Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:25:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 191325.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2013-12-05T21:26:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 225389.pdf: 520329 bytes, checksum: 233f783f54991aca4d2a919257166c83 (MD5) Previous issue date: 2003 / Com o grande crescimento da maricultura em Santa Catarina, tornou-se necessário verificar mais profundamente a qualidade sanitária destes animais como também da água onde os mesmos são cultivados. Segundo a nova legislação (CONAMA - 20), a qualidade sanitária dos alimentos de origem marinha deve ser atestada através da ausência de Salmonella sp e de níveis aceitáveis de estafilococus coagulase positiva. Porém, hoje em dia sabe-se que moluscos cultivados em área com níveis aceitáveis de bactérias podem estar contaminados por vírus, já que métodos para remoção de bactérias por depuração, nem sempre removem os demais patógenos contaminantes. Os vírus Norwalk-like (NLV), são mundialmente reconhecidos como a principal causa de surtos de gastroenterites não bacteriana em adultos. Estes vírus têm sido também associados a surtos de gastroenterites associadas ao consumo de moluscos bivalves, já que eles se alimentam através de filtração, podendo bioacumular diversos patógenos em seus tecidos. Os adenovírus (AdVs) humanos são agentes que podem causar infecções oculares, respiratórias e gastrointestinais e são, freqüentemente, detectados em águas de esgoto e do mar, uma vez que todos os sorotipos são liberados através das fezes no meio ambiente. O presente trabalho teve como objetivo padronizar a técnica de RT-PCR para a detecção dos vírus NLV, e as técnicas de PCR, nested-PCR e PCR associado à cultura celular (ICC-PCR) para a detecção dos AdVs em experimentalmente infectadas visando a utilização destes como indicadores de contaminação viral humana no meio ambiente. Também foram coletadas ostras da espécie Crassostrea gigas em três pontos de cultivo de Florianópolis, SC, durante os meses de abril a outubro de 2002 a fim de monitorar a presença natural de adenovírus através dos ensaios de PCR, e nested-PCR. Os resultados obtidos mostraram que a técnica de nested-PCR para detecção de adenovírus em ostras foi mais sensível que a de PCR, sendo que os limites mínimos de vírus detectados foram de 1,2 PFU/g de tecido e 1,2x102 PFU/g de tecido, respectivamente. Este resultado também se repetiu quando as amostras ambientais foram analisadas, onde 90% das amostras foram positivas para adenovírus através da técnica de nested-PCR e nenhuma foi positiva utilizando somente uma reação de amplificação. O ensaio de ICC-PCR demonstrou a mesma sensibilidade que o de PCR para detecção de adenovírus experimentalmente inoculados em ostras. Finalmente, constatou-se que estudos mais aprofundados são necessários para a detecção de NLVs em ostras, uma vez que não foi possível detectá-los em extratos de ostras experimentalmente inoculadas, pelos métodos empregados neste trabalho. O presente trabalho permitiu padronizar as metodologias de PCR e nested-PCR para a utilização de adenovírus como um indicador biológico de contaminação biológica no meio ambiente, visando o monitoramento da sanidade dos moluscos de cultivo.

Vírus causadores de gastroenterite, descritos como pequenos vírus de estrutura arredondada (Small Round Structured Viruses-SRSV), foram detectados em extratos de ostras Crassostrea spp., coletadas em regiões distintas do litoral do Estado de São Paulo, utilizando a Reação em Cadeia por Polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).Treze lotes de amostras, contendo 10 g de estômagos e divertículos, foram processados para extração e concentração das partículas virais, mediante adsorção-eluição e precipitação por polietilenoglicol (PEG 6000), e purificação com fluorocarbono (Freon, Dupont Co.) para eliminação prévia dos inibidores da reação de RT-PCR. A extração do ácido nucleico viral, foi realizada com uma mistura de isotiocianato de guanidina e fenol (TRIzol ®, Gibco) e clorofórmio, sendo completada com uma purificação em coluna spin, com membrana de polissulfona (Millipore,Corp.). A reação de RT-PCR foi realizada em uma única etapa, utilizando o kit \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). A reação de amplificação enzimática revelou, por eletroforese em gel de agarose (2%), corada com brometo de etídio, produtos de 123 bp, em 3 (23%) dos 13 lotes de amostras coletadas durante o verão de 1998, sendo verificadas em uma delas por imunomicroscopia eletrônica (IME),partículas de SRSV. Os produtos encontrados pertencem ao grupo genômico G2(Snow Mountain e outros vírus). A aplicação deste método possibilitou pela 1ª vez a detecção molecular de SRSVs no Brasil em ostras naturalmente contaminadas. / The Small Round Structured Viruses (SRSVs) have been associated with gastroenteritis in humans, and were detected in extracts of oysters Crassostrea spp., by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT - PCR). Thirteen lots of samples, originated from different regions of the State of São Paulo, were processed for viral particles extraction. The samples, containing 10 g of stomach and diverticula, were extracted by adsorption - elution and polyethylene glycol (PEG 6000) precipitation, and fluorocarbon (Freon, Dupont Co.) was used for purification and previous elimination of RT - PCR inhibitors. For the viral nucleic acid extraction, guanidine isothiocyanate - phenol mixture (TrizolÒ, Gibco ) and chloroform were used, followed by a polysulfone spin column (Millipore, Corp.) purification. The RT-PCR was done in one step, using the \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). The enzimatic amplification reaction run in 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide, revealed 123 bp products in 3 (23%) of the 13 lots of samples collected during the summer of 1998. One of these three samples was positive for SRSV particles by Immune Electron Microscopy (IEM). These 3 products were classified in the Genogroup G2 (Snow Mountain and others viruses). The application of this methodology made it possible to detected, in a molecular basis, the first cases of SRSVs in environmentally contaminated oysters in Brazil.

Vírus causadores de gastroenterite, descritos como pequenos vírus de estrutura arredondada (Small Round Structured Viruses-SRSV), foram detectados em extratos de ostras Crassostrea spp., coletadas em regiões distintas do litoral do Estado de São Paulo, utilizando a Reação em Cadeia por Polimerase com transcrição reversa (RT-PCR).Treze lotes de amostras, contendo 10 g de estômagos e divertículos, foram processados para extração e concentração das partículas virais, mediante adsorção-eluição e precipitação por polietilenoglicol (PEG 6000), e purificação com fluorocarbono (Freon, Dupont Co.) para eliminação prévia dos inibidores da reação de RT-PCR. A extração do ácido nucleico viral, foi realizada com uma mistura de isotiocianato de guanidina e fenol (TRIzol ®, Gibco) e clorofórmio, sendo completada com uma purificação em coluna spin, com membrana de polissulfona (Millipore,Corp.). A reação de RT-PCR foi realizada em uma única etapa, utilizando o kit \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). A reação de amplificação enzimática revelou, por eletroforese em gel de agarose (2%), corada com brometo de etídio, produtos de 123 bp, em 3 (23%) dos 13 lotes de amostras coletadas durante o verão de 1998, sendo verificadas em uma delas por imunomicroscopia eletrônica (IME),partículas de SRSV. Os produtos encontrados pertencem ao grupo genômico G2(Snow Mountain e outros vírus). A aplicação deste método possibilitou pela 1ª vez a detecção molecular de SRSVs no Brasil em ostras naturalmente contaminadas. / The Small Round Structured Viruses (SRSVs) have been associated with gastroenteritis in humans, and were detected in extracts of oysters Crassostrea spp., by Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction (RT - PCR). Thirteen lots of samples, originated from different regions of the State of São Paulo, were processed for viral particles extraction. The samples, containing 10 g of stomach and diverticula, were extracted by adsorption - elution and polyethylene glycol (PEG 6000) precipitation, and fluorocarbon (Freon, Dupont Co.) was used for purification and previous elimination of RT - PCR inhibitors. For the viral nucleic acid extraction, guanidine isothiocyanate - phenol mixture (TrizolÒ, Gibco ) and chloroform were used, followed by a polysulfone spin column (Millipore, Corp.) purification. The RT-PCR was done in one step, using the \'\'Super Script ONE-STEP RT-PCR System\'\'® (Gibco). The enzimatic amplification reaction run in 2% agarose gel electrophoresis stained with ethidium bromide, revealed 123 bp products in 3 (23%) of the 13 lots of samples collected during the summer of 1998. One of these three samples was positive for SRSV particles by Immune Electron Microscopy (IEM). These 3 products were classified in the Genogroup G2 (Snow Mountain and others viruses). The application of this methodology made it possible to detected, in a molecular basis, the first cases of SRSVs in environmentally contaminated oysters in Brazil.