Durch das Auftreten neuer Stämme resistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen Wirkstoffen gegen diese, sich ständig weiter ausbreitende Bedrohung, dringend notwendig. Der interdisziplinäre Sonderforschungsbereich 630 der Universität Würzburg stellt sich dieser Aufgabe, indem hier neuartige Xenobiotika synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Die hier vorgelegte Dissertation fügt sich hierbei nahtlos in die verschiedenen Fachbereiche des SFB630 ein: Sie stellt eine Schnittstelle zwischen Synthese und Analyse der Effekte der im Rahmen des SFB630 synthetisierten Isochinolinalkaloid-Derivaten. Mit den hier angewandten bioinformatischen Methoden wurden zunächst die wichtigsten Stoffwechselwege von S. epidermidis R62A, S. aureus USA300 und menschlicher Zellen in sogenannten metabolischen Netzwerkmodellen nachgestellt. Basierend auf diesen Modellen konnten Enzymaktivitäten für verschiedene Szenarien an zugesetzten Xenobiotika berechnet werden. Die hierfür benötigten Daten wurden direkt aus Genexpressionsanalysen gewonnen. Die Validierung dieser Methode erfolgte durch Metabolommessungen. Hierfür wurde S. aureus USA300 mit verschiedenen Konzentrationen von IQ-143 behandelt und gemäß dem in dieser Dissertation vorgelegten Ernteprotokoll aufgearbeitet. Die Ergebnisse hieraus lassen darauf schließen, dass IQ-143 starke Effekte auf den Komplex 1 der Atmungskette ausübt – diese Resultate decken sich mit denen der metabolischen Netzwerkanalyse. Für den Wirkstoff IQ-238 ergaben sich trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zu IQ-143 deutlich verschiedene Wirkeffekte: Dieser Stoff verursacht einen direkten Abfall der Enzymaktivitäten in der Glykolyse. Dadurch konnte eine unspezifische Toxizität dieser Stoffe basierend auf ihrer chemischen Struktur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten die bereits für IQ-143 und IQ-238 auf Bakterien angewandten Methoden erfolgreich zur Modellierung der Effekte von Methylenblau auf verschiedene resistente Stämme von P. falciparum 3D7 angewandt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Methylenblau in einer Kombination mit anderen Präparaten gegen diesen Parasiten zum einen die Wirkung des Primärpräparates verstärkt, zum anderen aber auch in gewissem Maße vorhandene Resistenzen gegen das Primärpräparat zu verringern vermag. Somit konnte durch die vorgelegte Arbeit eine Pipeline zur Identifizierung der metabolischen Effekte verschiedener Wirkstoffe auf unterschiedliche Krankheitserreger erstellt werden. Diese Pipeline kann jederzeit auf andere Organismen ausgeweitet werden und stellt somit einen wichtigen Ansatz um Netzwerkeffekte verschiedener, potentieller Medikamente aufzuklären. / With the emergence of new strains of resistant pathogens, the search for new compounds against this spreading threat is of utmost importance. The interdisciplinary special research field SFB630 of the University of Würzburg is ready to tackle this task by synthesizing and analysing the effects of xenobiotics. The presented dissertation is seamlessly integrated into the diverse range of special fields of the SFB630: it provides a gateway between synthesis and analysis of the effects of the newly synthesized isoquinoline alkaloid derivatives. The presented bioinformatic methods were used to build a so called metabolic network model of the most important pathways of S. epidermidis RP62A, S. aureus USA300 and human cells. Based on these models it was possible to calculate the enzyme activities for different scenarios of added xenobiotics. The data needed for these calculations were derived directly from gene expression analysis. Validation of this method was done by metabolomic measurements. In order to accomplish this, a strain of S. aureus USA300 was subjected to different concentrations of IQ-143 and processed according to the workflow also published in this dissertation. The results suggest that IQ-143 has very strong effects on the complex 1 of the oxidative phosphorylation – these results are consistent with the results obtained by the metabolic network analysis. Although IQ-238 is structurally a close relative to IQ-143, the effects of this compound are very different: it leads to a drop of the enzyme activities in the glycolysis. Therefore an unspecific toxicity of those compounds based on their chemical structure dould be ruled out. The methods used to model the effects of IQ-143 and IQ-238 on bacteria were furthermore successfully transferred to model the effects of methylene blue on several resistant strains of P. falciparum 3D7. It was shown that a combination of methylene blue and other malaria medications either enhances the effects of the primary medication, or – in the case of a resistant strain – methylene blue was able to mitigate the resistances against the primary medication. The presented dissertation was thus successfully able to build a pipeline to identify the metabolic effects of different compounds on various germs. This pipeline can be expanded to other organisms at any time and therefore yields an important approach to identify network effects of various potential drugs.

Die humanen Noroviren (Familie Caliciviridae, Genus Norovirus) bilden den Haupterreger der nichtbakteriellen Gastroenterotiden. Seit Beginn der 1990er Jahre – besonders seit dem Herbst 2002 – kann weltweit eine sehr starke Zunahme der Norovirus-Infektionen beobachtet werden. Die Mehrheit der Erkrankungen (ca. 80%) ist dabei durch den Genotyp II.4 verursacht, wobei innerhalb dieses Genotyps kontinuierlich „neue“ genetisch veränderte Norovirus-Stämme auftreten, die kontinuierlich in „neue“ Subgenotypen eingeordnet werden. Bis dato wird vermutet, dass die hohe Zunahme der Infektionen durch die subgenotypspezifische Evolution des strukturellen Proteins VP1 bewirkt wurde, da dadurch die Bindung der Viruspartikel an die Rezeptoren der Wirtszelle – die HBGAs – verbessert sein könnte bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt werden könnte. Bisher ist aber weitgehend unbekannt, ob im Bereich der nichtstrukturellen Proteine auch eine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und ob diese durch eine verbesserte Enzymaktivität zu der Zunahme der Infektionen beigetragen haben könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden demnach aus unterschiedlichen Stuhlproben die beiden Enzyme NS6pro und NS7pol von jeweils einem Stamm der epidemiologisch relevanten Subgenotypen II.4-1995, II.4-2002, II.4-2004, II.4-2006a und II.4-2006b rekombinant hergestellt und betreffend ihrer Evolution und Enzymaktivität untersucht. Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass bei den epidemiologisch relevanten Subgenotypen des Genotyps II.4 im Bereich der NS6pro und der NS7pol keine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und daher keine subgenotypspezifische Enzymaktivität vorliegt. Somit hatte die Enzymaktivität der NS6pro und der NS7pol keinen Einfluss auf die Zunahme der Infektionen. Dennoch konnte aber beobachtet werden, dass durch die Mutation einer einzelnen Aminosäure – entsprechend der Position in der räumlichen Struktur der NS6pro bzw. der NS7pol – die Enzymaktivität um bis zu 100 Prozent erhöht bzw. reduziert werden kann. Bei diesen bedeutenden Mutationen ist entweder die Substratbindung oder die Koordination bzw. die Zufuhr der Reaktionskomponenten betroffen. Somit konnte bestätigt werden, dass die Zunahme der Infektionen vermutlich doch durch die Evolution des VP1 bedingt ist. Dies ist auch nachvollziehbar, da das VP1 den Eintritt der Viruspartikel in das Zellplasma erlaubt, in dem danach erst die Virusvermehrung durch die Enzyme stattfindet. Hierbei muss aber erwähnt werden, dass die Evolution des VP1 durch die Mutationsrate der NS7pol bestimmt ist, sodass die NS7pol letztendlich doch für die Zunahme der Infektionen verantwortlich ist. Um aber definitiv abzuklären, ob durch die Evolution des VP1 tatsächlich die Bindung der Viruspartikel an die HBGAs verbessert bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt wird, müssten bspw. Bindungs-Assays zwischen den entsprechenden VLPs (virus-like particles) und bereits typisierten Serum- oder Speichelproben – ähnlich den Untersuchungen von Lindesmith et al. (2008) – durchgeführt werden. Darüber hinaus müsste die Evolution und die Funktionalität der restlichen nichtstrukturellen Proteine untersucht bzw. deren Einfluss auf die Zunahme der Infektionen überprüft werden.

Die humanen Noroviren (Familie Caliciviridae, Genus Norovirus) bilden den Haupterreger der nichtbakteriellen Gastroenterotiden. Seit Beginn der 1990er Jahre – besonders seit dem Herbst 2002 – kann weltweit eine sehr starke Zunahme der Norovirus-Infektionen beobachtet werden. Die Mehrheit der Erkrankungen (ca. 80%) ist dabei durch den Genotyp II.4 verursacht, wobei innerhalb dieses Genotyps kontinuierlich „neue“ genetisch veränderte Norovirus-Stämme auftreten, die kontinuierlich in „neue“ Subgenotypen eingeordnet werden. Bis dato wird vermutet, dass die hohe Zunahme der Infektionen durch die subgenotypspezifische Evolution des strukturellen Proteins VP1 bewirkt wurde, da dadurch die Bindung der Viruspartikel an die Rezeptoren der Wirtszelle – die HBGAs – verbessert sein könnte bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt werden könnte. Bisher ist aber weitgehend unbekannt, ob im Bereich der nichtstrukturellen Proteine auch eine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und ob diese durch eine verbesserte Enzymaktivität zu der Zunahme der Infektionen beigetragen haben könnte. Im Rahmen dieser Arbeit wurden demnach aus unterschiedlichen Stuhlproben die beiden Enzyme NS6pro und NS7pol von jeweils einem Stamm der epidemiologisch relevanten Subgenotypen II.4-1995, II.4-2002, II.4-2004, II.4-2006a und II.4-2006b rekombinant hergestellt und betreffend ihrer Evolution und Enzymaktivität untersucht. Anhand der durchgeführten Untersuchungen konnte festgestellt werden, dass bei den epidemiologisch relevanten Subgenotypen des Genotyps II.4 im Bereich der NS6pro und der NS7pol keine subgenotypspezifische Evolution stattgefunden hat und daher keine subgenotypspezifische Enzymaktivität vorliegt. Somit hatte die Enzymaktivität der NS6pro und der NS7pol keinen Einfluss auf die Zunahme der Infektionen. Dennoch konnte aber beobachtet werden, dass durch die Mutation einer einzelnen Aminosäure – entsprechend der Position in der räumlichen Struktur der NS6pro bzw. der NS7pol – die Enzymaktivität um bis zu 100 Prozent erhöht bzw. reduziert werden kann. Bei diesen bedeutenden Mutationen ist entweder die Substratbindung oder die Koordination bzw. die Zufuhr der Reaktionskomponenten betroffen. Somit konnte bestätigt werden, dass die Zunahme der Infektionen vermutlich doch durch die Evolution des VP1 bedingt ist. Dies ist auch nachvollziehbar, da das VP1 den Eintritt der Viruspartikel in das Zellplasma erlaubt, in dem danach erst die Virusvermehrung durch die Enzyme stattfindet. Hierbei muss aber erwähnt werden, dass die Evolution des VP1 durch die Mutationsrate der NS7pol bestimmt ist, sodass die NS7pol letztendlich doch für die Zunahme der Infektionen verantwortlich ist. Um aber definitiv abzuklären, ob durch die Evolution des VP1 tatsächlich die Bindung der Viruspartikel an die HBGAs verbessert bzw. ein breiteres Spektrum an Rezeptoren erkannt wird, müssten bspw. Bindungs-Assays zwischen den entsprechenden VLPs (virus-like particles) und bereits typisierten Serum- oder Speichelproben – ähnlich den Untersuchungen von Lindesmith et al. (2008) – durchgeführt werden. Darüber hinaus müsste die Evolution und die Funktionalität der restlichen nichtstrukturellen Proteine untersucht bzw. deren Einfluss auf die Zunahme der Infektionen überprüft werden.

Die vorliegende Studie über den Alterseinfluß bei der Honigbiene (Apis mellifera) besteht aus drei Hauptteilen. Der erste Teil befasst sich mit den Charakteristiken des Spermathekeninhalts alter und junger Bienenköniginnen. Im zweiten Teil geht es um die Auswirkungen des maternalen Alters auf die embryonale Mortalität und die juvenile Entwicklung der Brut. Im dritten Studienteil werden die Auswirkungen der Verweildauer in der Spermatheca auf die embryonale Mortalität, Embryonenqualität und Larvenentwicklung der Nachkommen untersucht. Der Samen aus den Spermatheken älterer Bienen weist andere Bewegungsmuster, eine geringere Geschwindigkeit und eine anderen Enzymaktivität auf als der Samen, der aus den Spermatheken junger Königinnen gewonnen wurde. Ein altersbedingtes Nachlassen der Fertlität ist daraus zu erklären. Im Laufe von zwei Jahren wurde die embryonale Entwicklung und das Larvenwachstum von Nachkommen unterschiedlich alter Königinnen untersucht (2-jährige bis frisch begattete Königinnen). Ältere Königinnen legten kleinere Eier und deren Nachkommen zeigten eine signifikant höhere Mortalitätsrate und kleinere Entwicklungsstadien als die Nachkommen jüngerer Königinnen. In einer weiteren Studie wurde die embryonale Mortalität und die Embryonalentwicklung von Nachkommen, die aus älteren Samen entstanden, untersucht. Dabei wurde der Samen aus den Spermatheken von alten und jungen begatteten Königin entnommen und jungfräuliche Königinnen übertragen. um das Alter der Königin auszugleichen. Bei der Untersuchung wurde eine höhere embryonale Mortalität und generell, zu gewissen Entwicklungszeiten signifikant, kleine Entwicklungsstadien bei den Königinnen festgestellt, die mit dem älteren Samen befruchtet wurden. Der relative Anteil an früher und später embryonaler Mortalität war auch zwischen den beiden Spermien-Alterlassen signifikant unterschiedlich. Die insgesamt hohe embryonale Mortalität auch in der Kontrollgruppe (Königinnen besamt mit Sperma aus den Spermathecen junger Königinnen) belegt, dass die Methode der Samenextraktion und Reinsemination einen großen Einfluß auf die Embryonalentwicklung hatte. Auch das Phänomen „leerer Eier“, welches in beiden Gruppen in gleicher Frequenz vorgefunden wurde, ist möglicherweise durch diese Methode bedingt. / This study on the honey bee, Apis mellifera, consists of three major parts. The first involves the characteristics of the spermathecal content of old and young honey bee queen. The second examines maternal age effects on embryonic mortality and juvenile development of offspring in the honey bee. The third investigates on the impact of semen age on early embryonic mortality, embryo quality and larvae development in the honey bee. Semen collected from the spermatheca of old queen bees show different sperm movement patterns and slower speed than sperm from the spermathecae of young queens. This ability is possibly related to different enzyme activities and metabolisms found in the spermathecal contents of differently aged queens. The embryonic development and larval growth rate have been examined with regard to queen honey bees of different ages (2-year-old to freshly mated queens) during two years (2005 and 2006). Early embryonic mortality “EEM” has been found to be higher within the eggs from old queens than in those from younger queens. Egg volume, consequently embryo size, reduces as queen’s age. A further investigates embryonic mortality in offspring originating from older semen. This has been carried out by extracting the semen from the spermatheca of an old or/and young mated queen and re-inseminating it into a virgin queen, in order to adjust for queen age. The investigation show higher embryonic mortality in the offspring from virgin queens inseminated with semen extracted from older queens than with semen from younger queens. The relative percentage of early and late embryonic mortality within the groups was different between queens re-inseminated with aged semen. High embryonic mortality in the control semen ages may be affected by the method of extracting from semen out of the spermatheca and re-inseminating it into a virgin queen. Empty egg phenomenon, which has been found in both groups, may be related to this technique

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