O zinco (Zn) é um mineral que participa de diversas funções biológicas no organismo. É necessário para cerca de 300 enzimas, dentre elas a enzima Cu, Zn - superóxido dismutase (SOD1) que desempenha ações importantes no controle do estresse oxidativo e no processo de carcinogênese. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) no gene para a SOD1 poderiam favorecer o aumento do estresse oxidativo e o surgimento do câncer. Este trabalho tem como objetivo avaliar a influência dos SNPs A35C (rs 2234694) e G2809A (rs 4998557) no gene da SOD1 no risco do câncer da cavidade oral e orofaringe (Estudo I) e associação entre esses SNPs, estado nutricional relativo ao zinco e estresse oxidativo em pacientes com câncer da cavidade oral e orofaringe (Estudo II). No Estudo I incluíram-se 169 homens com câncer da cavidade oral e orofaringe (casos) e 181 homens sem a doença (controles). A distribuição da frequência dos genótipos para o SNP A35C, para o grupo caso, foi de 91% de AA, 8% de AC e 1% de CC. Em relação ao genótipo para o SNP G2809A, no grupo caso observaram-se 66% de GG, 29% de GA e 5% de AA, e no grupo controle observaram-se 62% de GG, 34% de GA e 4% de AA. No estudo II incluíram-se 29 homens com câncer da cavidade oral e orofaringe. O consumo alimentar de Zn foi de 10,02 ± 4,81mg/dia [média ± desvio-padrão (dp)]. Observaram-se concentrações plasmáticas e eritrocitárias de Zn de 76,80 ± 23,77µg/dL e 44,26 ± 4,79 µg/g de hemoglobina (média ± dp); atividade da SOD total no eritrócito de 1.629,57 ± 675,25 U/g de hemoglobina (média ± dp); concentrações plasmáticas de malondialdeído (MDA) de 1,65 ± 0,58 nmol/dL (média ± dp); concentração de ORAC de 2607,89 ± 440,60 µmol TE/L. O SNP G2809A parece não ter influência no risco no câncer da cavidade oral e orofaringe. Os dados sugerem pacientes com câncer da cavidade oral e orofaringe apresentam deficiência no estado nutricional relativo ao Zn e aumento do estresse oxidativo. / Zinc (Zn) is a mineral with diverse biological functions. It is necessary for 300 enzymes, including Cu, Zn superoxide dismutase (SOD1) that displays important roles in oxidative stress control and in carcinogenesis. Single nucleotide polymorphisms (SNP) in SOD1 gene could lead to increased oxidative stress and cancer development. We aimed at investigating the influence of the A35C (rs 2234694) and G2809A (rs 4998557) SNPs in SOD1 gene on oral and orofaryngeal cancer risk (Study I) and the association between these SNPs, Zn nutritional status and oxidative stress in oral and orofaryngeal cancer patientes (Study II). 169 men with oral and orofaryngeal cancer (cases) and 181 men without the disease (controls) were included in Study I. Genotype frequency distribution for SOD1 A35C was the following: 91% AA, 8% AC and 1% CC (cases). Genotype frequency distribution for SOD1 G2809A was the following: 66% GG, 29% GA and 5% AA (cases) and 62% GG, 34% GA and 4% AA (controls). 29 men with oral and orofaryngeal cancer were included in Study II. Dietary Zn consumption was 10,02 ± 4,8 mg/day. Zn plasma and eritrocyte concentrations were 76,80 ± 23,77µg/dL and 44,26 ± 4,79 µg/g hemoglobin; total SOD activity in the eritrocyte was 1.629,57 ± 675,25 U/g hemoglobin; malondialdehyde (MDA) plasmatic concentration was 1,65 ± 0,58 nmol/dL and ORAC was 2607,89 ± 440,60 µmol TE/L. SOD1 G2809A does not seem to increase oral and orofaryngeal cancer risk. Furthermore oral and orofaryngeal cancer patients seem to present deficiency in Zn nutritional status and increased oxidative stress.

O zinco (Zn) é um mineral que participa de diversas funções biológicas no organismo. É necessário para cerca de 300 enzimas, dentre elas a enzima Cu, Zn - superóxido dismutase (SOD1) que desempenha ações importantes no controle do estresse oxidativo e no processo de carcinogênese. Polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) no gene para a SOD1 poderiam favorecer o aumento do estresse oxidativo e o surgimento do câncer. Este trabalho tem como objetivo avaliar a influência dos SNPs A35C (rs 2234694) e G2809A (rs 4998557) no gene da SOD1 no risco do câncer da cavidade oral e orofaringe (Estudo I) e associação entre esses SNPs, estado nutricional relativo ao zinco e estresse oxidativo em pacientes com câncer da cavidade oral e orofaringe (Estudo II). No Estudo I incluíram-se 169 homens com câncer da cavidade oral e orofaringe (casos) e 181 homens sem a doença (controles). A distribuição da frequência dos genótipos para o SNP A35C, para o grupo caso, foi de 91% de AA, 8% de AC e 1% de CC. Em relação ao genótipo para o SNP G2809A, no grupo caso observaram-se 66% de GG, 29% de GA e 5% de AA, e no grupo controle observaram-se 62% de GG, 34% de GA e 4% de AA. No estudo II incluíram-se 29 homens com câncer da cavidade oral e orofaringe. O consumo alimentar de Zn foi de 10,02 ± 4,81mg/dia [média ± desvio-padrão (dp)]. Observaram-se concentrações plasmáticas e eritrocitárias de Zn de 76,80 ± 23,77µg/dL e 44,26 ± 4,79 µg/g de hemoglobina (média ± dp); atividade da SOD total no eritrócito de 1.629,57 ± 675,25 U/g de hemoglobina (média ± dp); concentrações plasmáticas de malondialdeído (MDA) de 1,65 ± 0,58 nmol/dL (média ± dp); concentração de ORAC de 2607,89 ± 440,60 µmol TE/L. O SNP G2809A parece não ter influência no risco no câncer da cavidade oral e orofaringe. Os dados sugerem pacientes com câncer da cavidade oral e orofaringe apresentam deficiência no estado nutricional relativo ao Zn e aumento do estresse oxidativo. / Zinc (Zn) is a mineral with diverse biological functions. It is necessary for 300 enzymes, including Cu, Zn superoxide dismutase (SOD1) that displays important roles in oxidative stress control and in carcinogenesis. Single nucleotide polymorphisms (SNP) in SOD1 gene could lead to increased oxidative stress and cancer development. We aimed at investigating the influence of the A35C (rs 2234694) and G2809A (rs 4998557) SNPs in SOD1 gene on oral and orofaryngeal cancer risk (Study I) and the association between these SNPs, Zn nutritional status and oxidative stress in oral and orofaryngeal cancer patientes (Study II). 169 men with oral and orofaryngeal cancer (cases) and 181 men without the disease (controls) were included in Study I. Genotype frequency distribution for SOD1 A35C was the following: 91% AA, 8% AC and 1% CC (cases). Genotype frequency distribution for SOD1 G2809A was the following: 66% GG, 29% GA and 5% AA (cases) and 62% GG, 34% GA and 4% AA (controls). 29 men with oral and orofaryngeal cancer were included in Study II. Dietary Zn consumption was 10,02 ± 4,8 mg/day. Zn plasma and eritrocyte concentrations were 76,80 ± 23,77µg/dL and 44,26 ± 4,79 µg/g hemoglobin; total SOD activity in the eritrocyte was 1.629,57 ± 675,25 U/g hemoglobin; malondialdehyde (MDA) plasmatic concentration was 1,65 ± 0,58 nmol/dL and ORAC was 2607,89 ± 440,60 µmol TE/L. SOD1 G2809A does not seem to increase oral and orofaryngeal cancer risk. Furthermore oral and orofaryngeal cancer patients seem to present deficiency in Zn nutritional status and increased oxidative stress.

O dano genético pode ocorrer espontaneamente sob circunstâncias metabólicas normais e pode ser potencializado em situações de deficiência dietética e exposição excessiva a mutagênicos e carcinogênicos ambientais. As deficiências de ácido fólico, vitamina B6 e vitamina B12 podem levar a um aumento nos níveis e alterações na metilação do DNA. MTHFR é a enzima chave na via de metabolização do folato e o polimorfismo MTHFR C677T conduz à redução na atividade da enzima. O objetivo deste estudo foi avaliar influências da ingestão dos micronutrientes B12, B6 e folato (B9), do polimorfismo MTHFR C677T na instabilidade genômica de indivíduos expostos ocupacionalmente a pesticidas. O estudo envolveu 69 homens e 41 mulheres (n= 110) com uma idade média 42,3 ± 13,32 anos no qual 42 (38,2%) deles apresentaram peso normal, 51 (46,4%) sobrepeso e 15 (13,6%) obesidade grau I, todos os indivíduos da amostra são fumicultores de Venâncio Aires e Santa Cruz do Sul (estado do Rio Grande do Sul, Brasil). A genotipagem do polimorfismo MTHFR C677T foi realizada pelo método PCR-RFLP. Os dados de dano de DNA foram avaliados pelos biomarcadores de exposição ocupacional ensaio cometa e micronúcleo. O status nutricional foi avaliado com base na média de 3 recordatórios de 24 horas (coletados em 3 dias não consecutivos , incluindo um final de semana em um intervalo de 4 meses). A ingestão dos micronutrientes foi estimada usando o programa nutricional Food Processor SQL 10.9. Não foram encontradas diferenças significativas entre idade e tempo de exposição a pesticidas para os parâmetros analisados. Encontramos aumento na frequência de micronúcleo de linfócitos em indivíduos com ingestão inadequada de folato e vitamina B12, apresentando diferença significativa (P = 0,030) e (P = 0,014) respectivamente quando comparados com os indivíduos com ingestão adequada. Dano de DNA não mostrou resultados significativos quando relacionados com tabagismo, anos de exposição, IMC e polimorfismo MTHFR C677T. A correlação entre dano do DNA, ingestão de folato, B6 e B12 e o polimorfismo MTHFR não apresentou significância. Em conclusão, nossos resultados indicaram que a adequação de folato para valores ≥ 320 μg /dia e vitamina B12 ≥ 2,0 μg /dia, nesta amostra exposta, estaria protegendo da ação mutagênica dos pesticidas. A dieta adequada, tanto em folato quanto em vitamina B12 poderia estar auxiliando em um reparo de DNA adequado sugerindo um fator de proteção nesses indivíduos. / Genetic damage can occur spontaneously under normal metabolic circumstances and can also be present in situations of dietary deficiency or inadequate intake of nutrients and excessive exposure to environmental mutagens. The purpose of this study was to evaluate the influence of the intake of micronutrients B12, B6 and folate and of polymorphism MTHFR C677T in the induction of DNA damage in individuals exposed to pesticides. The study involved 69 men and 41 women who were tobacco farmers in the region of Venâncio Aires (State of Rio Grande do Sul, Brasil). DNA damage was analyzed by the Comet Test and Micronucleus Test (MN); dietary intake was evaluated based on the mean of three 24-hour Diet Recall questionnaires. The nutrient intake data were computerized and estimated in the Food Processor SQL 10.9 program. The DNA damage results showed a significant increase in MN frequency in the lymphocytes of individuals who had an inadequate intake of folate and B12 (P = 0.030 and P = 0.014, respectively). No significant association was found between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T. Correlations between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T and nutrient intake were not significant. In conclusion, our results indicated that the adequate intake of folate (≥ 320 μg /day) and vitamin B12 (≥ 2,0 μg /day) can provide protection from the mutagenic action of pesticides. A dietary adaptation of folate and B12 can ensure adequate repair, showing that diet is a protective factor in this population.

O dano genético pode ocorrer espontaneamente sob circunstâncias metabólicas normais e pode ser potencializado em situações de deficiência dietética e exposição excessiva a mutagênicos e carcinogênicos ambientais. As deficiências de ácido fólico, vitamina B6 e vitamina B12 podem levar a um aumento nos níveis e alterações na metilação do DNA. MTHFR é a enzima chave na via de metabolização do folato e o polimorfismo MTHFR C677T conduz à redução na atividade da enzima. O objetivo deste estudo foi avaliar influências da ingestão dos micronutrientes B12, B6 e folato (B9), do polimorfismo MTHFR C677T na instabilidade genômica de indivíduos expostos ocupacionalmente a pesticidas. O estudo envolveu 69 homens e 41 mulheres (n= 110) com uma idade média 42,3 ± 13,32 anos no qual 42 (38,2%) deles apresentaram peso normal, 51 (46,4%) sobrepeso e 15 (13,6%) obesidade grau I, todos os indivíduos da amostra são fumicultores de Venâncio Aires e Santa Cruz do Sul (estado do Rio Grande do Sul, Brasil). A genotipagem do polimorfismo MTHFR C677T foi realizada pelo método PCR-RFLP. Os dados de dano de DNA foram avaliados pelos biomarcadores de exposição ocupacional ensaio cometa e micronúcleo. O status nutricional foi avaliado com base na média de 3 recordatórios de 24 horas (coletados em 3 dias não consecutivos , incluindo um final de semana em um intervalo de 4 meses). A ingestão dos micronutrientes foi estimada usando o programa nutricional Food Processor SQL 10.9. Não foram encontradas diferenças significativas entre idade e tempo de exposição a pesticidas para os parâmetros analisados. Encontramos aumento na frequência de micronúcleo de linfócitos em indivíduos com ingestão inadequada de folato e vitamina B12, apresentando diferença significativa (P = 0,030) e (P = 0,014) respectivamente quando comparados com os indivíduos com ingestão adequada. Dano de DNA não mostrou resultados significativos quando relacionados com tabagismo, anos de exposição, IMC e polimorfismo MTHFR C677T. A correlação entre dano do DNA, ingestão de folato, B6 e B12 e o polimorfismo MTHFR não apresentou significância. Em conclusão, nossos resultados indicaram que a adequação de folato para valores ≥ 320 μg /dia e vitamina B12 ≥ 2,0 μg /dia, nesta amostra exposta, estaria protegendo da ação mutagênica dos pesticidas. A dieta adequada, tanto em folato quanto em vitamina B12 poderia estar auxiliando em um reparo de DNA adequado sugerindo um fator de proteção nesses indivíduos. / Genetic damage can occur spontaneously under normal metabolic circumstances and can also be present in situations of dietary deficiency or inadequate intake of nutrients and excessive exposure to environmental mutagens. The purpose of this study was to evaluate the influence of the intake of micronutrients B12, B6 and folate and of polymorphism MTHFR C677T in the induction of DNA damage in individuals exposed to pesticides. The study involved 69 men and 41 women who were tobacco farmers in the region of Venâncio Aires (State of Rio Grande do Sul, Brasil). DNA damage was analyzed by the Comet Test and Micronucleus Test (MN); dietary intake was evaluated based on the mean of three 24-hour Diet Recall questionnaires. The nutrient intake data were computerized and estimated in the Food Processor SQL 10.9 program. The DNA damage results showed a significant increase in MN frequency in the lymphocytes of individuals who had an inadequate intake of folate and B12 (P = 0.030 and P = 0.014, respectively). No significant association was found between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T. Correlations between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T and nutrient intake were not significant. In conclusion, our results indicated that the adequate intake of folate (≥ 320 μg /day) and vitamin B12 (≥ 2,0 μg /day) can provide protection from the mutagenic action of pesticides. A dietary adaptation of folate and B12 can ensure adequate repair, showing that diet is a protective factor in this population.

O dano genético pode ocorrer espontaneamente sob circunstâncias metabólicas normais e pode ser potencializado em situações de deficiência dietética e exposição excessiva a mutagênicos e carcinogênicos ambientais. As deficiências de ácido fólico, vitamina B6 e vitamina B12 podem levar a um aumento nos níveis e alterações na metilação do DNA. MTHFR é a enzima chave na via de metabolização do folato e o polimorfismo MTHFR C677T conduz à redução na atividade da enzima. O objetivo deste estudo foi avaliar influências da ingestão dos micronutrientes B12, B6 e folato (B9), do polimorfismo MTHFR C677T na instabilidade genômica de indivíduos expostos ocupacionalmente a pesticidas. O estudo envolveu 69 homens e 41 mulheres (n= 110) com uma idade média 42,3 ± 13,32 anos no qual 42 (38,2%) deles apresentaram peso normal, 51 (46,4%) sobrepeso e 15 (13,6%) obesidade grau I, todos os indivíduos da amostra são fumicultores de Venâncio Aires e Santa Cruz do Sul (estado do Rio Grande do Sul, Brasil). A genotipagem do polimorfismo MTHFR C677T foi realizada pelo método PCR-RFLP. Os dados de dano de DNA foram avaliados pelos biomarcadores de exposição ocupacional ensaio cometa e micronúcleo. O status nutricional foi avaliado com base na média de 3 recordatórios de 24 horas (coletados em 3 dias não consecutivos , incluindo um final de semana em um intervalo de 4 meses). A ingestão dos micronutrientes foi estimada usando o programa nutricional Food Processor SQL 10.9. Não foram encontradas diferenças significativas entre idade e tempo de exposição a pesticidas para os parâmetros analisados. Encontramos aumento na frequência de micronúcleo de linfócitos em indivíduos com ingestão inadequada de folato e vitamina B12, apresentando diferença significativa (P = 0,030) e (P = 0,014) respectivamente quando comparados com os indivíduos com ingestão adequada. Dano de DNA não mostrou resultados significativos quando relacionados com tabagismo, anos de exposição, IMC e polimorfismo MTHFR C677T. A correlação entre dano do DNA, ingestão de folato, B6 e B12 e o polimorfismo MTHFR não apresentou significância. Em conclusão, nossos resultados indicaram que a adequação de folato para valores ≥ 320 μg /dia e vitamina B12 ≥ 2,0 μg /dia, nesta amostra exposta, estaria protegendo da ação mutagênica dos pesticidas. A dieta adequada, tanto em folato quanto em vitamina B12 poderia estar auxiliando em um reparo de DNA adequado sugerindo um fator de proteção nesses indivíduos. / Genetic damage can occur spontaneously under normal metabolic circumstances and can also be present in situations of dietary deficiency or inadequate intake of nutrients and excessive exposure to environmental mutagens. The purpose of this study was to evaluate the influence of the intake of micronutrients B12, B6 and folate and of polymorphism MTHFR C677T in the induction of DNA damage in individuals exposed to pesticides. The study involved 69 men and 41 women who were tobacco farmers in the region of Venâncio Aires (State of Rio Grande do Sul, Brasil). DNA damage was analyzed by the Comet Test and Micronucleus Test (MN); dietary intake was evaluated based on the mean of three 24-hour Diet Recall questionnaires. The nutrient intake data were computerized and estimated in the Food Processor SQL 10.9 program. The DNA damage results showed a significant increase in MN frequency in the lymphocytes of individuals who had an inadequate intake of folate and B12 (P = 0.030 and P = 0.014, respectively). No significant association was found between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T. Correlations between DNA damage and polymorphism MTHFR C677T and nutrient intake were not significant. In conclusion, our results indicated that the adequate intake of folate (≥ 320 μg /day) and vitamin B12 (≥ 2,0 μg /day) can provide protection from the mutagenic action of pesticides. A dietary adaptation of folate and B12 can ensure adequate repair, showing that diet is a protective factor in this population.

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer

Alterações epigenéticas, como metilação do DNA e modificações pós traducionais em histonas, tem importante papel na carcinogênese mamária. A modulação de eventos epigenéticos constitui relevante alvo terapêutico, devido ao seu caráter reversível. Experimentalmente, o ácido docosahexaenoico (DHA), um membro da família dos ácidos graxos ômega-3, é capaz de diminuir proliferação, induzir morte celular e diminuir o potencial invasivo de células tumorais de mama. No entanto, os mecanismos antitumorais do DHA e sua capacidade de modular eventos epigenéticos ainda não estão totalmente elucidados. Nosso objetivo foi verificar, in vitro, a ação do DHA em eventos epigenéticos em diferentes linhagens de carcinoma mamário humano. Três linhagens celulares de câncer de mama (MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7) foram tratadas durante 72 horas com 100 ?M de DHA ou etanol (controle). As modificações pós traducionais em histonas, acetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9ac) e no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac), bem como trimetilação no resíduo de lisina 9 da histona 3 (H3K9me3) e no resíduo de lisina 27 da histona 3 (H3K27me3) foram avaliadas pela técnica de western blot. A análise da expressão do genes RASSF1A, DNMT1, DNMT3A e DNMT3B foi feita pela técnica da reação em cadeia da polimerase quantitativa via transcriptase reversa (RT-qPCR). A avaliação do padrão de metilação de região promotora do gene RASSF1A foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase metilação específica (MS-PCR). Foram também analisadas as fases do ciclo celular por citometria de fluxo. Comparado ao controle, o DHA induziu a acetilação no resíduo 16 da histona 4 (H4K16ac) nas linhagens MCF7 (p = 0,04) e MDA-MB-231 (p = 0,03). Observamos que a H3K9me3 foi parcialmente inibida nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3, após o tratamento com DHA, mas sem alcançar valor estatisticamente significante. Encontramos também diminuição dos níveis de H3K27me3 após o tratamento com DHA nas três linhagens estudadas, porém não foi estatisticamente significativo. O DHA aumentou a expressão do gene RASSF1A na linhagem MCF-7 (1,98 vezes, p = 0,03), mas não nas linhagens MDA-MB-231 e SKBR-3. Não houve mudanças estatisticamente significativas na expressão dos genes DNMT1, DNMT3A e DNMT3B. As análises qualitativas da metilação demonstraram que a região promotora analisada do gene RASSF1A apresentou-se hipermetilada nas três linhagens celulares. Após o tratamento com DHA, houve tendência de desmetilação na região promotora do RASSF1A na linhagem MCF-7 e SKBR3, mas não na linhagem MDA-MB-231. Não houve diferença significativa na porcentagem de morte e distribuição das células MDA-MB-231, SKBR-3 e MCF-7 nas diferentes fases do ciclo celular após tratamento com DHA. Em conclusão, o DHA pode atuar em mecanismos epigenéticos e, ainda, reativar o gene supressor de tumor, como RASSF1A, anteriormente silenciado por hipermetilação, em células MCF-7. Espera-se que esses resultados contribuam para melhor compreensão do potencial papel anticâncer do DHA no câncer de mama / Epigenetic changes, such as DNA methylation and post-translational histone modifications, play an important role in mammary tumorigenesis. Epigenetic events are important as therapeutic targets, because of its reversible nature. Experimentally, docosahexaenoic acid (DHA), a member of the omega-3 fatty acids family, can reduce proliferation, induce apoptosis and decrease the invasive potential of breast tumor cells. However, the antitumor mechanism of DHA and its ability to modulate epigenetic events are not completely understood. Our objective was to verify, in vitro, the action of DHA in epigenetic events related to transcriptional reactivation of tumor suppressor gene, such as RASSF1A, in different human breast cancer cell lines. Three breast cancer cell lines (MCF-7, MDA-MB-231, SKBR-3) were treated with DHA (100 ?M) or vehicle (ethanol) for 72 hours. Western blot was used to analyze histone modification, as histone H3 lysine 9 (H3K9ac) and histone H4 lysine 16 (H4K16ac) acetylation, H3K9 trimethylation (H3K9me3) and H3K27 trimethylation (H3K27me3). Real time quantitative PCR (RT-qPCR) was performed for gene expression quantification of RASSF1A, DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. DNA methylation of the promoter region of RASSF1A was evaluated by methylation specific PCR (MS-PCR). Moreover, we evaluated the phases of the cell cycle by flow cytometry. Compared to control cells, DHA induced H4K16ac in MCF-7 (p=0.04) and MDA-MB-231 (p=0.03). We observed that H3K9me3 was partially inhibited in MDA-MB-231 and SKBR-3 cells, after treatment with DHA, but did not reach a statistically significant value. We also found decreased levels of H3K27me3 after treatment with DHA in the three cell lines studied, but not statistically significant. DHA increased RASSF1A expression on MCF-7 (1.98 fold; p=0.03), but not in MDA-MB-231 and in SKBR-3 cells. There were no statistically significant changes in expression of genes DNMT1, DNMT3A and DNMT3B. These three breast cancer cells lines show methylation in specific region of RASSF1A promoter. DHA treatment increased RASSF1A promoter region hypomethylation in MCF-7 and SKBR-3. No significant difference was observed in the percentage of cell death nor cell distribution of MDA-MB-231, SKBR-3 and MCF-7 at different stages of the cell cycle after treatment with DHA. In conclusion, we suggest that DHA may act beneficially in epigenetic mechanisms and reactivation of tumor suppressor gene, RASSF1A as previously silenced by hypermethylation. It is hoped that these results can contribute to better understanding of the anticancer role of DHA in breast cancer