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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191325.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225389.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Vírus causadores de gastroenterite, descritos como pequenos vírus de estrutura arredondada (Small Round Structured Viruses-SRSV), foram detectados em extratos de ostras Crassostrea spp., coletadas em regiões distintas do litoral do Estado de São Paulo, utilizando a Reação em Cadeia por Polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).Treze lotes de amostras, contendo 10 g de estômagos e divertículos, foram processados para extração e concentração das partículas virais, mediante adsorção-eluição e precipitação por polietilenoglicol (PEG 6000), e purificação com fluorocarbono (Freon, Dupont Co.) para eliminação prévia dos inibidores da reação de RT-PCR. A extração do ácido nucleico viral, foi realizada com uma mistura de isotiocianato de guanidina e fenol (TRIzol ®, Gibco) e clorofórmio, sendo completada com uma purificação em coluna spin, com membrana de polissulfona (Millipore,Corp.). A reação de RT-PCR foi realizada em uma única etapa, utilizando o kit \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). A reação de amplificação enzimática revelou, por eletroforese em gel de agarose (2%), corada com brometo de etídio, produtos de 123 bp, em 3 (23%) dos 13 lotes de amostras coletadas durante o verão de 1998, sendo verificadas em uma delas por imunomicroscopia eletrônica (IME),partículas de SRSV. Os produtos encontrados pertencem ao grupo genômico G2(Snow Mountain e outros vírus). A aplicação deste método possibilitou pela 1ª vez a detecção molecular de SRSVs no Brasil em ostras naturalmente contaminadas. / The Small Round Structured Viruses (SRSVs) have been associated with gastroenteritis in humans, and were detected in extracts of oysters Crassostrea spp., by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT - PCR). Thirteen lots of samples, originated from different regions of the State of São Paulo, were processed for viral particles extraction. The samples, containing 10 g of stomach and diverticula, were extracted by adsorption - elution and polyethylene glycol (PEG 6000) precipitation, and fluorocarbon (Freon, Dupont Co.) was used for purification and previous elimination of RT - PCR inhibitors. For the viral nucleic acid extraction, guanidine isothiocyanate - phenol mixture (TrizolÒ, Gibco ) and chloroform were used, followed by a polysulfone spin column (Millipore, Corp.) purification. The RT-PCR was done in one step, using the \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). The enzimatic amplification reaction run in 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide, revealed 123 bp products in 3 (23%) of the 13 lots of samples collected during the summer of 1998. One of these three samples was positive for SRSV particles by Immune Electron Microscopy (IEM). These 3 products were classified in the Genogroup G2 (Snow Mountain and others viruses). The application of this methodology made it possible to detected, in a molecular basis, the first cases of SRSVs in environmentally contaminated oysters in Brazil.

Vírus causadores de gastroenterite, descritos como pequenos vírus de estrutura arredondada (Small Round Structured Viruses-SRSV), foram detectados em extratos de ostras Crassostrea spp., coletadas em regiões distintas do litoral do Estado de São Paulo, utilizando a Reação em Cadeia por Polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).Treze lotes de amostras, contendo 10 g de estômagos e divertículos, foram processados para extração e concentração das partículas virais, mediante adsorção-eluição e precipitação por polietilenoglicol (PEG 6000), e purificação com fluorocarbono (Freon, Dupont Co.) para eliminação prévia dos inibidores da reação de RT-PCR. A extração do ácido nucleico viral, foi realizada com uma mistura de isotiocianato de guanidina e fenol (TRIzol ®, Gibco) e clorofórmio, sendo completada com uma purificação em coluna spin, com membrana de polissulfona (Millipore,Corp.). A reação de RT-PCR foi realizada em uma única etapa, utilizando o kit \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). A reação de amplificação enzimática revelou, por eletroforese em gel de agarose (2%), corada com brometo de etídio, produtos de 123 bp, em 3 (23%) dos 13 lotes de amostras coletadas durante o verão de 1998, sendo verificadas em uma delas por imunomicroscopia eletrônica (IME),partículas de SRSV. Os produtos encontrados pertencem ao grupo genômico G2(Snow Mountain e outros vírus). A aplicação deste método possibilitou pela 1ª vez a detecção molecular de SRSVs no Brasil em ostras naturalmente contaminadas. / The Small Round Structured Viruses (SRSVs) have been associated with gastroenteritis in humans, and were detected in extracts of oysters Crassostrea spp., by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT - PCR). Thirteen lots of samples, originated from different regions of the State of São Paulo, were processed for viral particles extraction. The samples, containing 10 g of stomach and diverticula, were extracted by adsorption - elution and polyethylene glycol (PEG 6000) precipitation, and fluorocarbon (Freon, Dupont Co.) was used for purification and previous elimination of RT - PCR inhibitors. For the viral nucleic acid extraction, guanidine isothiocyanate - phenol mixture (TrizolÒ, Gibco ) and chloroform were used, followed by a polysulfone spin column (Millipore, Corp.) purification. The RT-PCR was done in one step, using the \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). The enzimatic amplification reaction run in 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide, revealed 123 bp products in 3 (23%) of the 13 lots of samples collected during the summer of 1998. One of these three samples was positive for SRSV particles by Immune Electron Microscopy (IEM). These 3 products were classified in the Genogroup G2 (Snow Mountain and others viruses). The application of this methodology made it possible to detected, in a molecular basis, the first cases of SRSVs in environmentally contaminated oysters in Brazil.

Louis, Tong Kwok-leung. / Thesis (M.Phil.)--Chinese University of Hong Kong, 2000. / Includes bibliographical references (leaves 121-130). / Abstracts in English and Chinese. / ABSTRACT --- p.I / ACKNOWLEDGEMENTS --- p.III / LIST OF CONTENTS --- p.IV / LIST OF TABLES --- p.VIII / LIST OF FIGURES --- p.X / ABBREVIATIONS --- p.XII / GENERAL ABBREVIATIONS --- p.XII / VARIOUS NOMENCLATURES OR ABBREVIATIONS FOR SRSVS --- p.XIII / OBJECTIVES OF THE STUDY --- p.XIV / Chapter CHAPTER 1 --- INTRODUCTION --- p.1 / Chapter 1.1 --- HISTORICAL PERSPECTIVE --- p.2 / Chapter 1.2 --- CLINICAL FEATURES OF HUMAN SRSV INFECTION --- p.10 / Chapter 1.3 --- EPIDEMIOLOGY --- p.12 / Chapter 1.4 --- PHYSICAL CHARACTERISTICS OF SRSV --- p.14 / Chapter 1.5 --- STABILITY OF NORWALK VIRUS --- p.15 / Chapter 1.6 --- DIAGNOSTIC TOOLS FOR SRSVS --- p.15 / Chapter 1.7 --- GENOMIC ORGANIZATION OF SRSVS --- p.16 / Chapter 1.8 --- MOLECULAR TECHNOLOGIES --- p.19 / Chapter CHAPTER 2 --- MATERIALS --- p.20 / Chapter 2.1 --- FAECAL SAMPLES FROM 1986 TO 1992 --- p.21 / Chapter 2.2 --- OTHER FAECAL SAMPLES FROM 1995 TO 1998 --- p.21 / Chapter 2.3 --- AGE GROUPS OF ALL THE SAMPLES --- p.21 / Chapter CHAPTER 3 --- METHODS --- p.23 / Chapter 3.1 --- EXTRACTION OF RNA FROM PATIENT STOOL OR VOMIT SAMPLES --- p.24 / Chapter 3.2 --- REVERSE TRANSCRIPTION - POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) FOR SRSVS --- p.25 / Chapter 3.2.1 --- Principle of RT-PCR assay for SRSV --- p.25 / Chapter 3.2.2 --- Reverse transcription (cDNA Synthesis) --- p.26 / Chapter 3.2.3 --- Polymerase chain reaction --- p.26 / Chapter 3.2.4 --- Electrophoresis (in the PCR product room) --- p.31 / Chapter 3.2.5 --- Controls for PCR assay --- p.32 / Chapter 3.2.6 --- Interpretation of SRSV polymerase gene PCR --- p.32 / Chapter 3.3 --- RT-PCR USING INOSINE CONTAINING PRIMERS FOR THE CAPSID REGIONS --- p.34 / Chapter 3.3.1 --- RT-PCR for the capsid region of SRSV genome --- p.34 / Chapter 3.3.2 --- Interpretation of SRSV capsid gene PCR --- p.36 / Chapter 3.4 --- SOLID PHASE IMMUNE ELECTRON MICROSCOPY FOR THE DETECTION OF SRSV --- p.37 / Chapter 3.5 --- OPTIMIZATION OF CONDITIONS FOR SRSV RT-PCR --- p.37 / Chapter 3.5.1 --- Titration of primers --- p.37 / Chapter 3.5.2 --- Titration of MgCl2 --- p.38 / Chapter 3.5.3 --- "Titration ofdNTPs, MgCl2 and Taq polymerase (pH 9.0)" --- p.38 / Chapter 3.6 --- SPECIFICITY OF SRSV RT-PCR --- p.38 / Chapter 3.7 --- PURIFICATION OF PCR PRODUCTS PRIOR TO CLONING …… --- p.38 / Chapter 3.8 --- CLONING OF THE PURIFIED DNA INTO pGEM-T EASY VECTOR --- p.39 / Chapter 3.8.1 --- Introduction --- p.39 / Chapter 3.8.2 --- Sequence of the pGEM-T Easy Vector --- p.42 / Chapter 3.8.3 --- Ligation --- p.44 / Chapter 3.8.4 --- Transformation of competent bacterial cells --- p.44 / Chapter 3.8.5 --- Small-scale preparations of plasmid DNA --- p.45 / Chapter 3.8.6 --- Purification of miniprep using QIAprep Miniprep --- p.45 / Chapter 3.8.7 --- Restriction analysis of small-scale preparations of plasmid DNA --- p.45 / Chapter 3.9 --- CYCLE SEQUENCING OF CLONED SRSV AMPLICONS --- p.46 / Chapter 3.9.1 --- Targets for Sequencing --- p.46 / Chapter 3.9.2 --- Procedures of cycle sequencing --- p.46 / Chapter 3.9.3 --- Gel electrophoresis --- p.48 / Chapter 3.9.4 --- Sequencing conditions --- p.49 / Chapter 3.10 --- SEQUENCE ANALYSIS --- p.49 / Chapter CHAPTER 4 --- REAGENTS AND BUFFERS --- p.51 / Chapter 4.1 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR RNA EXTRACTION --- p.52 / Chapter 4.2 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR REVERSE TRANSCRIPTION (cDNA SYNTHESIS) --- p.52 / Chapter 4.3 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR PCR --- p.53 / Chapter 4.4 --- GEL ELECTROPHORESIS OF PCR PRODUCTS --- p.53 / Chapter 4.5 --- PURIFICATION OF PCR PRODUCTS --- p.54 / Chapter 4.6 --- REAGENTS FOR CLONING THE DNA INSERT INTO pGEM-T EASY VECTOR --- p.54 / Chapter 4.6.1 --- "pGEM-T Easy Vector System (Promega Corporation, USA)" --- p.54 / Chapter 4.6.2 --- Isopropylthio-β-D-galactoside (IPTG) stock solution --- p.54 / Chapter 4.6.3 --- X-Gal --- p.54 / Chapter 4.6.4 --- Luria-Bertani (LB) medium --- p.55 / Chapter 4.6.5 --- LB plates with ampicillin --- p.55 / Chapter 4.6.6 --- LB plates with ampicillin/IPTG/X-Gal --- p.55 / Chapter 4.6.7 --- SOC medium --- p.55 / Chapter 4.6.8 --- Mini-prep purification --- p.56 / Chapter 4.6.9 --- Mini-prep analysis --- p.56 / Chapter 4.6.9.1 --- Lambda DNA-Hind IIIφX-174 DNA-Hae III Digest --- p.56 / Chapter 4.6.9.2 --- Not I --- p.58 / Chapter 4.7 --- REAGENTS AND BUFFERS FOR CYCLE SEQUENCING --- p.58 / Chapter 4.7.1 --- SequiTherm EXCEĹёØ II Long-Rea´dёØ DNA Sequencing Kit-AL´FёØ --- p.58 / Chapter 4.7.2 --- Sequencing primers --- p.59 / Chapter 4.8 --- REAGENTS FOR SEQUENCING GEL CASTING --- p.59 / Chapter CHAPTER 5 --- RESULTS --- p.61 / Chapter 5.1 --- RESULTS OF RT-PCR OPTIMIZATION --- p.62 / Chapter 5.1.1 --- Magnesium chloride and pH of PCR reaction buffer --- p.62 / Chapter 5.1.2 --- Concentration of primers --- p.64 / Chapter 5.1.3 --- "Titration of dNTPs, MgCl2 and Taq polymerase (pH 9.0)" --- p.65 / Chapter 5.2 --- RESULT OF SENSITIVITY TEST --- p.66 / Chapter 5.3 --- RESULTS OF SPECIFICITY TEST --- p.67 / Chapter 5.4 --- RESULTS OF THE PCR USING INOSINE CONTAINING POL PRIMERS --- p.70 / Chapter 5.5 --- RESULTS OF PCR USING INOSINE CONTAINING CAPSID PRIMERS --- p.73 / Chapter 5.6 --- RESULTS OF SOME SAMPLES RETESTED BY SPIEM --- p.75 / Chapter 5.7 --- RESULTS OF SPORADIC OUTBREAKS --- p.77 / Chapter 5.7.1 --- A sporadic outbreak in 1996 --- p.77 / Chapter 5.7.2 --- Sporadic outbreak in a kindergarten in 1997 --- p.79 / Chapter 5.7.3 --- Sporadic outbreak at a hotel in 1998 --- p.79 / Chapter 5.7.4 --- Application of the RT-PCR to contaminated shellfish --- p.80 / Chapter 5.8 --- RESULTS OF MINI PREP ANALYSIS WITH NOT I DIGESTION --- p.85 / Chapter 5.9 --- RESULT OF ELECTROPHEROGRAM OF A SELECTED SPECIMEN FROM THE AUTOMATIC SEQUENCING --- p.86 / Chapter 5.9 --- RESULT OF ELECTROPHEROGRAM OF A SELECTED SPECIMEN FROM THE AUTOMATIC SEQUENCING --- p.86 / Chapter 5.10 --- RESULTS OF ALL TRIMMED DNA SEQUENCES --- p.87 / Chapter CHAPTER 6 --- DISCUSSION --- p.112 / REFERENCES --- p.122 / APPENDIX --- p.131 / APPENDIX I: Electron micrograph of SRSV particles --- p.132 / APPENDIX II: Confirmation for specificity test --- p.133 / APPENDIX III: Sequencing amplicons using capsid primers --- p.135 / APPENDIX IV: Sequencing amplicons (outbreak) using pol primers --- p.136 / APPENDIX V: Electropherogram (direct sequencing) --- p.138 / APPENDIX VI: Other RT-PCR results using pol primers --- p.139 / APPENDIX VII: Results of RT-PCR using capsid primers --- p.149 / APPENDIX VIII: Mini prep analysis --- p.158

Title from PDF of title page. / Document formatted into pages; contains 57 pages. / Thesis (M.S.P.H.)--University of South Florida, 2003. / Includes bibliographical references. / Text (Electronic thesis) in PDF format. / ABSTRACT: The Centers for Disease Control and Prevention estimated 23,000,000 cases of viral gastroenteritis caused by Norovirus in 2000, 40% of which were transmitted by food including: a variety of fresh produce, cake, deli meats, fruit salad, cheeses and ice. (CDC, 2003). An estimated 83,391 cases of Hepatitis A virus was reported in 2000, of which 5% was attributed to foodborne transmission (CDC, 2003). These figures underscore an urgent need for a method that can isolate virus from a variety of food matrices. The aim of this study was to develop an overall assessment of the inhibitory effects of a variety of food matrices on Real Time Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT-PCR). / ABSTRACT: Additionally, to compare a sequence specific hybridization probe amplification format to a non sequence specific SYBR Green format using the Roche LightCycler. The secondary aim was to evaluate the effectiveness of a food virus concentration and isolation protocol under development at the Florida Department of Health Bureau of Laboratories, Tampa. Three food specimens consisting of prepackaged smoked ham, fresh cilantro, and Thompson's green grapes were seeded with three dilutions of poliovirus 3 (Sabin strain). A viral concentration procedure under development at the Florida Department of Health Bureau of Laboratories, Tampa was used to isolate the virus. Real Time RT-PCR was carried out on the Roche LightCycler in SYBR Green and Hybridization probe formats. Spiking the virus-negative samples of each matrix with a dilution series of poliovirus 3 created post flocculation spikes. / ABSTRACT: This post-flocculation dilution series amplification allowed a standard curve to be created unique to each food matrix. The flocculation and concentrations specimens were then amplified and the standard curves from the post-flocculation seed were used to calculate the loss associated with the concentration procedure. This study reports significant differences (p[0.05) in recovery detected between the various matrices, and Real Time RT-PCR formats. The concentration protocol under development at the Florida Department of Health Bureau of Laboratories, Tampa, demonstrates a 12-78% recovery of seeded virus in a simulated "real world" virus contamination event among the various matrices. / System requirements: World Wide Web browser and PDF reader. / Mode of access: World Wide Web.

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