Cela fait plus de quarante ans que la plupart des modifications des ARNt ont été découvertes mais ce n’est que récemment que les gènes correspondants ont pu être identifié. La modification N6-threonylcarbamoyl adénosine (t6A) est universelle et se trouve à la position 37, adjacente de l’anticodon, dans de nombreux ARNt. Les quatre gènes responsables de la synthèse de cette modification chez les bactéries furent découverts par des approches de génomique comparative mais uniquement deux de ces gènes sont universels, TsaC/Sua5 et TsaD/Kae1/Qri7. Des travaux récents ont révélé qu'il existait différentes voies enzymatiques pour la synthèse de cette modification selon domaine de la vie, les organelles et les espèces considérés. L'étude de ces variations est toujours en cours de caractérisation.Ce travail a identifié quatre autres protéines requises pour la synthèse de t6A dans les ARNt cytoplasmiques de levure (Bud32, Pcc1, Cgi121 et Gon7) et établi que seuls Sua5 et Qri7 sont requis pour modifier les ARNt mitochondriaux. La même enzyme, Sua5, effectue la première étape de la synthèse de t6A à la fois dans le cytoplasme et les mitochondries. Cette protéine peut être localisée dans les deux compartiments grâce à l’utilisation de sites d’initiation de la traduction différents. Cette étude a montré qu’une machinerie de synthèse minimale est requise pour la synthèse de t6A dans les mitochondries, potentiellement similaire à la machinerie présente dans le dernier ancêtre commun. Les rôles de cette modification complexe in vivo semblent également varier. Par exemple, t6A est indispensable chez les procaryotes, mais pas dans la levure. Les causes des phénotypes pléïotropes observés lors de la diminution ou l'absence de t6A ne sont pas encore entièrement comprises. Nous avons pu élucider certains des rôles joués par la modification t6A, en effectuant une analyse globale des erreurs de traduction observées en absence de cette modification par analyse des profils ribosomaux. Par exemple, il semble que la présence de t6A permet aux ARNt rares de concurrencer plus efficacement les ARNt abondants. La complexité et la diversité des voies de synthèse combiné à l’importance fonctionnelle et évolutive de cette modification ont fait de t6A une “décoration” des ARNt particulièrement fascinante à étudier. / The modification of tRNA has a rich literature of biochemical analysis going back more than 40 years; however, the genes responsible for the modifications have only been recently identified. Comparative genomic analysis has allowed for the identification of the genes in bacteria, and subsequent characterization of the enzymes, responsible for the modification N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) located at position 37, adjacent to the anticodon of tRNAs. While the modification is present in all domains of life, only two of the four enzymes responsible for biosynthesis machinery are conserved. In Eukaryotes, both cytoplasmic and mitochondrial tRNAs are modified with t6A, and previously only the two universally conserved members of the cytoplasmic t6A synthesis pathway, TsaC/Sua5 and TsaD/KaeI/Qri7 were known. Recent progress on deciphering the t6A synthesis pathways has revealed that different solutions have been adopted in different kingdoms, species, and organelles, and these variant pathways are still being characterized.This investigation identified the other four proteins required for cytoplasmic synthesis (Bud32, Pcc1, Cgi121, Gon7), and determined that only Sua5 and Qri7 are required for mitochondrial synthesis of t6A in yeast. The same enzyme, Sua5, performs the first step of t6A synthesis in both the cytoplasm and the mitochondria. It is targeted to both the cytoplasm and the mitochondria through the use of alternative, in-frame AUG translational start sites. This study showed that a minimum synthesis machinery is responsible for mitochondrial t6A, implicating a core set of enzymes from the LUCA.The roles of this complex modification in vivo also seem to vary. For example, t6A is essential in prokaryotes, but not in yeast. The causes of the observed pleiotropic phenotypes triggered by the reduction or absence of t6A synthesis enzymes are not yet fully understood. This work used ribosome profiling to map all translation errors occurring when t6A was absent. By examining ribosomal occupancy of every codon, this work indicates that t6A is helping rare tRNAs compete with high copy tRNAs. The complexity and diversity of the t6A pathway combined with the functional and evolutionary importance of this modification have made t6A a particularly fascinating “decoration” of tRNA to study.

Ce rapport de thèse présente l’étude de la technologie des empreintes moléculaires pour le développement de polymères spécifiques et sélectifs envers des biomarqueurs urinaires nucléosidiques du cancer colorectal chez l’Homme. L’objectif principal était de développer des polymères à empreintes moléculaires compatibles aux milieux aqueux en utilisant la technique du « dummy template », l’approche non-covalente and la polymérisation radicalaire en masse. Nous nous sommes concentrés principalement sur la qualité des polymères à partir de leur formulation, c’est-à-dire la spécificité et la sélectivité. Cela a été mené de façon empirique d’abord par la production de poudres issues de polymères monolithiques. Ainsi, pour atteindre les objectifs fixés, nous avons exploré le choix de la molécule « template ». Une étude de modèle est présentée au chapitre 3, en utilisant trois nucléosides 2’,3’,5’-peracétylés comme molécule empreinte dans une approche « dummy template ». Ensuite, en s’appuyant sur la connaissance apportée par le chapitre 3, nous avons développé des polymères à empreintes moléculaires (MIPs) sélectifs de la pseudouridine et de la N7-méthylguanosine dans les chapitres 4 et 5, respectivement, en utilisant la 2’,3’,5’-tri-O-acétylpseudouridine et la 2’,3’,5’-tri-O-acétylguanosine comme templates. L’étude de la rétention des nucléosides recherchés et de leurs analogues structuraux menée par chromatographie en phase liquide et par analyse frontale a permis de déterminer la capacité des différents polymères et de connaître leur comportement dans de l’urine synthétique. Finalement, pour évaluer la possible application de ces polymères dans un échantillon réel, l’urine humaine, la technique de l’extraction sur phase solide à empreintes moléculaires ou MISPE a été développée. Ainsi, une purification sélective des biomarqueurs cibles, tels que la pseudouridine et la N7-méthylguanosine, dans des échantillons d’urines a pu être démontrée. / This thesis report presents the exploration of molecularly imprinted polymer (MIP) technology for developing of a sensitive and selective polymers used in urinary nucleoside biomarker recognition. The main goal was to develop water compatible MIPs prepared by a “dummy template” imprinting technology, using a non-covalent approach and radical-polymerization in bulk. We were focusing mostly on the polymer quality in the formulation (rigidity, stability and repeatability). This was chosen empirically first by production of powders from monolithic MIP. Thus, to accomplish the stated goals, we have explored the choice of the template molecule. A model study presented by Chapter 3, using three 2’3’5’-tri-Operacylateduridine nucleosides as templates in a “dummy” template approach was first developed. Then, applying the knowledge of the type of template choice, we developed a selective MIP for recognition of pseudouridine and N7-methylguanosine in the studies presented in Chapter 4 and Chapter 5 respectively. By using 2’3’5’-tri-O-acetylpseudouridine and 2’3’5’-tri-O-acetylguanosine as templates. Chromatographic methods like HPLC retention and frontal analysis were used in the interest of determining the binding capacity of synthesized polymers, and the behavior in synthetic urine. Finally, to evaluate the possible application of these polymers in urine, molecularly imprinted solid phase extraction (MISPE) was developed. Selective purification of urine samples containing pseudouridine and N7-methylguanosine obtained in the end.

L'intégrase (IN) du VII 1 1 catalyse l'insertion de l'ADN viral dans le génome de la cellule infectée en deux étapes: le 3' processing et le transfert de brins. Nous avons déterminé le mode de liaison d'inhibiteurs de l'IN (des dérivés des Styrylquinoléines) au domaine central de la protéine, en corrélation avec leur mécanisme d'action in vitro. Afin de comprendre les effets d'analogues de l'ADN viral sur l'activité de 3' processing et donc sur l'interaction séquence spécifique IN/ADN, nous avons prédit la structure et la flexibilité de nucléosides modifiés en 2' et d'analogues de l'extrémité LTR U5 de l'ADN viral.