Humane neutrophile Granulozyten spielen eine wichtige Rolle in der Immunabwehr invasiver Infektionen durch die humanpathogenen Pilze Candida albicans und Aspergillus fumigatus. Das Ziel der hier vorliegenden Arbeit bestand in einer Charakterisierung der Interaktion beider Pilzspezies mit neutrophilen Granulozyten, mit Fokussierung auf die unterschiedlichen Effektormechanismen dieser Zellen. C. albicans exprimiert eine Reihe von Aspartatproteasen, welche mit der Virulenz des Erregers assoziiert sind und zu Adhäsion, Gewebeinvasion und Immunevasion beitragen können. In dieser Arbeit wurde die Rolle der Aspartatproteasen Sap1-6, Sap9 und Sap10 in der Interaktion mit neutrophilen Granulozyten analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass, im Gegensatz zu anderen Aspartatproteasen, das zelloberflächenassoziierte GPI-verankerte Enzym Sap9 einen maßgeblichen Einfluss auf die Erkennung von C. albicans durch neutrophile Granulozyten hat. SAP9-Expression ist erforderlich, um die gerichtete Motilität (Chemotaxis) neutrophiler Granulozyten zu C. albicans-Keimschläuchen hin zu induzieren. Dieser Prozess stellt eine Grundvoraussetzung zur effektiven Aktivierung neutrophiler Granulozyten darstellt. Die Chemotaxis neutrophiler Granulozyten kann durch autologe Sekretion des Zytokins IL-8 verstärkt werden. Es konnte jedoch kein Einfluss von SAP9 auf die IL-8 Sekretion beobachtet werden. Allerdings führte die Deletion von SAP9 zu reduzierter Freisetzung von reaktiven Sauerstoffspezies (engl. reactive oxygen species, ROS) in neutrophilen Granulozyten. Die mit der ROS-Generierung in Verbindung stehende und durch C. albicans induzierte Apoptose neutrophiler Granulozyten war ebenfalls vermindert. In Konfrontationsassays war die Abtötung einer SAP9-Deletionsmutante verglichen mit dem Wildtyp reduziert. Die Degranulation stellt neben der Produktion von ROS einen weiteren wichtigen Effektormechanismus zur Abtötung von Mikroben dar, jedoch verlief die Freisetzung von Elastase ebenso unabhängig von SAP9 wie die durch neutrophile Granulozyten ausgelöste Wachstumsinhibition von Keimschläuchen. Die hier präsentierten Daten verbinden die Aktivität der Protease Sap9, der zuvor bereits eine Rolle in der Immunevasion von C. albicans zugeschrieben wurde, mit der Initiation der protektiven angeborenen Immunität. Wie C. albicans stimuliert auch A. fumigatus die Aktivität der neutrophilen Granulozyten. Microarray- Analysen mit Fokus auf dem Zytokinprofil neutrophiler Granulozyten während der Interaktion mit A. fumigatus-Hyphen offenbarten, dass nur wenige Zytokine im Lauf der Infektion hochreguliert wurden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass die Sap-Granulozyten-Interaktion neue molekulare Mechanismen zur Aktivierung dieser Zellen birgt. Zudem brachten die Microarray Analysen die Erkenntnis, dass die de novo-Zytokinsynthese durch A. fumigatus nur geringfügig beeinflusst wird und eine schnelle Abtötung des Pilzes offenbar im Vordergrund steht. / Human polymorphonuclear neutrophils (PMNs) play a major role in the immune defence against invasive infections caused by the pathogenic fungi Candida albicans and Aspergillus fumigatus. The aim of this work was to further characterize the interaction of both fungi with PMNs with a focus on diverse PMN effector functions. C. albicans expresses a set of aspartic proteases which are associated with virulence and can contribute to adhesion, tissue invasion and immune evasion. Here, the role of the aspartic proteases Sap1-6, Sap9 and Sap10 in the interaction with human neutrophils was analysed. It could be demonstrated that, in contrast to other aspartic proteases, the cell surface associated GPI-anchored enzyme Sap9 has a major impact on recognition of C. albicans by PMNs. SAP9 expression is required for the effective induction of PMN chemotaxis towards C. albicans filaments, an essential prerequisite of effective PMN activation. Targeted motility can be enhanced by autologous secretion of IL-8, but no influence of SAP9 on the process of IL-8 secretion could be observed here. However, deletion of SAP9 led to a mitigated release of reactive oxygen intermediates (ROI) in human PMNs. Likewise, C. albicans induced apoptosis triggered by ROI formation was decreased. In confrontation assays, killing of a SAP9 deletion mutant was reduced in comparison to the wild-type. Beside ROI production, degranulation represents an additional important effector mechanism contributing to microbial killing, however, the release of elastase in response to C. albicans was found to be not dependent on SAP9, as well as the PMN-mediated growth inhibition of germ tubes. The data presented here clearly implicate Sap9 protease activity, which was already attributed to immune evasion before, with the initiation of protective innate immunity. Like C. albicans, A. fumigatus evokes PMN antifungal activity. Custom-made microarray analyses focusing on the cytokine profile of PMNs during interaction with A. fumigatus hyphae revealed that only few cytokines are upregulated during the course of infection. In summary it could be demonstrated that the interaction between Saps and PMNs is revealing novel molecular mechanisms which lead to an activation of these cells. Furthermore, microarray analyses lead to the awareness that de novo cytokine synthesis of PMNs is barely influenced by A. fumigatus, pointing out that instant killing of the fungus might be of higher importance.

Patienten mit einer dekompensierten Leberzirrhose besitzen ein hohes Risiko bakterielle Infektionen zu entwickeln. Besonders häufig kommt es dabei zu einer spontan bakteriellen Peritonitis, wobei die Letalität bis heute noch immer bei bis zu 50 % liegt. Ein wesentlicher Grund für das generelle Infektionsrisiko besteht in der Zirrhose-assoziierten systemischen Immunparalyse als Folge einer andauernden Immunstimulation. Es ist allerdings ungeklärt warum bei Patienten mit Leberzirrhose die SBP die häufigste Infektion ist, wohingegen Patienten mit malignem Aszites dafür nicht empfänglich sind. Daher war das Ziel dieser Arbeit, die Funktionseinschränkung von PMNs im Aszites von Patienten mit Leberzirrhose zu evaluieren und dafür die Fähigkeit zur Phagozytose und stimuliertem oxidativen Burst in Aszites- und korrespondierenden Blutproben zu untersuchen.

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Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren Untersuchungen zu zellulären Mechanismen ANCA-assoziierter systemischer Vaskulitiden. Es wurde dabei zunächst die ANCA-induzierte Aktivierung neutrophiler Granulozyten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Quervernetzung der ANCA-Antigene auf der Oberfläche neutrophiler Granulozyten die Generation von Sauerstoffradikalen auslöst. Der zweite Komplex beschäftigte sich mit der Regulation der Apoptose neutrophiler Granulozyten, die einen zentralen Mechanismus für die Auflösung von Entzündungen darstellt. Die Ergebnisse zeigen, daß die Apoptose neutrophiler Granulozyten durch IL-8 verzögert und durch TNF-alpha akzeleriert wird. Dabei führt die Interaktion mit extrazellulären Matrixsubstanzen wie Fibronektin zu einer weiteren Akzeleration der TNF-alpha-induzierten Apoptose. Die Bedeutung der Tyrosin Phosphorylierung für diesen Prozess wird gezeigt, und Ly-GDI, ein regulatorisches Protein für kleine GTPase-Proteine der Ras-Superfamilie, wurde als ein Substrat der Tyrosin-Kinasen charakterisiert. Letztlich konnten neue Kandidaten-Proteine für die Regulation der Lebensspanne neutrophiler Granulozyten identifiziert werden. / Mechanisms of ANCA-associated vasculitis were studied. First, the activation of human neutrophils by ANCA was investigated. The data demonstrate the important role of cross-linking ANCA-antigens by the auto-antibodies on the cell surface for the initiation of a respiratory burst. The second issue was the regulation of neutrophil apoptosis that is central to the resolution of inflammation. These experiments indicate that apoptosis was delayed by IL-8 and accelerated by TNF-alpha. Interaction with extracellular matrix proteins, such as fibronectin resulted in further acceleration of apoptosis. The important role of protein tyrosine phosphorylation was demonstrated, and Ly-GDI, a regulator of GTPase-proteins of the ras-superfamily was characterized. Finally, proteins that may control the life span of neutrophils were identified.

Ziel dieser Arbeit war es herauszufinden, ob es sich bei der leukozytoklastischen Zelldesintegration der neutrophilen Granulozyten in kutaner leukozytoklastischer Vaskulitis (kLV) um Apoptose handelt. Um die zugrundeliegenden Mechanismen dieses Zellzerfalls näher zu charakterisieren, wurden Hautbiopsien von 9 Patienten mit klinisch und histologisch gesicherter kLV und 13 Hautbiopsien von Patienten mit kLV folgend auf intrakutane Histamin-Injektion im zeitlichen Verlauf untersucht. Licht und elektronenmikroskopisch wurde die Morphologie der Leukozytoklasie beurteilt. Immunhistologische Untersuchungen beinhalteten klassische pro-apoptotische Rezeptoren (CD95/CD95L), desweiteren über die Mitochondrien (Bax/Bcl-2) und auf genetischer Ebene die Apoptose regulierende Proteine (p53/p21). Es wurde zusätzlich die Expression von Zelloberflächen-Rezeptoren (FcgammaRIII/ FcgammaRII) beurteilt. Mittels der TUNEL-Methode wurde versucht die klassische DNA-Fragmentierung nachzuweisen. Obwohl strukturell und ultrastrukturell die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose vorlagen, konnte diese biochemisch nicht untermauert werden. DNA-Fragmentierung liess sich nur in schon von Makrophagen phagozytierten Kernfragmenten nachweisen. Neutrophile waren negativ und ihre Fragmente waren es vorwiegend. Den untersuchten Rezeptoren CD95/CD95L kommt allenfalls eine geringe und den Proteine, Bax/Bcl-2 und p53/p21 keine Rolle im Zellzerfall der Neutrophilen in dieser selbstlimitierten Entzündung zu. Interessanterweise wurde jedoch FcgammaRIII sehr stark auf der Oberfläche nicht nur intakter, sondern auch schon fragmentierter neutrophiler Granulozyten exprimiert. Dementsprechend ist anzunehmen, dass diese konstitutionell exprimierten Rezeptoren nicht nur eine Rolle in der Aktivierung, sondern auch eine Rolle in der darauf folgenden Auslösung der Apoptose in diesen Zellen spielen. Desweiteren dienen diese stark glykosylierten Rezeptoren möglicherweise als Phagozytose-Erkennungsmerkmal für Makrophagen. FcgammaRII liess sich hingegen nicht auf der Oberfläche der Neutrophilen und ihrer Fragmente nachweisen. Dies könnte einerseits durch eine Verdrängung durch FcgammaRIII bedingt sein, andrerseits könnten sie durch Immnunkomplex-Bindung eine separate oder zusätzliche Rolle in der Induktion des Zellzerfalls spielen. Zusammenfassend weist der leukozytoklastische Zellzerfall der Neutrophilen in kLV die klassischen morphologischen Merkmale der Apoptose auf, die biochemisch jedoch auf atypische Weise abläuft. In dieser Hinsicht zu erwähnen, ist vor allem die verzögerte oder durch DNasen der Makrophagen bedingte DNA-Fragmentierung. / The aim of this study was to find out whether leukocytoklastic cell desintegration of neutrophils in cutaneous leukocytoklastic vasculitis (clv) is apoptosis. In order to find out more about the underlying mechanisms leading to this form of cell desintegration and subsequent cell death skin sections of 9 patients with clinically and histologically verified clv and of 13 patients with clv after intradermal injection of histamine were examined at different timepoints. The structural and ultrastructural morphological features of leukoctyoklasia were evaluated light- and electronmicroscopically. Immunhistochemistry included well known death receptors (CD95/CD95L), mitochondrial proteins (Bax/Bcl-2), proteins interfering with the cell cycle (p53/p21) and cell surface receptors (FcgammaRIII/FcgammaRII). Furthermore DNAfragmentation was assessed by the TUNEL-method. Although the structural and ultrastructural features of leukocytoklastic cell desintegration of neutrophils in clv revealed typical apoptotic morphology, the underlying biochemistry didn`t match apoptotic means. DNA-fragmentation was only seen in a minor fraction of fragmented nuclei and prominent in already phagocytosed debris. Neutrophils at different locations (in the lumen of the postcapillary venules, within the wall of the blood vessels and in the perivascular tissue) were always negative.The examined death receptors, mitochondrial proteins and DNA-interfering proteins play no (Bcl-2/Bax, p53/p21) or only a minor (CD95/CD95L) role in the biochemical mechanism leading to the cell desintegration of these cells in this self-limited inflammation. Interestingly FcgammaRIII was highly expressed not only in intact but also extremely desintegrated neutrophils as well as on the surface of their fragments. One could therefore assume that this receptor not only plays a role in activation of these cells, but also might be involved in the following induction of the cell death programm. Maybe this highly glycosylated receptor also functions as an `eat me flag` in the recognition-mechansim by macrophages. FcgammaRII could not be shown on the cell surface of these cells in this context, which on the one hand could be due to the high expression of FcgammaRIII with no room left for FcgammaRII on the cell surface or due to a separate or additional role in the induction of the cell death programm. Finally leukocytoklastic cell desintegration shows strong resemblance to apoptosis but with non classical underlying biochmical mechanisms, most importantly to mention the delay in DNA-fragmentation which could also be due to DNAdegradation by DNases of macrophages.

Die COPD (chronic obstructive pulmonary disease) ist eine weltweit vorkommende, chronisch obstruktive Erkrankung der Lunge. Sie gilt als vierthäufigste Todesursache weltweit, wobei ein Viertel der akuten bakteriellen Exazerbationen auf eine Infektion mit Moraxella catharralis zurückzuführen sind. Sowohl das akute, als auch das chronische Entzündungsbild der COPD wird überwiegend durch neutrophile Granulozyten in den Atemwegen bestimmt, die neben antimikrobiellen Effektorfunktionen durch Freisetzung von Zytokinen auch die Entzündungsreaktion bzw. Immunantwort regulieren können. In dieser Arbeit wurde untersucht inwiefern die Interaktion von M.catarrhalis mit dem humanen Granuloyzten-spezifischen Rezeptor carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM)3 zu einer Aktivierung der neutrophilen Granuloyzten sowie zu einer NF-kappaB-abhängigen Chemokinproduktion führt. Primäre Granulozyten gesunder Spender sowie NB4 Zellen wurden mit M.catarrhalis in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren, siRNA oder CEACAM-blockender Antikörper infiziert und anschließend die Chemokinsekretion mittels ELISA bestimmt. Mit Hilfe eines Luziferase Reportergenassays und Chromatinimmunpräzipitation wurde die Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB untersucht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die spezifische Interaktion von CEACAM3 mit M. catarrhalis UspA1 in einer Aktivierung neutrophiler Granulozyten resultiert. Desweiteren kommt es zu einer CEACAM3-UspA1 abhängigen Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-kappaB und verstärkter Sekretion proinflammatorischer Chemokine. Die NF-kappaB-Aktivierung ist abhängig von der Phosphorylierung des CEACAM3 ITAM-like Motivs und erfolgt über den Syk und Card9 Signalweg. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass neutrophile Granulozyten in der Lage sind, die durch M. catarrhalis induzierte Atemwegsentzündung in der COPD über den Oberflächenrezeptor CEACAM3 spezifisch zu modulieren. / The chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is the fourth most common cause of death worldwide. 25 % of the acute bacterial exacerbations are caused by infection with the human restricted pathogen Moraxella catharralis. Both the acute and the chronic inflammatory stage of COPD are predominantly determined by neutrophil granulocytes in the respiratory tract, which in addition to antimicrobial effector functions can also regulate the inflammation or immune response by releasing cytokines. This work investigated if the interaction of M. catarrhalis with the human granulocyte-specific receptor carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule (CEACAM) 3 leads to an activation of the neutrophil granulocytes and to a NF-kappaB-dependent chemokine production. Primary granulocytes from healthy donors as well as NB4 cells were infected with M. catarrhalis in the presence of various inhibitors, siRNA or CEACAM-blocking antibodies, and then chemokine secretion was determined by ELISA. Using a luciferase reporter gene assay and chromatin immunoprecipitation, activation of the transcription factor NF-kappaB was investigated. In this work it could be shown that the specific interaction of CEACAM3 with M. catarrhalis UspA1 results in the activation of neutrophil granulocytes. Furthermore, there is a CEACAM3-UspA1-dependent activation of the transcription factor NF-kappaB and increased secretion of proinflammatory chemokines. NF-kappaB activation is dependent on the phosphorylation of the CEACAM3 ITAM-like motif and occurs via the Syk and Card9 signaling pathways. The results suggest that neutrophil granulocytes are able to specifically modulate M. catarrhalis induced airway inflammation in COPD via the surface receptor CEACAM3.