The α7 nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) is involved in learning and memory, synaptic plasticity, neuroprotection, inflammation, and presynaptic regulation of neurotransmitter release. Alzheimer’s disease (AD), a neurodegenerative disease characterized by diminished cognitive abilities, memory loss, and neuropsychiatric disturbances, is associated with a loss of nAChRs. Similarly, traumatic brain injury (TBI) may result in long term neurobehavioral changes exemplified by cognitive dysfunction. Deficits in α7 nAChR expression have previously been shown in experimental TBI and may be related to cognitive impairment experienced in patients following TBI. The purpose of this dissertation was to investigate changes in α7 nAChR expression in models of neurodegeneration and determine if allosteric modulation of the nAChR facilitates functional recovery following experimental TBI through changes in nAChRs. Experimental models employed include a transgenic mouse model of AD that overexpresses the amyloid precursor protein (APPswe mice) and the controlled cortical impact injury model of TBI in rats. Quantitative receptor autoradiography using α-[125I]-bungarotoxin and [125I]-epibatidine and in situ hybridization were used to investigate changes in nAChR density and mRNA expression, respectively. In the first study, the effects of aging and β-amyloid on α7 nAChR expression were evaluated in APPswe mice. Hippocampal α7 nAChR density was significantly upregulated in APPswe mice compared to wild-type mice. It is postulated that elevated Aβ levels bind to the α7 nAChR resulting in upregulation. In a second study, galantamine, a medication used in the treatment of AD, was administered subchronically following experimental TBI to determine if treatment could facilitate cognitive recovery and affect nAChR expression. Interestingly, the results indicate TBI interferes with agonist mediated upregulation of nAChRs, and galantamine did not improve function in a behavioral task of learning a memory. In a third study, the regulation of TBI related deficits in α7 nAChRs was examined 48 hours following injury. α7 nAChR deficits occurred with a reduction in α7 mRNA in several hippocampal regions and non-α7 nAChR deficits occurred with a reduction in α4 mRNA in the metathalamus. The results of these studies suggest AD and TBI may involve complex but parallel processes contributing to the regulation of α7 nAChRs.

Doctor of Philosophy(PhD) / The aims of this project were to contribute to the elucidation of the role of the cholinergic system in attention and memory, two cognitive processes severely compromised in Alzheimer’s disease (AD), and to evaluate and develop tools for the functional molecular imaging of this system with a view to improving knowledge of AD and other neurological disorders. Towards the first aim, the specific anti-cholinergic toxin 192 IgG-saporin (SAP) was administered to female Sprague-Dawley rats via either an intracerebroventricular (icv) or an intracortical route and animals were tested with a vibrissal-stimulation reaction-time task and an object recognition task to evaluate their attentional and mnemonic function, respectively. The second aim was approached in two ways. Firstly, relative neuronal densities from animals with icv lesions were assessed with both ex vivo and in vitro autoradiography with the specific cholinergic radiopharmaceuticals [123I]iodobenzovesamicol (123IBVM) and 125I-A-85380, ligands for the vesicular acetylcholine transporter and the nicotinic acetylcholine receptor, respectively. Secondly, a number of in vivo and in vitro studies were performed on a novel and unique molecular imaging system (TOHR), with which it had been hoped initially to image eventually SAP-lesioned animals, with a view to measuring and ameliorating its performance characteristics and assessing its in-principle suitability for small-animal molecular imaging. The behavioural studies support a critical role for the cholinergic system in normal attentional function. Additionally, in accord with literature evidence, no significant impairment was observed in mnemonic function. It is postulated however that the results observed in the intracortically-lesioned animals support the published hypothesis that cholinergic projections to the perirhinal cortex are critical for object-recognition memory. In autoradiographic studies, SAP-lesioned animals demonstrated reduced uptake of 123IBVM in multiple regions. A reduction of nicotinic receptors was also seen in SAP-lesioned animals, a novel finding supportive of the excellent characteristics of radioiodinated I-A-85380. Examination of the performance characteristics of the TOHR support in principle its utility for targeted small-animal molecular imaging studies.

Ο νικοτινικός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης ανήκει στην υπερ-οικογένεια των ιοντικών διάυλων ενεργοποιούμενων μέσω προσδέτη (ligand-gated ion channels). Οι υπομονάδες των υποδοχέων που ανήκουν στην οικογένεια αυτή, φέρουν στο αμινοτελικό τους άκρο τη χαρακτηριστική κυστεϊνική θηλιά (Cys-loop) μεταξύ δύο συντηρημένων καταλοίπων κυστεΐνης, οι οποίες συνδέονται με δισουλφιδικό δεσμό. Οι νικοτινικοί υποδοχείς της ακετυλοχολίνης είναι μεγάλες διαμεμβρανικές πρωτεΐνες που αποτελούνται από πέντε ομόλογες υπομονάδες και χωρίζονται σε δυο κατηγορίες, τους νευρικούς και τους μυϊκούς. Οι νευρικοί υποδοχείς εκφράζονται κυρίως στο κεντρικό και περιφερικό νευρικό σύστημα, καθώς και σε μη-νευρικούς ιστούς, όπως τα επιθηλιακά κύτταρα και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Επιπλέον, χωρίζονται σε δύο υποκατηγορίες, τους ετεροπενταμερείς, όπως είναι η (α4)x(β2)y, και τους ομοπενταμερείς, όπως η (α7)5. Οι μυϊκοί υποδοχείς απαντώνται στις μετασυναπτικές μεμβράνες των νευρομυϊκών συνάψεων των σπονδυλωτών και στα ηλεκτρικά όργανα ορισμένων ψαριών και εμφανίζουν στοιχειομετρία (α1)2β1γδ (στα έμβρυα) ή (α1)2β1εδ (στους ενήλικες). Ο μυϊκός υποδοχέας της ακετυλοχολίνης σε σχέση με τα υπόλοιπα μέλη της υπερ-οικογένειας, είναι ο καλύτερα μελετημένος ως προς τα χαρακτηριστικά και τη λειτουργία του. Ένας από τους κύριους παράγοντες που συνέβαλε στον εκτεταμένο χαρακτηρισμό του μυϊκού υποδοχέα είναι η δυνατότητα απομόνωσης, σε μεγάλες ποσότητες και σε λειτουργική μορφή, υποδοχέων της ακετυλοχολίνης παρόμοιων με αυτούς της νευρομυϊκής σύναψης από τα ηλεκτρικά όργανα των ψαριών Torpedo και Electrophorus. Οι πρώτες πληροφορίες για την τρισδιάστατη δομή του υποδοχέα δόθηκαν από ένα μοντέλο ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, από υποδοχέα που απομονώθηκε από το ηλεκτρικό όργανο του ψαριού Torpedo marmorata. Στη συνέχεια, η λύση της δομής ενός ομολόγου του εξωκυτταρικού τμήματος του υποδοχέα, της acetylcholine binding protein (AChBP) από το σαλιγκάρι Lymnaea stagnalis έφερε και τις πρώτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης. Η AChBP είναι μια υδατοδιαλυτή πρωτεΐνη, η οποία σχηματίζει σταθερά ομοπενταμερή, με ομολογία 20%-24% με το εξωκυτταρικό τμήμα των υπομονάδων του υποδοχέα. Πρόσφατα, η λύση της δομής της εξωκυτταρικής περιοχής της α1 υπομονάδας του υποδοχέα ποντικού, στην οποία είχε προσδεθεί ο ανταγωνιστής της ακετυλοχολίνης α-μπουγκαροτοξίνη, προσέφερε επιπλέον πληροφορίες για τα χαρακτηριστικά του υποδοχέα, όπως είναι η κύρια ανοσογόνος περιοχή (MIR) και η συντηρημένη Cys-loop περιοχή. Παρόλα αυτά δεν έχουν δημοσιευτεί υψηλής ανάλυσης πληροφορίες για τη δομή του ανθρώπινου υποδοχέα. Επιπλέον από το φυσιολογικό ρόλο του μυϊκού υποδοχέα, ο οποίος είναι άμεσα υπεύθυνος για τη διαβίβαση της ώσης στη νευρομυϊκή σύναψη, παράλληλα ο υποδοχέας αυτός αποτελεί και στόχο για πολλά κληρονομικά και επίκτητα νοσήματα, στα οποία ανήκει και το αυτοάνοσο νόσημα μυασθένεια. Στη νόσο αυτή, αυτοαντισώματα έναντι του μυϊκού υποδοχέα προκαλούν μείωση των διαθέσιμων λειτουργικών υποδοχέων στη νευρομυϊκή σύναψη με συνέπεια να παρεμποδίζεται η δράση της ακετυλοχολίνης. Αυτοαντισώματα έναντι του υποδοχέα της ακετυλοχολίνης εντοπίζονται στο 80%-90% των μυασθενών και η παρουσία τους θεωρείται ο κύριος παθογόνος παράγοντας για τη μυασθένεια. Ο σημαντικός ρόλος λοιπόν του υποδοχέα σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις, τον καθιστά αντικείμενο εντατικής έρευνας. Η λεπτομερής ανάλυση της δομής και της λειτουργίας του θα μπορούσε να συμβάλλει στην κατανόηση της δομής και της λειτουργίας των υπόλοιπων υποδοχέων-μελών της υπερ-οικογένειας καθώς επίσης και στην εξιχνίαση του αυτοάνοσου μηχανισμού της μυασθένειας. Ωστόσο, το μεγάλο μέγεθος του μορίου του υποδοχέα, ο υδρόφοβος χαρακτήρας του και η αδυναμία απομόνωσής του από φυσικές πηγές, δυσχεραίνει την πραγματοποίηση δομικών μελετών. Για το λόγο αυτό, είναι αναγκαίο να προκύψουν πρωτεϊνικά μόρια με δομή η οποία να πλησιάζει αρκετά τη φυσική διαμόρφωση του νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης και σε ποσότητες ικανές ώστε να είναι εφικτές οι δομικές μελέτες τους. Προηγούμενα, είχαν εκφραστεί στο εργαστήριό μας οι εξωκυτταρικές περιοχές (ΕΚΠ) των υπομονάδων α1, β1, γ και ε (α1ΕΚΠ, β1ΕΚΠ, γΕΚΠ και εΕΚΠ) του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα, χρησιμοποιώντας ως σύστημα έκφρασης το ζυμομύκητα Pichia pastoris. Οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, απομονώθηκαν σε διαλυτή και γλυκοζυλιωμένη μορφή, αναγνωρίζονταν από μονοκλωνικά αντισώματα έναντι της κάθε υπομονάδας, αλλά και από αντισώματα προερχόμενα από ορούς μυασθενών. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα δεν ήταν ικανοποιητικά για δομικές μελέτες. Παρόλα αυτά, οι ανασυνδυασμένες αυτές πρωτεΐνες, χρησιμοποιήθηκαν επιτυχώς για μια καινούρια αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, η οποία έγκειται στην ειδική αφαίρεση των αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, χρησιμοποιώντας τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες ως ανοσοπροσροφητές. Η χρήση της α1ΕΚΠ του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ως ανοσοπροσροφητή, είχε ως αποτέλεσμα την αφαίρεση μεγάλου ποσοστού αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Παρόμοια ήταν και τα αποτελέσματα με τη χρήση των εξωκυτταρικών τμημάτων των υπομονάδων β1, γ και ε ως ανοσοπροσροφητές. Ωστόσο, με τον τρόπο αυτό δεν επιτυγχάνεται πλήρης απομάκρυνση των παθογόνων αυτοαντισωμάτων. Η παρούσα εργασία είχε στόχο τη βελτίωση της δομής, της διαλυτότητας και των επιπέδων έκφρασης των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, έτσι ώστε να είναι κατάλληλες για δομικές μελέτες και κυρίως για να συμβάλλουν στις προσπάθειες βελτίωσης της αντιγονοειδικής θεραπείας για τη μυασθένεια. Ειδικότερα, το πρώτο μέρος αφορά μελέτες σχετικές με την έκφραση της γΕΚΠ, η οποία σχημάτιζε ολιγομερή και είχε πολύ χαμηλά επίπεδα έκφρασης. Σχεδιάστηκαν λοιπόν 4 μεταλλάγματα, με την προοπτική να προκύψουν πιο διαλυτά και υδρόφιλα μόρια. Οι μεταλλάξεις που σχεδιάστηκαν αφορούσαν στην αντικατάσταση συγκεκριμένων κυστεϊνών, που θα μπορούσαν να σχηματίζουν ακατάλληλους ένδο- ή δια-μοριακούς δεσμούς (μέσω δισουλφιδικών δεσμών), καθώς επίσης και στην αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής με την αντίστοιχη, πιο υδρόφιλη της AChBP. Στα δύο μεταλλάγματα που έφεραν τη Cys-loop περιοχή της AChBP, παρατηρήθηκε δραματική βελτίωση στα επίπεδα έκφρασης και στη διαλυτότητα των μορίων, ενώ ακόμη προσεγγίστηκε το αναμενόμενο μοριακό μέγεθος, όπως φανέρωσαν τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης καθώς και οι μετρήσεις δυναμικής σκέδασης φωτός. Όταν τα δύο βελτιωμένα μεταλλάγματα χρησιμοποιήθηκαν ως ανοσοπροσροφητές για την αντιγονοειδική θεραπεία που προαναφέρθηκε, παρουσίασαν βελτιωμένη ικανότητα πρόσδεσης αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών, συγκριτικά με την αγρίου τύπου γΕΚΠ. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν ότι η υδρόφοβη Cys-loop περιοχή της αγρίου τύπου γΕΚΠ συμβάλλει σημαντικά στη δημιουργία συσσωματωμάτων κατά την έκφραση της ΕΚΠ και για το λόγο αυτό ακολούθησε η αντικατάσταση αυτής της περιοχής και στις υπόλοιπες ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα. Προκειμένου να βελτιωθεί περαιτέρω η αντιγονοειδική θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, πραγματοποιήθηκαν προσπάθειες να συνεκφραστούν όλες οι ΕΚΠ των υπομονάδων του μυϊκού υποδοχέα, με σκοπό να δημιουργηθούν σύμπλοκα που διαθέτουν και τις διεπιφάνειες μεταξύ των ΕΚΠ του υποδοχέα, οι οποίες πιστεύεται ότι είναι και αυτές ανοσογόνες. Στις προσπάθειες αυτές χρησιμοποιήθηκαν οι μεταλλαγμένες ΕΚΠ των υπομονάδων που φέρουν τη Cys-loop περιοχή της AChBP. Οι αρχικές συνεκφράσεις των ΕΚΠ όλων των υπομονάδων του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα ήταν ανεπιτυχείς όσον αφορά στη δημιουργία συμπλόκων. Προκειμένου λοιπόν, να πραγματοποιηθεί ο συνδυασμός όλων των ΕΚΠ των υπομονάδων και η δημιουργία ενός λειτουργικού μορίου, το επόμενο βήμα ήταν η σύνδεση των υπομονάδων με ένα πεπτιδικό συνδέτη επαναλαμβανόμενων αμινοξέων. Ο συνδέτης που χρησιμοποιήθηκε αποτελείται από οκτώ επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)8. Αρχικά κατασκευάστηκαν όλα τα ζεύγη (συγκαταμερή) που χρειάζονται, για να επακολουθήσουν πολλαπλά στάδια υποκλωνοποιήσεων, προκειμένου να σχηματιστεί το πενταμερές. Όλα τα συγκαταμερή παρουσίασαν το αναμενόμενο μοριακό βάρος όπως φάνηκε από ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου σε αποδιατακτικές συνθήκες (SDS-PAGE), γεγονός που σημαίνει ότι ο συνδέτης δεν πρωτεολύεται και είναι ικανός να συγκρατεί τις υπομονάδες ενωμένες. Επιπλέον, τα επίπεδα έκφρασης που παρουσίασαν τα συγκαταμερή ήταν ικανοποιητικά και όλα τα συγκαταμερή που έφεραν την α1ΕΚΠ διατήρησαν την ικανότητα να προσδένουν σημασμένη α-μπουγκαροτοξίνη, η οποία προσδένεται ειδικά στην α1ΕΚΠ με υψηλή συγγένεια. Ωστόσο, τα αποτελέσματα από τη χρωματογραφία μοριακής διήθησης, φανέρωσαν ότι όλα τα συγκαταμερή εκλούονται δίνοντας ένα ευρύ φάσμα μοριακών βαρών, από μονομερή μέχρι ολιγομερή και συσσωματώματα. Τέλος, η α1ΕΚΠ-(AGS)8-γΕΚΠ παρουσίασε αυξημένη ικανότητα πρόσδεσης 125Ι-α-Βgt συγκριτικά με την γΕΚΠ-(AGS)8-α1ΕΚΠ, γεγονός που σημαίνει ότι η σειρά με την οποία συνδέονται οι υπομονάδες, παίζει σημαντικό ρόλο στη διαμόρφωση των μορίων. Στην προσπάθεια βελτίωσης της διαμόρφωσης και των χαρακτηριστικών των συγκαταμερών, έγινε χρήση ενός μεγαλύτερου συνδέτη, αποτελούμενου από έντεκα επαναλαμβανόμενες τριάδες των αμινοξέων αλανίνη – γλυκίνη – σερίνη (AGS)11, ωστόσο δεν παρατηρήθηκαν διαφορές στα τελικά προϊόντα έκφρασης. Όσον αφορά στη χρήση των συγκαταμερών στη θεραπευτική προσέγγιση για τη μυασθένεια, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι όλα τα συγκαταμερή διατήρησαν πλήρως την ικανότητα να προσδένουν αυτοαντισώματα από τους ορούς των μυασθενών, αν και δε βελτίωναν περαιτέρω την ικανότητα ανοσοπροσρόφησης των επιμέρους ΕΚΠ. Συμπερασματικά λοιπόν, καταλήγουμε ότι η αντικατάσταση της υδρόφοβης Cys-loop περιοχής των ΕΚΠ των υπομονάδων με την αντίστοιχη, υδρόφιλη περιοχή του ομολόγου AChBP, οδηγεί στη δημιουργία μορίων με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, όπως είναι τα επίπεδα έκφρασης και η διαλυτότητα των μορίων. Τα μόρια αυτά μπορούν στη συνέχεια να συνδεθούν με ένα πεπτιδικό συνδέτη και να παραχθούν συγκαταμερή με σωστή διαμόρφωση, τα οποία διατηρούν τα λειτουργικά χαρακτηριστικά τους, όπως είναι η πρόσδεση σημασμένης α-μπουγκαροτοξίνης και η πρόσδεση αυτοαντισωμάτων από ορούς μυασθενών. Τα δεδομένα αυτά ενισχύουν την πεποίθηση ότι είναι εφικτή η κατασκευή του ετεροπενταμερούς του ανθρώπινου μυϊκού υποδοχέα που θα αποτελείται μόνο από τις ΕΚΠ των υπομονάδων του. / The nicotinic acetylcholine receptor (AChR) belongs to the superfamily of pentameric ligand-gated ion channels (LGIC), also known as the Cys-loop receptor family. The subunits of the receptors belonging to this superfamily carry at their N-terminal domain characteristic, highly conserved Cys-loop region, a string of 13 amino acids linked by a disulfide bond. AChRs are large, transmembrane glycoproteins, which are composed of five homologous subunits, arranged around a central ion channel and they are divided into two subgroups, the neuronal and the muscle type. The neuronal receptors are expressed mainly in the central and the peripheral nervous system, as well as in non-neuronal tissues, such as epithelial and immune cells. Moreover, the neuronal receptors are further subdivided into two categories, the heteropentamers, such as (α4)x(β2)y, and the homopentamers, such as (α7)5. The muscle AChRs are located on the postsynaptic membrane of the neuromuscular junction and have the subunit composition α2βγδ (embryonic) or α2βεδ (adult). The muscle AChR is the best studied model from the superfamily of the LGICs, as far as its characteristics and function are concerned. One of the major reasons which contributed to its extensive characterization is the ability to isolate, in great amounts and in a functional form, AChRs similar to these of the neuromuscular junction from the electric organs of the fishes Torpedo and Electrophorus. An electron microscopy model of the Torpedo marmorata, purified from the electric organ of the electric ray, provided the first information about the three-dimensional structure of the AChR. The first high resolution insight was provided by the solved crystal structure of the AChBP from the snail Lymnaea stagnalis, a homologue of the extracellular domain (ECD) of the AChR. The AChBP is a soluble protein, which forms stable homopentamers and shares high homology with the ECDs of the AChR (20%-24%). Recently, the solved crystal structure of a mutated mouse α1ECD bound to α-bungarotoxin provided further information for a number of receptor-specific elements, including the main immunogenic region (MIR) and the Cys-loop. Nevertheless, high resolution information about the three-dimensional structure of the human AChR has not been reported so far. In addition to the physiological role of the muscle AChR, which is responsible for mediating the neuromuscular transmission, the muscle AChR is the target for a number of acquired and hereditary diseases, including the autoimmune disease myasthenia gravis (MG). In MG, autoantibodies against the AChR cause loss of the available and functional AChRs in the neuromuscular junction, and as a consequence, the action of acetylcholine is blocked. Autoantibodies against AChR are found in nearly 80%-90% of patients with generalized MG and are considered the main pathogenic factor in MG. The important pathophysiological roles of the AChRs made them subject to intensive research. The detailed analysis of the structure and function of the AChR could contribute to the understanding of the structure and function of the rest of the members of the superfamily, as well as to the comprehension of the pathogenic mechanism of MG. However, the fact that the AChR is a big, hydrophobic molecule, difficult to purify from natural sources, make the accomplishment of structural studies hard. It is necessary to generate recombinant molecules with conformation similar to that of the native AChR, in efficient amounts, in order to perform structural studies. We have previously expressed the human muscle AChR α1, β1, γ and ε ECDs using the yeast Pichia pastoris. These recombinant proteins were purified in a soluble and glycosylated form, recognizable by both monoclonal antibodies and a considerable percentage of anti-subunit antibodies in positive sera from MG patients. However, both the expression yield and the solubility of these proteins were not satisfactory for structural studies. Nevertheless, they were successfully used for a novel, antigen-specific therapeutic approach against MG, regarding the specific removal of the autoantibodies from MG sera, using these proteins as immunoadsorbents. The use of the human α1ECD as an immunoadsorbent resulted in the removal of a great percentage of autoantibodies from sera derived from MG patients. The results were similar when the β1, γ and ε ECDs were used as immunoadsorbents. However, the complete removal of the pathogenic autoantibodies from the MG sera was not achieved. We aimed at the improvement of the structure, solubility and expression yield of the ECDs of the muscle AChR, in order to render them suitable for structural studies and mainly to use them for the amelioration of the antigen-specific therapeutic approach against MG. For this, we selected the γECD, which formed oligomers and displayed a low expression yield and constructed four mutants of the protein. The mutations were concerning the replacement of certain cysteines, which could form inappropriate intra- or inter-molecular bonding and thus aggregation, as well as the substitution of the hydrophobic Cys-loop region by its counterpart, more hydrophilic AChBP Cys-loop. The two mutants which carried the Cys-loop of the AChBP displayed a dramatic improvement at the expression yield and solubility, while they approached the expected molecular size, according to the results from gel filtration and dynamic light scattering. When these two improved mutants were used as immunoadsorbents, they exhibited an increased ability to bind autoantibodies from MG sera, compared with the wild type γECD. These results indicate that the hydrophobic Cys-loop region of the γECD importantly contributes to the formation of aggregates during the expression of the ECD, and consequently followed the replacement of this region at the rest ECDs of the muscle AChR. In order to further ameliorate the antigen-specific therapeutic approach against MG, we carried out efforts to co-express all of the ECDs of the muscle AChR, targeting to create complexes which would carry the interfaces between the ECDs, which are thought to be also immunogenic. At these efforts, the mutant forms of the ECDs which carried the Cys-loop of the AChBP were used. These initial co-expressions of the ECDs were not successful, with the respect to the creation of complexes. In order to combine the ECDs of all the subunits and construct a functional molecule, the next step was the binding of these ECDs with a linker of repeated amino acids. The linker that was used, was consisted of eight repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)8. At the beginning were constructed the pairs (concatamers) which were needed in order to follow subclonings, preparative to form the pentamer. All of the concatamers displayed the expected molecular weight, according the results of the SDS-PAGE. This fact suggests that the linker does not undergo proteolysis, and thus is capable of retaining the subunits conjoint. Furthermore, the expression yield of the concatamers was satisfactory and they retained their ability to bind radiolabelled α-bungarotoxin, which is specifically binds to the α1ECD with high affinity. However, the results from the gel filtration indicated that all the concatamers eluted in a broad spectrum of molecular weights, from monomers to oligomers. In an effort to improve the conformation and the characteristics of the concatamers, a bigger linker which was consisted of eleven repeated triplets of the amino acids alanine-glycine-serine (AGS)11 was used, but the final products where shown to be similar. With respect to the use of the concatamers at the therapeutic approach against MG, the results showed that all the concatamers retain the ability to bind autoantibodies from MG sera, although there was no further improvement in the immunoadsorbing ability of the single ECDs. Conclusively, the substitution of the hydrophobic Cys-loop of the ECDs by the corresponding, more hydrophilic of the AChBP, results in the construction of molecules with improved characteristics, such as the expression yield and the solubility. The molecules are able to be linked together and form concatamers with the appropriate conformation, retaining their functionality, such as the binding of radiolabelled α-bungarotoxin and autoantibodies from MG sera. These results demonstrate that it is feasible to construct the heteropentamer of the human muscle AChR, which will consist only of the ECDs.

In lipid membranes lacking activating lipids, the nicotinic acetylcholine receptor adopts an uncoupled conformation that binds ligand, but does not transition into an open conformation. Understanding the mechanisms of lipid-dependent uncoupling is essential to understanding lipid-nAChR interactions, which may be implicated in pathological conditions such as nicotine addition. Here, I tested two structural features of a proposed uncoupling method to elucidate the mechanism of lipid-dependent uncoupling. First, infrared measurements and electrophysiological characterization performed in prokaryotic homologues indicate that lipid sensitivity is largely controlled by the most peripheral α-helix in the transmembrane domain, M4. My data show that tighter association of M4 with the adjacent M1 and M3 transmembrane α-helices decreases a receptor’s propensity to adopt a lipid-dependent uncoupled conformation. Second, I indirectly tested the hypothesis that uncoupling results from a conformational change at the extracellular/transmembrane domain interface that leads to an increased separation between the two domains and ultimately to a constriction of the channel pore. Finally, biophysical studies presented in this dissertation shed light on the complex binding of a number of non-competitive channel blockers to the nicotinic acetylcholine receptor channel pore in both the resting and desensitized states. The data provide further insight into the structural rearrangements that occur upon uncoupling of ligand binding and gating in the nicotinic acetylcholine receptor.

Nicotinic acetylcholine receptors are ligand-gated ion channels which are located on neuromuscular junction and in central and perifric nervous system. Activity of nicotinic receptor might be modulated by variety of pharmacological agents. In this work, we have focused on the study of the inhibition effect of tacrine and its derivatives on the nicotinic acetycholine receptors of muscle and neuronal type. These derivatives function as acetylcholinesterase inhibitors and also interact with nicotinic acetylcholine receptors. The majority of current forms of treatment of Alzheimer's disease is based on cholinesterase inhibitors. We have studied the mechanism of tacrine and its derivatives by using patch clamp method in the configuration of whole-cell recording. Powered by TCPDF (www.tcpdf.org)

Title: Study of pharmacology and function of binding sites of nicotinic acetylcholine receptors Author: Mgr. Martina Kaniaková Department: Institute of Physiology AS CR, v.v.i. Supervisor: RNDr. Jan Krůšek, CSc., Institute of Physiology AS CR, v.v.i. Abstract: Nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) are ligand-gated ion channels. We use the whole-cell patch-clamp technique to study functional and pharmacological properties of muscle and neuronal nicotinic receptors. Rat neuronal receptors were heterologously expressed in COS cells and human embryonic muscle receptors were studied in TE671 cells. Lobeline, a plant alkaloid with a long history of therapeutic use, interacts with the classical agonist-binding site of nAChRs. The final result of this interaction depends on the receptor subtype, lobeline and other agonists concentrations and the time schedule of application. Generally, lobeline is a very weak partial agonist eliciting deep desensitization at several subtypes of nAChRs. In combination with other agonists, lobeline acts as a competitive antagonist or coagonist. Using point mutation procedure we studied the functional role of negatively charged amino acids in the F-loop of β2 and β4 subunits of neuronal receptors. Neutralising mutations in β4 subunit led to up to eighteen-fold increase in the...

No description available.

Single-cell real-time quantitative RT-PCR was used to characterize the mRNA expression of rat neuronal nicotinic acetylcholine receptor (nAChR) subunits α3 and β2 in CA1 hippocampus stratum radiatum and stratum oriens interneurons. α3β2 co-expression was detected in 43% of interneurons analyzed. The nAChR subtype α3β2 was transiently expressed in cells derived from the human embryonic kidney cell line 293 at mRNA levels found in the CA1. The functional properties of α3β2 in HEK-293 cells were characterized by whole-cell patch clamping using acetylcholine (ACh) as an agonist. The kinetics of α3β2 channels were further analyzed by altering the level of α3 DNA transfected into HEK-293 cells. Varying the α3 concentration by more than 100,000 fold did not significantly alter the majority of the kinetics; the 10%-90% rise-time was the main characteristic found to be significantly different. A decrease in α3 concentration illustrated a significant increase in rise time. This and future studies will further our understanding of the extensive role neuronal nAChRs play in modulating hippocampal activity and consequently influencing cognition and memory.

Ancestral Sequence Reconstruction is a technique used to statistically infer the most likely ancestor of a set of evolutionarily related sequences, but research which relies solely on protein data has the disadvantage of sequence information being lost upon translation of a protein from its gene transcript, due to the redundancy inherent in the genetic code. In this project, the amino acid sequences, and separately the corresponding codon sequences, of 184 homologous Acetylcholine receptor protein sequences were aligned, and phylogenetic analysis and ancestral sequence reconstruction was performed based on both alignments to infer several ancestral sequences representing important milestones in the evolutionary history of the homologous protein family. To further extract meaningful information from the nucleotide sequences, positive selection analysis was performed on the codon alignment using the Mixed Effects Model of Evolution method, which estimates and compares between the rates of synonymous and non- synonymous mutations across the alignment to detect the occurrence of positive selection events throughout their evolution. The Mixed Effects Model of Evolution can infer positive selection across both sites and evolutionary branches in a sequence alignment, thus highlighting residues along the evolutionary trajectory of the proteins which may have been functionally important in their evolution. Positive selection analysis detected positive selection at a multitude of sites and branches, and by mapping signatures at which selection is strongest with changes in the trajectory of ancestral states, several important sites were chosen as likely to be most valuable for future experimental testing. The implications of this study on the benefits of conducting ancestral sequence reconstruction with protein and codon sequences are discussed.

No description available.