La leishmaniosi canina és una zoonosi causada pel paràsit Leishmania infantum, sent el gos el principal reservori. És endèmica de la conca Mediterrània, de l'orient Mitjà i d'Amèrica del Sud arribant la prevalença de la infecció en aquestes zones al 67%. A més, és una malaltia en expansió ja que recentment s'han descrit casos als Estats Units i Regne Unit.L'objectiu d'aquesta tesi és l'estudi de la base molecular de la resistència i la susceptibilitat a la leishmaniosi visceral canina (CVL) des de dues vessants diferents, l'estudi del polimorfisme de 12 gens candidats i el MHC de classe II i el perfil immunològic en l'establiment de la infecció i en la posterior evolució de la malaltia.S'han caracteritzat 22 nous SNPs pel gen Slc11a1, que està involucrat en la primera barrera de defensa de l'organisme contra els paràsits, a part de tenir múltiples efectes pleotròpics que influencien la resposta immunitària posterior. Un estudi cas-control format per 164 gossos de 19 races, on s'han analitzat 24 polimorfismes per aquest gen, ens ha permès identificar 3 SNPs significatius: A4549G localitzat a l'intró 6, C4859T localitzat a l'exó 8 i C8542T localitzat a l'intró 13, corroborant la implicació d'aquest gen en la CVL.Com a conseqüència d'un treball en col·laboració amb el Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (Universitat de Manchester) s'ha caracteritzat la regió MHC de classe II i s'han genotipat 97 SNPs en 11 gens candidats relacionats amb la resposta immunitària: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 i VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfisme d'aquests gens candidats s'han analitzat en una població de 36 gossos de races que tenen una elevada prevalença de la malaltia. S'han identificat dos al·lels associats a susceptibilitat a la CVL, l'al·lel DQB1*02301 i l'al·lel DRB1*01502, tot corroborant per aquest darrer l'associació prèviament descrita. Aquests dos al·lels es troben en el mateix haplotip en la raça boxer, raça on també s'ha identificat un al·lel que només es troba en els animals control, DRB1*01301. A partir de l'anàlisi dels 11 gens candidats hem identificat 3 SNPs significativament associats a CVL: 1 SNP localitzat en la regió 3' flanquejant de la IL-6 (20R191) i 2 SNPs localitzats en l'intró 7 del gen VDR (13M453 i 15S439) suggerint un paper rellevant d'aquests gens en la CVL.Tots aquests gens candidats han estat genotipats en una població de podencs eivissencs, raça considerada com a resistent. Els resultats obtinguts, confirmen que aquesta raça té una base genètica pròpia que probablement configura la seva particular resistència a la malaltia. S'han identificat nous al·lels pel MHC-II (DRB1*06901 i DQB1*04801) i haplotips específics pel gen Slc11a1. Per l'anàlisi del perfil immunològic en la infecció per Leishmania infantum s'ha dut a terme un estudi d'expressió de citocines (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α i TGF-β) mesurades mensualment durant un any en 6 beagles d'infecció experimental que van presentar una diferent progressió de la malaltia. Els resultats obtinguts en aquest estudi proporcionen nous indicis dels mecanismes immunològics que controlen la progressió de la leishmaniosi canina, que es caracteritza per la producció de citocines Th1 i Th2. En la fase inicial de la infecció una predominant resposta Th2 amb una elevada expressió de IL-4 i IL-13 pot afavorir la replicació del paràsit i la disseminació de la infecció. L'elevada expressió d'IFN-γ durant la fase patent de la infecció està associada a l'augment de la càrrega parasitària i als símptomes clínics. A més, és important remarcar l'elevada variabilitat de l'expressió gènica durant la preinfecció que dificulta l'establiment d'uns nivells de referència d'expressió basal per aquestes citocines.Els resultats d'aquesta tesi corroboren el paper dels gens Slc11a1 i DRB1 amb la leishmaniosi visceral canina i evidencien nous gens candidats relacionats amb la malaltia, reafirmant la base genètica de la resistència/susceptibilitat de l'hoste; a més, aporten informació del perfil de diferents citocines en la infecció per Leishmania infantum. / La leishmaniosis canina es una zoonosis causada por el protozoo Leishmania infantum y el perro es considerado el principal reservorio del parasito. Es una enfermedad endémica de la cuenca Mediterránea, Oriente medio y Sudamérica y la prevalencia en estas zonas llega al 67%. Además es una enfermedad en expansión ya que recientemente se han descrito casos en Estados Unidos y en Reino Unido.El objetivo de esta tesis es el estudio de la base molecular de la resistencia y la susceptibilidad a la leishmaniasis visceral canina (CVL) a partir de dos aproximaciones distintas, el estudio del polimorfismo en 12 genes candidatos y el MHC de clase II y el perfil inmunológico en el establecimiento de la infección y en la posterior evolución de la enfermedad.Se han caracterizado 22 nuevos SNPs para el gen Slc11a1, que está involucrado en la primera barrera de defensa contra los parásitos. Un estudio caso-control formado por 164 perros de 19 razas, donde se han analizado 24 polimorfismos para este gen, nos ha permitido identificar 3 SNPs significativos: A4549G localizado en el intrón 6, C4859T localizado en el exón 8 y C8542T localizado en el intrón 13, corroborando la implicación de este gen en la CVL.Gracias a un trabajo en colaboración con el Centre for Integrated Genomic Medical Research (Universidad de Manchester) se ha caracterizado la región del MHC de clase II y se han genotipado 97 SNPs en 11 genes candidatos relacionados con la respuesta inmune: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 y VDR (Vitamin D Receptor). El polimorfismo de estos genes se ha analizado en una población de 36 perros pertenecientes a razas que presentan una elevada prevalencia para la enfermedad.Se han identificado dos alelos asociados a susceptibilidad a la CVL, el alelo DQB1*02301 y el alelo DRB1*01502, corroborándose para este último la asociación descrita previamente. Estos dos alelos forman parte del mismo haplotipo en la raza boxer, raza en la que también se ha identificado un alelo que solo se encuentra en los animales controles, DRB1*01301. A partir del análisis de los 11 genes candidatos hemos identificado 3 SNPs significativamente asociados a CVL: 1 SNP localizado en la región 3' flanqueante de la IL-6 (20R191) y 2 SNPs localizados en el intrón 7 del gen VDR (13M453 y 15S439) sugiriendo un papel relevante de estos genes en la CVL.Todos estos genes candidatos han sido genotipados en una población de podencos ibicencos, raza considerada resistente a la leishmaniosis. Los resultados obtenidos confirman que esta raza tiene una base genética propia que probablemente configura su particular resistencia a la enfermedad. Se han identificado nuevos alelos para el MHC-II (DRB1*06901 y DQB1*04801) y haplotipos específicos para el gen Slc11a1. Para el análisis del perfil inmunológico en la infección por Leishmania infantum se ha llevado a cabo un estudio de expresión de citoquinas (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α y TGF-β), analizadas mensualmente durante un año, en beagles de infección experimental que presentaron diferencias en la progresión de la enfermedad. Hemos observado que en la fase inicial de la infección una predominante respuesta Th2 con una elevada expresión de IL-4 y IL-13 puede favorecer la replicación del parásito y la diseminación de la infección. La elevada expresión de IFN-γ durante la fase patente de la infección está asociada con el aumento de la carga parasitaria y a los síntomas clínicos. Además, es importante remarcar la elevada variabilidad de la expresión génica durante la pre-infección, dificultando el establecimiento de niveles de referencia de la expresión basal de estas citoquinas.Los resultados de esta tesis corroboran el papel de los genes Slc11a1 y DRB1 en la leishmaniosis visceral canina y ponen en evidencia nuevos genes candidatos relacionados con la enfermedad, reafirmando la base genética de la resistencia/susceptibilidad en el huésped; además, aportan información del perfil de diferentes citoquinas en la infección por Leishmania infantum. / Canine visceral leishmaniasis (CVL) is a zoonosis caused by Leishmania infantum. The dog is considered the main peridomestic reservoir of the parasite. CVL is endemic in the Mediterranean basin, Middle East, and South America and the prevalence of Leishmania infection can reach 67% in these areas. Moreover, leishmaniasis is emerging within non endemic areas such as North America and the United Kingdom. Leishmaniasis is thus increasingly becoming an important concern both from human public health and animal welfare perspectives.The aim of the present study is to insight into the molecular mechanisms of the resistance and susceptibility to CVL. Analyzing the polymorphism in 12 candidate genes and for the MHC class II region and by evaluating the immunological profile during the establishment of the infection and the progress of the disease. We have characterized 22 new SNPs in the Slc11a1 gene, which is involved in the first step of defense against the parasites and it is known for its multiple pleiotropic effects influencing the immune response. A total of 24 polymorphisms of the Slc11a1 gene have been typed in 164 dogs from 19 different breeds and we have discovered significant associations with CVL for 3 SNPs: A4549G in intron 6, C4859T in exon 8 and C8542T in intron 13, corroborating the role of this gene in CVL.In collaboration with the Centre for Integrated Genomic Medical Research (CIGMR) (University of Manchester) we have genotyped the MHC class II region and a panel of 97 SNPs from 11 candidate genes related with the immune response: IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12, MIF (Migration-Inhibitory Factor), NOS (Nitrix Oxide Synthase), TNF (Tumor Necrosis Factor), Slc11a1 and VDR (Vitamin D Receptor). Polymorphism at these genes has been analyzed in a breed-matched case-control study of 36 dogs of 4 different breeds known to be predisposed to CVL.We have identified two susceptibility alleles for CVL, the allele DQB1*02301 and allele DRB1*01502, corroborating for this allele the association previously described. These two alleles were found in the same haplotype in the boxer breed. Moreover, we have identified an allele (DRB1*01301) only in the control animals of this breed. Data analyses for the 11 candidate genes have revealed that 3 SNPs were significantly associated to CVL: 1 SNP identified in the 3' flanking region of IL-6 (20R191) and 2 SNPs identified in intron 7 of VDR gene (13M453 and 15S439), suggesting the role of these candidate genes on CVL.All these candidate genes have been genotyped in a cohort of Ibizan Hounds as a resistant breed. Data analysis confirms a specific genetic background for this breed that probably contributes to the resistance to CVL. New alleles for the MHC class II (DRB1*06901 and DQB1*04801) and specific haplotypes for the Slc11a1 gen have been identified.To evaluate the immunological profile associated to Leishmania infantum infection we have performed a cytokine gene expression study (IL-4, IL-10, IL-12, IL-13, IFN-γ, TNF-α and TGF-β) monthly during one year follow-up in six experimentally infected beagle dogs that presented different progression of the illness. Our results contribute to the knowledge of the pathogenesis of canine visceral leishmaniasis, which is marked by a balance production of Th1 and Th2 cytokines. In the first stage of infection a predominant Th2 response with an early IL-4 and IL-13 expression could favours parasite survival and the spread of the infection. A higher late IFN-γ expression is associated with the increase of parasite load and clinical status. Moreover, the high variability of expression during the pre-infection stage difficult the establishment of reference basal levels for these cytokines.The results of this study corroborate the role of the genes Slc11a1 and DRB1 in canine visceral leishmaniasis and provide new candidate genes related with the disease, further confirming the importance of host genetics in resistance/susceptibility to infectious disease. Moreover, they provide information of the cytokine profile in Leishmania infantum infection.

No description available.

Linhagens de camundongos selecionadas para a máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda diferem tanto na susceptibilidade a infecção por Salmonella entérica sorotipo Typhimurium (S. Typhimurium) e ao LPS. Diferentes frequências dos alelos do gene Nramp1, envolvido na resistência inata a infecção por S. Typhimurium, foram encontradas nas linhagens AIRmax e AIRmin. Para o estudo da interação do gene Nramp1 com os loci da inflamação, sublinhagens homozigotas para os alelos R e S deste gene foram produzidas, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR e AIRminSS. Os animais AIRmaxRR foram sensíveis ao LPS, enquanto que os AIRminSS foram os mais resistentes a endotoxina. Quando desafiados com LPS, os animais AIRmaxRR apresentaram maior nível sérico de citocinas inflamatórias e maior expressão gênica de Tnf, Il6 e Il1b em células de fígado e medula óssea. Os AIRminRR expressaram e produziram maiores níveis de Il10. Através da análise da expressão gênica global em células de medula óssea, os AIRminSS mostraram um número maior de genes envolvidos na resposta ao LPS. / Lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) and minimal (AIRmin) acute inflammatory reaction differ in susceptibility to infection with Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and to LPS sensitivity. Different frequencies of Nramp1 alleles, involved in innate resistance to S. Typhimurium infection, were found in AIRmax and AIRmin mouse lines. To study the Nramp1 gene interaction with acute inflammatory QTL, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS sublines were produced. AIRmaxRR were found to be extremely sensitive to LPS, while the AIRminSS were the most resistant line to endotoxin. After LPS challenged, AIRmaxRR animals showed higher levels of inflammatory cytokine sera and as well as Tnf, Il6 and IL1b gene expression intensities in liver and bone marrow cells. Il10 expression was higher in AIRminRR mice. The global gene expression analysis in bone marrow cells after LPS stimulus showed higher number of differently expressed genes in AIRminSS mice.

Linhagens de camundongos selecionadas para a máxima (AIRmax) ou mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda diferem tanto na susceptibilidade a infecção por Salmonella entérica sorotipo Typhimurium (S. Typhimurium) e ao LPS. Diferentes frequências dos alelos do gene Nramp1, envolvido na resistência inata a infecção por S. Typhimurium, foram encontradas nas linhagens AIRmax e AIRmin. Para o estudo da interação do gene Nramp1 com os loci da inflamação, sublinhagens homozigotas para os alelos R e S deste gene foram produzidas, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR e AIRminSS. Os animais AIRmaxRR foram sensíveis ao LPS, enquanto que os AIRminSS foram os mais resistentes a endotoxina. Quando desafiados com LPS, os animais AIRmaxRR apresentaram maior nível sérico de citocinas inflamatórias e maior expressão gênica de Tnf, Il6 e Il1b em células de fígado e medula óssea. Os AIRminRR expressaram e produziram maiores níveis de Il10. Através da análise da expressão gênica global em células de medula óssea, os AIRminSS mostraram um número maior de genes envolvidos na resposta ao LPS. / Lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) and minimal (AIRmin) acute inflammatory reaction differ in susceptibility to infection with Salmonella enterica serotype Typhimurium (S. Typhimurium) and to LPS sensitivity. Different frequencies of Nramp1 alleles, involved in innate resistance to S. Typhimurium infection, were found in AIRmax and AIRmin mouse lines. To study the Nramp1 gene interaction with acute inflammatory QTL, AIRmaxRR, AIRmaxSS, AIRminRR and AIRminSS sublines were produced. AIRmaxRR were found to be extremely sensitive to LPS, while the AIRminSS were the most resistant line to endotoxin. After LPS challenged, AIRmaxRR animals showed higher levels of inflammatory cytokine sera and as well as Tnf, Il6 and IL1b gene expression intensities in liver and bone marrow cells. Il10 expression was higher in AIRminRR mice. The global gene expression analysis in bone marrow cells after LPS stimulus showed higher number of differently expressed genes in AIRminSS mice.

Chaque individu est exposé quotidiennement à des agents infectieux comme les bactéries, les champignons, les virus et les parasites sans pour autant développer une maladie. Cependant, certains vont développer des infections graves et récurrentes, causées par des microbes dont certains ont un faible pouvoir pathogène pour l’homme. Ceci suggère, qu’il existe entre les individus sensibles et résistants une variabilité au niveau du système immunitaire. Deux types de déficits immunitaires primitifs (DIP) de transmission mendélienne ont été décrits. Les DIP dit « classiques » sont monogéniques et prédisposent majoritairement à une susceptibilité infectieuse à large spectre d’agents pathogènes (un gène, plusieurs infections). Les seconds DIP sont également monogéniques mais sont responsables d’une susceptibilité infectieuse réduite à un groupe de pathogènes (un gène, un seul type d’infection). Chez de nombreux, patients, le défaut génétique responsable de DIP n’est pas identifié. Dans ce contexte, l’objectif de recherche de mon doctorat a été de caractériser deux DIP responsables d’une susceptibilité aux infections bactériennes. J’ai tout d’abord mis en évidence un nouveau mécanisme physiopathologique de la protéine NEMO, régulateur de la voie NF-κB, responsable d’un DIP associé à une dysplasie ectodermale anhidrotique (EDA). Ce mécanisme pathologique est caractérisé par une expression et une structure protéique conservées mais confère sélectivement un défaut de liaison de NEMO à l’ubiquitine, interaction essentielle dans l’activation de la voie NF-κB. Ceci démontre qu’une expression et une structure protéique normales n'excluent en rien un rôle pathologique de mutations dans le gène NEMO, dans un EDA-DIP. Dans un deuxième temps, j’ai mis en évidence un nouveau DIP affectant la voie de l’explosion oxydative spécifiquement dans les polymorphonucléaires et qui confère une susceptibilité sélective aux infections bactériennes de type pyogènes. Le patient étudié est né de parents consanguins et a présenté des infections récurrentes des voies respiratoires supérieures ainsi qu’une cellulite à Staphylococcus epidermidis. Par une approche génétique associant analyse de liaison et séquençage de l'exome, une mutation homozygote rare a été identifiée dans le gène codant NRAMP1. Cette mutation co-ségrège avec la maladie selon un mode de transmission autosomique récessif et altère spécifiquement l’expression de la protéine dans les granulocytes. Ce premier déficit en NRAMP1 décrit chez l’homme, compromet à la fois la voie de l’explosion oxydative et le contrôle de l’infection in vitro par Staphylococcus aureus dans les granulocytes. Cette étude implique NRAMP1 dans l'immunité contre les bactéries pyogènes via son rôle dans la production des espèces réactives de l’oxygène dans les granulocytes. Ce travail ouvre la voie vers un meilleur diagnostique et conseil génétique pour les patients souffrant de PID. / Human populations are exposed to infectious agents such as bacteria, fungi, viruses and parasites on a daily basis without developing any disease. However, a minority of individuals will suffer from infections to some microbes that are usually non-pathogenic to man, or will undergo severe and/or recurrent diseases usually easily treatable for others. This means that there is variability among individuals regarding their immune system, underlined by genetics between susceptible and resistant individuals. Two types of primary immuno deficiencies with a Mendelian mode of inheritance have been described. The first known as the classical primary immunodeficiency and is monogenic and predisposes in general to infections with a broad spectrum of infectious agents (one gene, multiple infections). The second type is also monogenic but predisposes generally to infections limited to a particular group of pathogens (one gene, one type of infection). The aim of my doctoral research was to characterize two new immunodeficiencies. First I highlighted a new physiopathological mechanism of the NEMO protein, a regulator of NF-κB pathway. This defect is characterized by normal protein expression and folding, but a specific defect of NEMO’s ubiquitin binding, which is an essential mechanism for the activation and regulation of the NF-κB pathway. This demonstrates that normal expression and structure of the protein do not exclude a pathological role of NEMO mutations in EDA-ID. I also described a new immune deficiency affecting the respiratory burst pathway in granulocytes which specifically confers a selective susceptibility to pyogenic bacterial infections. We studied a patient who was born from consanguineous parents, and who suffered from recurrent infections of the upper respiratory tract and cellulitis to S. epidermidis. By a genetic approach involving linkage analysis and exome sequencing, I identified a rare homozygous mutation (V484M) in the gene encoding for the NRAMP1 protein that co segregates with the disease with an autosomal recessive transmission. Specifically, this mutation impairs NRAMP1 protein expression in granulocytes, while expression remains normal in other phagocytic cells. NRAMP1 deficiency impairs both the respiratory burst and control of in vitro infection by S. aureus in granulocytes. Therefore, we identified the first NRAMP1 human deficiency. The mutation selectively affects granulocytes and is clinically responsible for pyogenic infections. This study helps to delineate the role of NRAMP1 in immunity against pyogenic bacteria through its involvement in reactive oxygen species production in granulocytes.