Assurer la disponibilité d'un métal afin de croitre est un processus microbien vital,particulièrement critique lorsque la source devient rare comme à l'intérieur d'un hôte. Dans ces travaux, nous décrivons et étudions deux opérons prédits pour coder les différentes fonctions permettant la synthèse, l'export et la récupération d'un nouveau métallophorebactérien analogue à nicotianamine des plantes. Des études préliminaires ainsi que d'autresétudes indiquent que ces systèmes sont fonctionnels, qu'ils permettent l'import de nickel et decobalt et que les transporteurs prédits sont importants pour la virulence de S. aureus. Encombinant des approches de biochimie, de génétique et de métabolomique nous proposons lastructure de ce métallophore chez S. aureus et P. aeruginosa et proposons aussi leurs modesde biosynthèse. Ce modèle reste encore à valider par des approches complémentaires maispermettrait de décrire pour la première fois un métallophore spécifique du nickel et du cobaltet un mode de synthèse original faisant appel à une épimérase, une enzyme apparentée auxnicotianamine synthase et enfin à une protéine appartenant à la famille DUF2338. Laconnaissance et l'utilisation de ces systèmes permettent aussi d'envisager des systèmes debioremédiation ou bien de récupération du nickel et du cobalt. / Ensuring the availability of a given metal for growth is a vital microbial process,especially critical when the source becomes scarce like inside a host. In this work, wedescribe and study two operons predicted to encode the various functions for the synthesis,export and recovery of a new bacterial metallophore similar to plant's nicotianamine.Preliminary studies as well as studies in the literature indicate that these systems arefunctional, participate in the import of nickel and cobalt and that the predicted transporters areimportant for the virulence of S. aureus. By combining approaches from biochemistry,genetics and metabolomics we propose the structure of this metallophore in S. aureus and P.aeruginosa and also offer ways of their biosynthesis. This model remains to be validated butwould describe for the first time a specific metallophore for nickel and cobalt and an originalbiosynthetic route involving an epimerase, an enzyme related to nicotianamine synthase andfinally a protein belonging to the DUF2338 family. The knowledge of these systems alsooffers the possibility to exploit them in the bioremediation or recovery of nickel and cobalt.

Nos travaux ont porté sur la mise au point de nouvelles stratégies de synthèse de la nicotianamine (molécule naturelle ubiquitaire chez les plantes et impliquée dans le transport du fer in planta) qui ont été appliquées à la préparation de nouveaux analogues naturels et non-naturels inédits. Les propriétés chélatrices d'un de ces analogues naturels, la thermonicotianamine, ont été mises en évidence par spectrométrie de masse.Ce manuscrit est organisé en quatre chapitres : la première partie présente un point bibliographique sur le rôle central de la nicotianamine dans l'homéostasie du fer chez la plante. Puis, nous avons décrits, après un aperçu de l'état de l'art sur les synthèses de la nicotianamine et de ses analogues naturels et non-naturels, notre nouvelle stratégie de synthèse de la basée sur la réaction de N-alkylation. Afin de répondre à un besoin de nouvelles molécules et de réduire leur temps de fabrication nous avons développé la première synthèse de la NA et de ses analogues sur support. Enfin, après une vue de l'état de l'art sur les méthodes d'analyse des phytosidérophores et de leurs complexes avec les métaux, les propriétés chélatrices de la tNA avec les métaux ont été étudiées par spectrométrie de masse. / Our work focused on developing new strategies for synthesis of nicotianamine (a natural molecule ubiquitous in plants and involved in iron transport in planta) which have been applied to the preparation of new natural and unnatural analogues. The chelating properties of a natural analogue, the thermonicotianamine, were investigated by mass spectrometry.This manuscript is organized into four chapters: the first part presents a literature review on the central role of nicotianamine in iron homeostasis in plants.After an overview of the state of the art in the synthesis of nicotianamine and its natural and non-natural analogues, we described our new synthetic strategy based on the N-alkylation reaction.To meet the need for new molecules and reduce manufacturing time we developed the first synthesis of nicotianamine and its analogues on solid phase.Finally, after a view of the state of the art on methods for analyzing phytosiderophores and their complexes with metal, chelating properties of thermonicotianamine with metals have been studied by mass spectrometry.

Les bactéries magnétotactiques (MTB) sont des organismes capables de synthétiser des cristaux magnétiques au sein d’un organite particulier, le magnétosome. L’assemblage de ces magnétosomes leur confère des propriétés d’aimantation et d’orientation dans les champs magnétiques. Dans le contexte de l’essor des biotechnologies, nous avons procédé à la fonctionnalisation des MTB pour des applications de bioremédiation du cobalt.Nous avons ainsi développé des vecteurs adaptés aux MTB pour l’expression de machineries enzymatiques de Staphylococcus aureus et Pseudomonas aeruginosa permettant la production de métallophores analogues à la nicotianamine. Nous avons observé un phénotype double, d’augmentation de la résistance aux métaux et d’augmentation de l’accumulation du cobalt que ce soit chez Escherichia coli ou les MTB Magnetospirillum magneticum AMB-1 et Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1. Nous avons également observé que l’expression de systèmes d’import des métaux tel que la NiCoT perméase NxiA de Rhodopseudomonas palustris dans des souches exprimant les analogues de la nicotianamine permet d’accroître encore l’accumulation des métaux.De plus, nous avons montré que la production de ces analogues permet un enrichissement en cobalt des magnétosomes, mais ne conduit pas à de modification de la spéciation de ce métal chez les MTB.Nous proposons donc ici l’utilisation des MTB comme châssis cellulaire pour de nouvelles applications biotechnologiques. / Magnetotactic bacteria (MTB) are organisms able to synthesize magnetic crystals within a specific organelle, the magnetosome. The assembly of these magnetosomes gives them magnetization and orientation properties in magnetic fields. In the context of the development of biotechnology, we have performed the functionalization of MTBs for cobalt bioremediation applications.We have thus developed vectors suitable for MTB for the expression of enzymatic machineries of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa allowing the production of metallophores analogous to nicotianamine. We observed a double phenotype, increased resistance toward metals and increased cobalt accumulation in Escherichia coli or MTBs Magnetospirillum magneticum AMB-1 and Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1. We have also observed that the expression of metal import systems such as Rhodopseudomonas palustris NiCoT permease NxiA in strains expressing nicotianamine analogs further increases the accumulation of metals.Moreover, we have shown that the production of these analogs allows a cobalt enrichment of the magnetosomes, but does not lead to a modification of the speciation of this metal in MTB.We introduce here the use of MTBs as cellular chassis for new biotechnological applications.

La nicotianamine est une molécule naturelle qui joue un rôle essentiel dans la régulation des concentrations en métaux de transition dans les plantes. Sa structure comprend trois acides carboxyliques et trois fonctions amines. L'objectif du travail présenté dans ce manuscrit est d'établir un protocole permettant de reproduire les propriétés de chélation de cette molécule grâce à des calculs de chimie quantique. L'intérêt est d'appliquer ce protocole à des analogues synthétiques de la nicotianamine, afin de prédire leurs propriétés.Le protocole que nous avons mis au point s'articule autour de quatre axes : le calcul des pKa, l'étude des propriétés de chélation, le calcul de tenseur g de résonance paramagnétique électronique et l'analyse des propriétés vibrationnelles. Ces différents points ont nécessité le développement de méthodes de calcul et d'outils innovants. Les calculs de chimie quantique qui ont été effectués sont basés sur la théorie de la fonctionnelle de la densité. On a utilisé des fonctionnelles hybrides, associées à un modèle de solvant implicite ou semi-explicite qui permet de prendre en compte l'effet du milieu.Nous avons proposé une méthode graphique originale adaptée à la nicotianamine permettant le calcul de ses six pKa ainsi que celui des pka des complexes formés avec les métaux de transition. Cette méthode conduit à une bonne précision sur les calcul de pKa dans l'intervalle de pH physiologique. Ces pKa renseignent sur le comportement de la nicotianamine dans différents milieux végétaux. Nous avons aussi envisagé plusieurs protocoles pour l'étude des propriétés de chélation de la nicotianamine.Pour compléter l'étude des complexes de la nicotianamine, nous avons paramétré une méthode simple et rapide de calcul du tenseur g de systèmes moléculaires contenant du cuivre paramagnétique. Enfin, nous avons développé un programme graphique permettant l'analyse des modes de vibration infrarouges de systèmes moléculaires comme les complexes métal-nicotianamine étudiés. / Nicotianamine is a triamino acid that plays an essential role in regulation and transportation of transition metals in plants by a chelation process. Functional analogues of this molecule have already been synthesised that we hope to use for selective soil decontamination thanks to their property changes with respect to nicotianamine. Therefore, the aim of the present work is to find a predictive protocol for the chelating properties of these analogues, using the know example of nicotianamine. We worked out a predictive protocol focusing on the four following points : pKas, chelation, EPR tensors and vibrational properties. It uses quantum chemistry methods such as hybrid DFT functionals and implicit solvent models.The pKa calculations for nicotianamine and metal-nicotianamine complexes were performed using a novel graphical method well suited to these systems. The pKas are useful to understand the effect of the various plants pHs on the complexes. Then we computed the chelation constants and the structures of metal-nicotianamine complexes. As a complement to the study of these complexes, we set up protocols to calculate the EPR tensors of the copper-nicotianamine complex and to analyse the infra-red vibrations of the complexes, using respectively a parametrised method and a local code.

De nombreux métaux sont indispensables au métabolisme cellulaire, d’autres sont considérés toxiques même à de faibles concentrations. Différents champignons appartenant à des différents groupes taxonomiques ont été identifiés dans des milieux pollués et ont révélé une capacité à survivre et à croître en présence de concentrations potentiellement toxiques. Pour s'adapter à ce stress, les champignons ont développé plusieurs mécanismes au niveau intracellulaire et extracellulaire. En particulier, ils sont connus pour leur capacité à sécréter un large panel de protéines. Cependant, leur rôle dans l'adaptation des champignons à la toxicité des métaux n'a pas encore été étudié. Pour répondre à cette question, le champignon Botrytis cinerea a été soumis à un stress métallique en présence de cuivre, zinc, nickel ou cadmium, les protéines sécrétées ont été collectées et séparées par 2D-PAGE. Deux métabolites ont également été analysés, l'acide oxalique et la nicotianamine. Enfin, les capacités de biosorption des champignons isolés à partir de sols pollués ont été étudiées. L'analyse du sécrétome a révélé 116 spots dont le volume varie en réponse d'au moins un métal. Cinquante-cinq de ces spots sont associés à des protéines uniques. La classification fonctionnelle de ces protéines a révélé que la production d'oxydoréductases et des enzymes dégradant la paroi cellulaire a été modifié en réponse aux métaux. L’étude de la production d'acide oxalique par Botrytis cinerea en réponse aux métaux montre une induction de la sécrétion d'oxalate en réponse au Zn et une accumulation de la nicotianamine, métabolite intracellulaire capable de fixer les métaux chez les plantes. Le gène de la nicotianamine synthase, est d’ailleurs surexprimé en présence de Cu, Zn et Ni. Plusieurs espèces fongiques ont été isolées à partir de sols pollués par des métaux, parmi ceux-ci Trichoderma asperellum et Zygorrhynchus moelleri montrent les meilleurs capacités de biosorption (10mg de Cu/g de matière sèche) des ions Cu / Metal ions are essential elements in many cellular processes. However, metal excess becomes toxic and constitutes a global environmental hazard. A range of fungi from all major taxonomic groups were found in metal-polluted habitats and the ability to survive and grow in the presence of potentially toxic concentrations is frequently encountered. To adapt to this stress, fungi have evolved several mechanisms at both intracellular and extracellular levels. In particular, fungi are well known for their ability to secrete a large panel of proteins. However, their role in the adaptation of fungi to metal toxicity has not yet been investigated. To address this question, here, the fungus Botrytis cinerea was challenged to copper, zinc, nickel or cadmium stress and secreted proteins were collected and separated by 2D-PAGE. Two metabolites were also analyzed, oxalic acid and nicotianamine. Finally, biosorption capacities of fungi isolated from polluted soils were investigated. Secretome analysis revealed one hundred and sixteen spots whose volume varied in at least one tested condition were observed on 2D gels. Fifty-five of these spots were associated with unique proteins and functional classification revealed that the production of oxidoreductases and cell-wall degrading enzymes was modified in response to metals. Study of oxalic acid and nicotianamine (NA) production by Botrytis cinerea in response to tested metals reveal that Zn induces oxalate secretion and that NA synthase gene is upregulated in presence of Cu, Zn and Ni. Many fungal species were isolated from metal polluted soils among them Trichoderma asperellum and Zygorrhynchus moelleri which show the maximum biosorption capacities of Cu ions

The co-ordination of Ni in hyperaccumulator plants was investigated using a number of mass spectrometry (MS)-based analytical techniques. Initial field studies on nickeliferous (lateritic) soils in Western Australia failed to identify plants containing elevated metal concentrations. For this reason, Ni-hyperaccumulators were collected from known ultramafic sites in New Caledonia, as well as grown under controlled conditions. Using electrospray ionization MS a Ni-nicotianamine (Ni-NA) complex [NiII(C12H20N3O6)]+ was identified in the South African Ni-hyperaccumulator Berkheya coddii. The association between Ni and NA was examined further in a range of Thlaspi species which accumulate different concentrations of Ni and Zn in their foliar tissues. In order to quantitate the concentration of NA a new liquid chromatography-MS (LC-MS) based analytical protocol was developed which allowed the quantification of NA and free amino acids. From the analysis of the leaf tissue in Thlaspi a strong correlation emerged between Ni and NA but not Zn. This suggested that NA plays a role in the transport of Ni in Ni-hyperaccumulating Thlaspi plants. An inverse proportionality was found between Fe and Ni. Higher NA production could be related to maintenance of Fe homeostasis. A correlation was also found between Zn and asparagine. These results are consistent with the operation of separate transport mechanisms for Ni and Zn. Further extreme examples of Ni-hyperaccumulation were also examined using LC-MS and metabolite profiling based on gas chromatography-MS (GC-MS). (For complete abstract open document)