não cirúrgica mostrou redução significativa do volume de fluido gengival em todos os sítios analisados, e da atividade neutrofílica, nos sítios profundos, associada a reduções significativas em todos os indicadores clínicos analisados após o tratamento. / The aim of this study was to investigate the impact of non-surgical mechanical treatment on elastase activity and gingival crevicular fluids (GCF) volume of patients with untreated generalized chronic and aggressive periodontitis. Eighteen patients with generalized chronic periodontitis (mean age 48,6 SD 7,5 years old) and eleven with generalized aggressive periodontitis (mean age 27,9 SD 6,54 years old) were evaluated. The clinical parameters adopted were pocket probing depth (PPD) (mm); attachment level (AL) (mm) and bleeding on probing (PB). Clinical measures and GCF were collected from the 5 deepest sites (P) and from 5 shallow sites with gingivitis (G) from each patient of each group, before and 90 days after non- surgical periodontal treatment. There were adopted the following clinical steps: patients selection and periodontal exam; GCFs collection; periodontal treatment; re- evaluations, comprising periodontal exams and GCFs collection. The periodontal treatment lasted about about 4 sections with 40 minutes each, 1 section per week. Re-evaluations were performed 90 days after completion of the treatment. Wilcoxons statistic test compared the data before and after treatment and Mann-Whitneys non parametric U-test was used to compared chronic and aggressive periodontitis groups. There were no significant differences for all clinical parameters analysed before and after treatment,except for pocket probing depth on shallow sites (p = 0,039) and for bleeding on probing (p = 0,021) on deep sites, both in lower levels in chronic periodontitis after treatment. The elastases activity showed, after treatment, a significant reduction on deep sites for chronic (p = 0,012) and aggressive (p = 0,02) periodontitis. In concern to GCFs volume, there was significant reduction on both chronic and aggressive periodontitis, in shallow (p = 0,03 e p = 0,03) and in deep pockets (p &#706; 0,001 e p = 0,003), respectively, after treatment. In conclusion, both groups responded simmilarly to the mechanical non- surgical treatment. Moreover, non- surgical periodontal treatment showed significant reductions on GCFs volume on all analysed sites and reduction on neutrophilics activity, on deep sites followed by the significant reduction on clinical indicators after treatment.

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

Lectinas consistem de um vasto grupo de proteínas de origem não-imunológica e de caráter não enzimático, que reconhecem carboidratos de modo específico e não-covalente. Além disso, essas proteínas participam de vários eventos fisiológicos e patológicos, com embriogenese, resposta imunológica, apoptose, diferenciação celular e câncer. Recentemente, foi purificada da peçonha da serpente Bothrops atrox uma lectina do tipo-C, ligante de lactose, com propriedades bioquímicas e funcionais semelhantes à de outras lectinas de serpentes do gênero, denominada Galatrox. O presente projeto teve como objetivos a investigação do envolvimento da Galatrox no processo inflamatório agudo através de experimentos in vivo e in vitro e a produção de anticorpos policlonais anti-Galatrox. A lectina isolada foi obtida através de dois processos cromatográficos, apresentando um valor final de recuperação protéica de 0,3% (mg) em relação ao conteúdo protéico da peçonha bruta. De modo interessante, a Galatrox conjugada ao fluorocromo FITC (8µg/mL) foi capaz de ligar-se a superfície de neutrófilos (91,47%±0,5650). Além disso, está proteína reconheceu a laminina imobilizada, e não a fibronectina, uma glicoproteína da matriz extracelular que contém sequencias de poli-N-acetillactosamina. Avaliando seu potencial inflamatório, Galatrox mostrou-se capaz de induzir a migração de neutrófilos humanos in vitro de forma dose-dependente, tendo máxima atividade quimiotática na concentração de 32µg/mL (41,57±3,42 neutrófilos por campo). Apesar da Galatrox induzir um discreto nível de burst oxidativo em neutrófilos humanos não primados, ela apresentou um efeito três vezes maior quando essas células foram primadas com fMLP. Esta lectina quando injetada na cavidade peritoneal de camundongos Balb/C provocou migração leucocitária, sendo que na dose (50g/cavidade) e no tempo (4 horas) ótimos ocorreu um influxo celular de 2,05x106±0,101 leucócitos/mL. Ainda, esse infiltrado celular mostrou-se, basicamentre, composto por neutrófilos. Avaliando o perfil de mediadores da resposta inflamatória nesse ensaio in vivo, nos lavados peritoneais foi indicada a liberação máxima de IL-1 e IL-6 após 4 horas de tratamento, mas não foram detectadas a presença de TNF- e óxido nitrico em qualquer tempo de resposta. Células de baços murinos tratados com Galatrox produziram as citocinas pró-inflamatórias TNF- e IFN- e não produziram IL-10 ou NO. A produção de anticorpos policlonais foi realizada por imunização de camundongos e purificação cromatografia de afinidade em colunas com Galatrox imobilizada. A monitoração por ELISA e Western blot comprovaram a produção de anticorpos da classe IgG anti-Galatrox reconhecedores da lectina em sua forma nativa e desnaturada além de suas formas monoméricas e diméricas. Em todos os ensaios biológicos que a Galatrox foi testada na presença da lactose (carboidrato ligante da Galatrox, 20 mM) ocorreram inibições significativas das atividades dessa lectina, indicando que o seu domínio de reconhecimento de carboidrato participa das funções dessa molécula. Com base nos resultados obtidos é possível sugerir que a Galatrox participe da resposta imune inata por mediar eventos biológicos da resposta inflamatória aguda. No entanto, a lectina mostrou-se como um moderado agente pró-inflamatória, quando relacionada à peçonha bruta tendo em vista a fisiopatologia inflamatória do envenenamento. O anticorpo anti-Galatrox poderá ser usado como uma importante ferramenta estudos moleculares e funcionais dessa lectina de serpente. / Lectins are proteins with no enzymatic activity and are able to bind specifically and non-covalently (reversible manner) to carbohydrates. In addition, these proteins are involved in several physiological and pathological events, as embryogenesis, immune response, cancer, and others. Galatrox, a lactose-binding protein, was purified from Bothrops atrox snake venom and partially characterized concerning its biochemical and functional properties. The present work aimed to investigate the involvement of Galatrox in the inflammatory process. In addition, was carry out the production of a polyclonal antibody against Galatrox. This lectin was purified by one chromatographic step with yield around 0.3% (w/w) of total protein from Bothrops atrox crude venom. Interestingly, Galatrox-FITC (8g/mL) binds on human neutrophil surface (91.47% ± 0.5650). Also, this lectin recognized laminin, but not fibronectin, a glycoprotein of the extracellular matrix that contains poly-N-acetyllactosamine sequences. Galatrox was able to induce human neutrophils migration in vitro in a dose-dependent manner, with maximum chemotactic activity at 32g/mL (41.57 ± 3.42 neutrophils per well). Galatrox is more efficient to induce oxidative burst on fMLP primed neutrophils rather than non-primed neutrophils. When injected into mouse peritoneal cavity, Galatrox induced dose and time-dependent leukocyte migration, with optimal effect at 50g/animal after 4 hours of the injection (2.05x106±0.101 leukocytes/mL). Galatrox also induced release of IL-1 and IL-6 up to 12 hours after injection in the peritoneal cavity. However, TNF- and NO were not detected. The treatment of splenocytes with Galatrox in vitro promotes the production of INF- and TNF-. The biological activities of Galatrox were inhibited by lactose (specific sugar, 20 mM), indicating that its recognition carbohydrate domain participates of its functions. The production of polyclonal antibody anti-Galatrox was performed by immunization of mice and purified by affinity chromatography using immobilized Galatrox resin. Gamma-globulins against Galatrox were able to recognize this lectin under native and reduced conditions, using ELISA and Western-blot, respectively. The antibody anti-Galatrox can be use as important tool to further molecular and functional characterization of this snake venom lectin. These results suggest that Galatrox is immunogenic and may participate in the acute inflammatory process, acting as a pro-inflammatory agent through its lectin property.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-05-03T11:38:10Z No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-06-03T15:37:23Z (GMT) No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-03T15:37:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 flaviamarciadecastroesilva.pdf: 2659537 bytes, checksum: 1c8331ace53624c1553f76ae25681622 (MD5) Previous issue date: 2015-04-10 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A asma e a obesidade são doenças inflamatórias crônicas de perfis imunológicos opostos. Contudo, estudos clínicos e epidemiológicos demonstram uma associação entre as duas patologias, através da observação de que indivíduos obesos asmáticos representam um fenótipo clínico distinto da asma alérgica clássica, apresentando aumento na gravidade dos sintomas e resistência a terapias convencionais. Entretanto, os mecanismos imunológicos envolvidos na associação obesidade e asma não estão esclarecidos, devido à escassez de estudos e a uma heterogeneidade nos dados encontrados em modelos experimentais. Portanto, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência da obesidade sobre a inflamação alérgica pulmonar. Para isso, a obesidade foi induzida por dieta com alto teor de gordura durante dez semanas nos animais dos grupos OB e OB/AP, enquanto os animais dos grupos CN e AP foram alimentados com a dieta padrão. Da sexta a décima semana do protocolo de indução da obesidade, os animais dos grupos AP e OB/AP foram submetidos a subsequentes sensibilizações e desafios com a ovalbumina. As análises foram realizadas em 24 e 48 horas após o último desafio com a OVA. Os resultados demonstraram que após os desafios com o alérgeno, os animais do grupo AP apresentaram características marcantes da resposta imune alérgica, com elevado número de eosinófilos no LBA, no tecido pulmonar e na medula óssea, correlacionando com os níveis elevados de CCL11 e peroxidase eosinofílica, além de citocinas de eperfil Th2 como IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-25, IL-33 e TSLP e de IgE sérica anti-OVA. Contudo, foi observado em 48 horas um declíneo na resposta de perfil Th2 nos animais deste grupo. Já os animais do grupo OB/AP apresentaram em 24 horas, um menor número de eosinófilos no lavado broncoalveolar, no tecido pulmonar e na medula óssea, associado a menores níveis de CCL11, EPO e de IL-4, IL-5, TSLP e IL-25 assim como de IgE sérica anti-OVA. Em 48 horas, as análises de citocinas no grupo OB/AP demonstraram um aumento nos níveis de IL-1β, IL-4, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF-α e IFN- associado ao maior influxo de macrófagos M1. Surpreendentemente, em 48 horas após o último desafio com a OVA, houve um aumento significativo de neutrófilos na medula óssea e de mieloperoxidase no tecido pulmonar. Paralelamente, os animais do grupo OB/AP, apresentaram um número maior de mastócitos e células caliciformes em ambos os tempos analisados, quando comparado aos animais do grupo AP. Conclusão: Somados estes resultados sugerem que a obesidade desenvolvida em camundongos BALB/c, foi capaz de influenciar a resposta imune no pulmão dos animais após as sensibilizações e os desafios com alérgeno, interferindo no desenvolvimento da resposta imune Th2 clássica e acarretando um atraso no desenvolvimento da resposta imune inflamatória. Adicionalmente, os animais obesos asmáticos apresentaram exacerbada resposta imune Th2, Th9 e altos níveis de IL-17A associada a um maior influxo de neutrófilos para o pulmão e a uma intensa produção de muco, sugerindo que estes animais apresentaram um perfil inflamatório mais grave de alergia pulmonar. / Asthma and obesity are chronic inflammatory diseases with opposite immune profiles. Although, clinical and epidemiological studies reveal the association between them, as obese asthmatic individuals represent a distinct phenotype from the classic allergic asthma. However, the immune mechanisms involved in this association are not established yet, due to the lack of studies and the heterogeneity of the data obtained in experimental models. Therefore, the present study aimed to evaluate the influence of obesity over the immune response pulmonary allergic. Female Balb/c mice were fed with high fat diet during ten weeks so as to induce obesity. From the sixth to the tenth week of the protocol, PA and PA/OB groups were sensitized and challenged with ovalbumin. The following analyses were performed 24 and 48 hours after the last OVA challenge. Striking features of the allergic immune response were observed in the PA group, as elevated eosinophil count in BAL, lung tissue bone marrow, in association with high IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-25, IL-33, TSLP and anti-OVA IgE levels. There was also elevated production of CCL11 and EPO correlated with the eosinophilia. In contrast, IL-4, IL-5, TSLP and IL-25 levels were diminished in PA/OB group. In association with the reduced eosinophil count, low levels of CCL11, EPO and Anti-OVA IgE were detected. However, 48 hours after the last challenge, IL-1β, IL-4, IL-6, IL-9, IL-12, IL-13, IL-17A, TNF-α and IFN- level were higher in the PA/OB, the was also an increased M1 macrophage influx. There was also more neutrophils in the bone marrow and MPO in the lung tissue, indicating their increased influx to the lung of PA/OB animals. Mast cells and goblet cells count was increased in this group, 24 and 48 hours after the last challenge. Taken together these results suggest that obesity developed in BALB/c mice was able to influence the immune response in the lungs of animals after sensitization and challenge with allergen, interfering with the immune response classical Th2 and causing a delay in the development inflammatory immune response. Additionally, asthmatic obese animals showed exaggerated Th2 immune response, Th9 and high IL-17A levels associated with an increased influx of neutrophils into the lung and an intense mucus production, suggesting that these animals showed an allergy more severe inflammatory profile lung.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The present work had as its objective to assess the oxidizing metabolism of neutrophils, the complete blood count (CBC) and the oxidizing profile of experimentally infected lambs with Haemonchus contortus and supplemented with selenium and vitamin E. 20 male lambs were used, of the Corriedale breed, distributed in four experimental groups with 5 animals: G1 larvae infected animals and supplemented with 0.2mg/kg living weight (PV) of selenite via intramuscular (IM); G2 larvae infected animals and supplemented with 0.2mg/kg PV of selenite IM and 2000 UI per animal of vitamin E IM; G3 larvae infected animals and supplemented with 2000 UI per animal of E IM; G4 larvae infected animals. For the CBC and the biochemical analysis blood collection on the day zero (T0) were carried out, 20 (T1), 40 (T2) and 60 (T3) through jugular venipuncture using vacutainer® tubes. The weighing and the egg determination by gram of animal feces occurred in the same experimental times. For the NBT tests heparinized blood samples were collected in the days zero, 30, 60. Smaller leukocyte values were detected in the supplemented group exclusively with selenium (G1) in relation to the control group (G4) in time 4. Concerning the lymphocytes it was observed a decrease in the G1 in relation to the supplemented only with vitamin E (G3) and G4 in time 3 (T3). For both the tests, NBT-NE and NBT-E there was a decrease in the dye reduction capacity at 60 days in relation to the other times in the groups treated with selenium (G1 and G2). The result of the oxidizing profile showed a significant elevation in the GSH-Px enzyme in the supplemented groups with selenium. Still, the correlation of Pearson revealed the existence of a negative correlation between the concentrations of GSH-Px and TBARS and between this enzyme and the OPG values. Increments were also observed for the catalase enzyme in animal which received the selenium supplementation or when this element was associated to the vitamin E. Smaller values of lipid peroxidation (TBARS) were detected in supplemented animals when these were compared to the control group. These results suggest that the reduced reserves of this antioxidant may exacerbate the generation of free radicals with an increase of the lipid peroxidation and the increase of the environment contamination by the eggs of Haemonchus contortus. Facing these results it is possible to conclude that the selenium supplementation provides a larger protection to the cell antioxidant and to the organism as a whole in lambs experimentally infected by Haemonchus contortus. / O presente trabalho teve como objetivo avaliar o metabolismo oxidativo dos neutrófilos, o hemograma e o perfil oxidativo de cordeiros experimentalmente infectados com Haemonchus contortus e suplementados com selênio e vitamina E. Foram utilizados 20 cordeiros machos, da raça Corriedale, distribuídos em quatro grupos experimentais com 5 animais: G1- animais infectados com larvas e suplementados com 0,2mg/kg de peso vivo (PV) de selenito de sódio por via intramuscular (IM); G2- animais infectados com larvas e suplementados com 0,2mg/kg PV de selenito de sódio IM e 2000 UI por animal de Vitamina E IM; G3- animais infectados com larvas e suplementados com 2000 UI por animal de Vitamina E IM; G4-animais infectados com larvas. Todos os grupos foram infectados, pela via oral, com 500 larvas L3 de Haemonchus contortus por animal a cada dois dias, pelo período de vinte dias a partir do dia zero. Para o hemograma e as análises bioquímicas foram realizadas coletas de sangue nos dias zero (T0), 20 (T1), 40 (T2) e 60 (T3) por venopunção da jugular utilizando-se tubos vacutainer®. As pesagens e a determinação dos ovos por grama de fezes dos animais ocorreram nesses mesmos tempos experimentais. Para as provas de NBT foram coletadas amostras de sangue heparinizadas nos dias zero, 30 e 60. Menores valores de leucócitos totais foram detectados no grupo suplementado exclusivamente com selênio (G1) em relação ao grupo controle (G4) no tempo 4. Em relação aos linfócitos observou-se diminuição no G1 em relação ao suplementado somente com vitamina E (G3) e G4 no tempo 3 (T3). Para ambos os testes, NBT-NE e NBT-E houve uma diminuição da capacidade de redução do corante aos 60 dias em relação aos demais tempos nos grupos tratados com selênio (G1 e G2).Os resultados do perfil oxidativo demonstraram significativa elevação da atividade da enzima GSH-Px nos grupos suplementados com selênio. Ainda, a correlação de Pearson revelou a existência de correlação negativa entre as concentrações de GSH-Px e TBARS e entre esta enzima e os valores de OPG. Incrementos também foram observados para a enzima catalase nos animais que receberam suplementação com selênio ou quando este elemento foi associado a vitamina E. Menores valores de lipoperoxidação lipídica (TBARS) foram detectados nos animais suplementados quando estes foram comparados ao grupo controle. Esses resultados sugerem que as reservas diminutas deste antioxidante podem exacerbar a geração de radicais livres com um aumento da peroxidação lipídica e o aumento da contaminação ambiental pelos ovos de Haemonchus contortus. Diante dos resultados é possível concluir que a suplementação com selênio proporciona uma maior proteção antioxidante celular e ao organismo como um todo de cordeiros experimentalmente infectados pelo Haemonchus contortus.