Die humanen Noroviren (Familie Caliciviridae, Genus Norovirus) bilden den Haupterreger der nichtbakteriellen Gastroenterotiden. Seit Beginn der 1990er Jahre – besonders seit dem Herbst 2002 – kann weltweit eine sehr starke Zunahme der Norovirus-Infektionen beobachtet werden. Die Mehrheit der Erkrankungen (ca. 80%) ist dabei durch den Genotyp II.4 verursacht, wobei innerhalb dieses Genotyps kontinuierlich „neue“ genetisch veränderte Norovirus-Stämme auftreten, die kontinuierlich in „neue“ Subgenotypen eingeordnet werden. Bis dato wird vermutet, dass die hohe Zunahme der Infektionen durch die subgenotypspezifische Evolution des strukturellen Proteins VP1 bewirkt wurde, da dadurch die Bindung der Viruspartikel an die Rezeptoren der Wirtszelle – die HBGAs – verbessert sein könnte bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt werden könnte. Bisher ist aber weitgehend unbekannt, ob im Bereich der nichtstrukturellen Proteine auch eine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und ob diese durch eine verbesserte Enzymaktivität zu der Zunahme der Infektionen beigetragen haben könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden demnach aus unterschiedlichen Stuhlproben die beiden Enzyme NS6pro und NS7pol von jeweils einem Stamm der epidemiologisch relevanten Subgenotypen II.4-1995, II.4-2002, II.4-2004, II.4-2006a und II.4-2006b rekombinant hergestellt und betreffend ihrer Evolution und Enzymaktivität untersucht. Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass bei den epidemiologisch relevanten Subgenotypen des Genotyps II.4 im Bereich der NS6pro und der NS7pol keine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und daher keine subgenotypspezifische Enzymaktivität vorliegt. Somit hatte die Enzymaktivität der NS6pro und der NS7pol keinen Einfluss auf die Zunahme der Infektionen. Dennoch konnte aber beobachtet werden, dass durch die Mutation einer einzelnen Aminosäure – entsprechend der Position in der räumlichen Struktur der NS6pro bzw. der NS7pol – die Enzymaktivität um bis zu 100 Prozent erhöht bzw. reduziert werden kann. Bei diesen bedeutenden Mutationen ist entweder die Substratbindung oder die Koordination bzw. die Zufuhr der Reaktionskomponenten betroffen. Somit konnte bestätigt werden, dass die Zunahme der Infektionen vermutlich doch durch die Evolution des VP1 bedingt ist. Dies ist auch nachvollziehbar, da das VP1 den Eintritt der Viruspartikel in das Zellplasma erlaubt, in dem danach erst die Virusvermehrung durch die Enzyme stattfindet. Hierbei muss aber erwähnt werden, dass die Evolution des VP1 durch die Mutationsrate der NS7pol bestimmt ist, sodass die NS7pol letztendlich doch für die Zunahme der Infektionen verantwortlich ist. Um aber definitiv abzuklären, ob durch die Evolution des VP1 tatsächlich die Bindung der Viruspartikel an die HBGAs verbessert bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt wird, müssten bspw. Bindungs-Assays zwischen den entsprechenden VLPs (virus-like particles) und bereits typisierten Serum- oder Speichelproben – ähnlich den Untersuchungen von Lindesmith et al. (2008) – durchgeführt werden. Darüber hinaus müsste die Evolution und die Funktionalität der restlichen nichtstrukturellen Proteine untersucht bzw. deren Einfluss auf die Zunahme der Infektionen überprüft werden.

Die humanen Noroviren (Familie Caliciviridae, Genus Norovirus) bilden den Haupterreger der nichtbakteriellen Gastroenterotiden. Seit Beginn der 1990er Jahre – besonders seit dem Herbst 2002 – kann weltweit eine sehr starke Zunahme der Norovirus-Infektionen beobachtet werden. Die Mehrheit der Erkrankungen (ca. 80%) ist dabei durch den Genotyp II.4 verursacht, wobei innerhalb dieses Genotyps kontinuierlich „neue“ genetisch veränderte Norovirus-Stämme auftreten, die kontinuierlich in „neue“ Subgenotypen eingeordnet werden. Bis dato wird vermutet, dass die hohe Zunahme der Infektionen durch die subgenotypspezifische Evolution des strukturellen Proteins VP1 bewirkt wurde, da dadurch die Bindung der Viruspartikel an die Rezeptoren der Wirtszelle – die HBGAs – verbessert sein könnte bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt werden könnte. Bisher ist aber weitgehend unbekannt, ob im Bereich der nichtstrukturellen Proteine auch eine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und ob diese durch eine verbesserte Enzymaktivität zu der Zunahme der Infektionen beigetragen haben könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden demnach aus unterschiedlichen Stuhlproben die beiden Enzyme NS6pro und NS7pol von jeweils einem Stamm der epidemiologisch relevanten Subgenotypen II.4-1995, II.4-2002, II.4-2004, II.4-2006a und II.4-2006b rekombinant hergestellt und betreffend ihrer Evolution und Enzymaktivität untersucht. Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass bei den epidemiologisch relevanten Subgenotypen des Genotyps II.4 im Bereich der NS6pro und der NS7pol keine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und daher keine subgenotypspezifische Enzymaktivität vorliegt. Somit hatte die Enzymaktivität der NS6pro und der NS7pol keinen Einfluss auf die Zunahme der Infektionen. Dennoch konnte aber beobachtet werden, dass durch die Mutation einer einzelnen Aminosäure – entsprechend der Position in der räumlichen Struktur der NS6pro bzw. der NS7pol – die Enzymaktivität um bis zu 100 Prozent erhöht bzw. reduziert werden kann. Bei diesen bedeutenden Mutationen ist entweder die Substratbindung oder die Koordination bzw. die Zufuhr der Reaktionskomponenten betroffen. Somit konnte bestätigt werden, dass die Zunahme der Infektionen vermutlich doch durch die Evolution des VP1 bedingt ist. Dies ist auch nachvollziehbar, da das VP1 den Eintritt der Viruspartikel in das Zellplasma erlaubt, in dem danach erst die Virusvermehrung durch die Enzyme stattfindet. Hierbei muss aber erwähnt werden, dass die Evolution des VP1 durch die Mutationsrate der NS7pol bestimmt ist, sodass die NS7pol letztendlich doch für die Zunahme der Infektionen verantwortlich ist. Um aber definitiv abzuklären, ob durch die Evolution des VP1 tatsächlich die Bindung der Viruspartikel an die HBGAs verbessert bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt wird, müssten bspw. Bindungs-Assays zwischen den entsprechenden VLPs (virus-like particles) und bereits typisierten Serum- oder Speichelproben – ähnlich den Untersuchungen von Lindesmith et al. (2008) – durchgeführt werden. Darüber hinaus müsste die Evolution und die Funktionalität der restlichen nichtstrukturellen Proteine untersucht bzw. deren Einfluss auf die Zunahme der Infektionen überprüft werden.

Infectious disease can be transmitted via various environmental pathways, many of which are incorporated into our water and wastewater systems. Quantitative microbial risk assessment (QMRA) can be a valuable tool in identifying hazard exposure pathways and estimating their associated health impacts. QMRA can be applied to establish standards and guidelines and has been adopted by the World Health Organisation for the management of risks from water-related infectious diseases. This thesis aims at presenting a holistic approach for the assessment of microbial health risks in urban water and wastewater systems. The procedure of QMRA is presented, together with the data collected for the case studies, and the results are discussed in a risk management framework. Decentralised drinking water treatment with membranes was shown to be competitive with centralised conventional treatment regarding environmental impacts and health. To attain sufficient die-off of pathogens in order to reduce risks to acceptable levels, facilities that permit the long-term storage of locally collected faeces are required. Issues of operation and mangement are likely to determine the health risks in decentralised systems. While failures in distribution are more likely to result in detectable waterborne disease outbreaks, the number of people at risk of becoming infected with pathogens passing normal treatment, calculated on a yearly basis, can be larger. Site-specific pathogen monitoring of source waters was identified as an important factor for the accurate estimation of risk. Noroviruses, an emerging waterborne pathogen, were shown to have fluctuating concentrations in surface water, with significant peaks during the wintertime. Time series analysis has potential as an early warning system if complemented by regular monitoring to discriminate peaks from random fluctuations. Groups already sensitive to infection, i.e. the elderly, the sick and children, were shown to consume higher volumes of cold tap water than the rest of the population, which may call for special atention in the risk management of drinking water systems. Microbial health risks associated with the handling and reuse of wastewater and sludge were shown to be successfully addressed within the management system Hazard Analysis and Critical Control Points (HACCP). Most exposure points identified could be controlled through easy measures. / Copyright Agreement: Figure 6-1, page 49 and figure 6-2, page 50 in the summary/introduction are reprinted from Water Science and Technology: Water Supply 2(2) 11-18, with permission from the copyright holders, IWA. Note: the median values are missing in the article but the figures have been corrected in the summary/introduction.

<p>Human noroviruses (HuNoVs) are the leading cause of an acute form of non-bacterial gastroenteritis, where strains belonging to genogroup (G) II are dominant. Upon expression with the baculovirus culture system, virus-like particles (VLPs) of HuNoVs are expected to assemble into T = 3 icosahedral capsid particles resembling the structure of the infectious virion particles. However, some strains were found to assemble into either T = 1 or T = 4 capsids, or a combination of two different capsid forms. In this study, we showed that VLPs of the Virginia 1997 387 (VA387) GII.4 outbreak strain assembled into T = 1, T = 3, and T = 4 capsids upon expression in insect cell culture, the first case for a naturally occurring HuNoV strain to assemble into all three capsid states. TEM analysis revealed that T = 1 icosahedral particles were the most abundant in purified samples, which contrasts previous findings where either T = 3 or T = 4 were the most abundant. We resolved the cryo-EM structures of the T = 1 shell (S) domain, T = 3, and T = 4 particles to 2.24, 2.44, and 3.43 Å, respectively, making them the most resolved norovirus (NoV) structures to date. Single particle cryo-EM 3D analysis showed that the protruding (P) domain of T = 1 and T = 4 VLPs are highly dynamic. Additionally, we showed that T = 3 VLPs are resistant while T = 1 and T = 4 VLPs are sensitive to digestion in the presence of trypsin. This suggested that T = 1 and T = 4 capsids are less stable among the VLPs, which is consistent with the highly dynamic P domain inferred from our cryo-EM 3D analysis. During infection, HuNoVs travel through the gastrointestinal (GI) tract where they encounter a broad range of variable conditions that include pH, ionic strength, and host defenses (e.g., proteases). Our analyses suggest that virions are T = 3 particles as they can survive the GI tract upon exiting the host. We determined the first cryo-EM structure of T = 3 VLPs in complex with the known HuNoV host cell receptor, histo-blood group antigen (HBGA), to a resolution of 2.51 Å, demonstrating that NoV VLPs can serve as a platform in the structural characterization of small ligand molecules. Lastly, we identified a histidine residue retained in the S domain of all identified caliciviruses critical in the assembly of capsids. Our structures and their characterization will contribute to the development of therapeutic agents to combat noroviruses. </p>

Ce travail de thèse se focalise sur le couplage du microscope à force atomique haute–vitesse (HS-AFM) et de la spectroscopie Raman exaltée de surface (SERS) pour la détection des biomolécules. Nous avons élaboré un protocole de fabrication pour produire les substrats “SERS-actifs”. L’efficacité des substrats de nanoparticules cristalline d’or, d’argent ou bimétallique argent–or a été évaluée. Nous avons étudié l’impact des propriétés optiques et morphologiques des substrats sur l’intensité Raman en analysant des échantillons tests tels que la bipyridine éthylène et le bleu de méthylène. Nous nous sommes interessés à trois problematiques biologiques distinctes par analyses HS-AFM et SERS. Dans un premier cas, nous avons détecté la signature chimique de protéine cytochrome b5. Ce travail a été suivi par des études sur le changement de conformation de la protéine de choc thermique leuconostoc oenos Lo 18 en fonction de la concentration et du pH. La dernière application consiste en l’analyse des interactions membrane – virus. Afin de réaliser les analyses simultanées Raman/AFM, nous avons adapté notre protocole de fabrication pour couvrir la surface des pointes AFM commerciales par des nanoparticules d’or cristallines. Les études de diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS) ont été effectuées sur les échantillons de disulfure de molybdène pour évaluer la qualité des pointes TERS. Pour finir, nous présentons une nouvelle configuration de couplage HS-AFM et spectroscopie Raman. Nous discutons des modifications et des défis rencontrés. / This thesis focuses on the coupling of High–Speed Atomic Force Microscopy (HS-AFM) and Surface Enhanced Raman Spectroscopy (SERS) for biomolecule analysis. We have designed a fabrication protocol to manufacture “SERS-active” substrates. The efficacy of gold, silver and gold-silver bimetallic crystalline nanoparticle substrates were evaluated. We have investigated the impact of optical and morphological features of the substrates on Raman signal intensity by analyzing well-known samples such as bipyridine ethylene and methylene blue molecules. We took an interest in three distinct biological problematics with HS-AFM and SERS analyses. First, we have detected the chemical signature of cytochrome b5 protein. This study was followed by the investigation of conformational changes of small heat shock leuconostoc oenos Lo 18 protein in function of pH level and concentrations. The last application consists to the analyse a membrane and a virus interaction. In order to realize simultaneous Raman/AFM analysis, we have adapted our fabrication protocol to cover the surface of commercial AFM probes by crystalline gold nanoparticles. Tip – Enhanced Raman Spectroscopy (TERS) studies were performed on molybdenum disulfide to evaluate the quality of TERS probes. In the last part of this work, we have designed a new setup to combine Ando’s HS-AFM setup with Raman spectroscopy. We present the modifications that have been carried out and the challenges that we have encountered.