Objetivou-se no presente estudo avaliar a influência da alta ou baixa ingestão de matéria seca e/ou energia na qualidade ovocitária, produção in vitro de embriões e taxa de concepção. Foram utilizadas 33 vacas Nelores não lactantes, idade entre 4 e 10 anos, peso corporal (PC) de 489,5±11,3 kg e escore de condição corporal (ECC) de 3,25. As vacas foram mantidas confinadas em baias, sem acesso a pastagem, com dois animais por baia. Sal mineral foi fornecido na dieta e água à vontade. Após 15 dias de adaptação, os animais foram agrupados de acordo com o PC e divididos aleatoriamente em quatro grupos. As vacas do grupo mantença (M) receberam dieta de manutenção do PC consumindo 1,2% de MS por kg de PC. O grupo restrição (0,7M) recebeu o equivalente a 70% do fornecido ao grupo M, ou seja, 0,84% de MS por kg de PC. O grupo alta ingestão (1,5M) recebeu o equivalente a 150% do oferecido ao grupo M, ou seja, 1,8% de MS por kg de PC. O grupo energia (E) recebeu uma dieta com quantidade de MS semelhante ao grupo M, porém, com níveis energéticos equivalentes ao grupo 1,5M. O delineamento foi em quadrado latino, portanto, os animais passaram por todas as dietas. Foram realizadas quatro seções de OPU com 37 dias de intervalo. Os ovócitos recuperados foram classificados e levados ao laboratório da In Vitro Brasil, onde, os procedimentos da PIVE foram realizados. Os embriões foram vitrificados/desvitrificados e inovulados em receptoras sincronizadas na Fazenda Figueira, Londrina, PR. Os dados foram analisados por meio do PROC GLIMMIX do SAS e as médias apresentadas na forma de quadrados mínimos ± EP, seguindo a ordem dos grupos M, 0,7M, 1,5M e E. Observou-se efeito de grupo (P=0,008) no número de ovócitos viáveis, sendo que as vacas do grupo 0,7M produziram mais ovócitos viáveis do que os grupos M e E (14,4±1,6b; 17,0±1,9a; 15,7±1,7ab e 14,1±1,6b). No total de ovócitos recuperados, o grupo 0,7M diferiu (P=0,02) dos grupos M e E (20,2±2,0b; 23,0±2,3a; 21,5±2,2ab e 20,1±2,0b). Em relação aos clivados o grupo 0,7M diferiu (P=0,04) do grupo M (10,7±1,4b; 13,4±1,7a; 12,6±1,6ab e 11,7±1,5ab). O número de blastocistos foi similar (P=0,15) entre os grupos (5,4±0,8; 6,9±0,9; 5,9±0,8; 6,6±0,9). Com relação à porcentagem de ovócitos viáveis sobre o total não houve diferença (P=0,41) entre os grupos (72,8±0,02%, 75,4±0,02%, 72,9±0,02% e 71,7±0,02%). Não se observou diferença (P=0,67) na porcentagem de blastocistos sobre o total de ovócitos (31,9±0,04%; 30,6±0,04%; 31,1±0,04% e 34,0±0,04%;). A taxa de concepção aos 30 (30,3±0,06%, 34,4±0,06%, 26,3±0,06% e 30,5±0,06%; P=0,49) e aos 60 dias (20,8±0,05%; 26,3±0,05%; 18,1±0,05% e 22,0±0,05%; P=0,43) não diferiu entre os tratamentos. Com relação à perda gestacional, não houve diferença (P=0,84) entre os grupos (20,0±0,05%; 13,3±0,05%; 18,0±0,05% e 16,0±0,05). Apesar de ter havido uma discreta vantagem do grupo 0,7M no número de ovócitos viáveis, totais e na clivagem em relação aos demais grupos, isso não refletiu na produção de blastocistos. Da mesma forma, contrariando a hipótese inicial a alta IMS ou energia por um período de 30 dias não parece ter comprometido a PIVE e a taxa de concepção. / The aim of this study was to evaluate the influence of high or low dry matter intake and/or energy on oocyte quality and embryo production in vitro. 33 non lactating Nellore cows, aged between 4 and 10 years, body weight (BW) of 489.5±11.3 kg and body condition score (BCS) 3.25 were used. The cows were confined without access to pasture, with two animals per stall. Mineral salt was provided in the diet and water ad libitum. After 15 days on the adaptation diet, cows were blocked by initial weight and randomly allocated in four experimental groups. The maintenance group (M) received a diet of weight maintenance consuming 1.2% of DM per kg of BW. The restriction group (0,7M) received the equivalent of 70% of the group M diet consuming 0.84% of DM per kg of BW. High intake group (1,5M) received the equivalent of 150% of the M group offered. Since the energy group (E) received a diet with DM similar to M group, however, with energy level equivalent to 1,5M. The cows received all the diets in a latin-square design. There were four sessions of ovum pick up (OPU), 37 days apart. The oocytes were classified and taken to the In Vitro Brazil laboratory, where all procedures of in vitro production were realized. The embryos were vitrified and then thawed and transferred to synchronized recipients at Figueira Farm, Londrina, PR. Data were analyzed by PROC GLIMMIX of SAS and the results were presented as least squares means ± SE following the order of treatments M, 0,7M, 1,5M and E. Treatment effect was observed (P=0.008) in the number of viable oocytes. The group 0,7M showed better results compared to groups M and E (14.4±1.6b; 17.0±1.9a; 15.7±1.7ab and 14.1±1.6b). In the total number of recovered oocytes, the group 0,7M (P=0.02) differed from groups M and E, but did not differ from group 1,5M (20.2±2.0b; 23.0±2.3a; 21.5±2.2ab and 20.1±2.0b). In the analyses of cleaved the group 0,7M was different from group M (10.7±1.4b; 13.4±1.7a; 12.6±1.6ab and 11.7±1.5ab). The number of blastocysts was similar (P=0.15) between treatments (5.4±0.8; 6.9±0.9; 5.9±0.8 and 6.6±0.9). The percentage of viable oocytes was not different (P=0.41) between groups (72.8±0.02%, 75.4±0.02%, 72.9±0.02% and 71.7±0.02%). There was also no difference in the percentage of blastocysts among groups (31.9±0.04%; 30.6±0.04%; 31.1±0.04% and 34.0±0.04%). The conception rate at 30 days (30.3±0.06%; 34.4±0.06%; 26.3±0.06% and 30.5±0.06%; P=0.49) and at 60 days (20.8±0.05%; 26.3±0.05%; 18.1±0.05% and 22.0±0.05%; P=0.43) did not differ among treatments. Pregnancy loss also did not differ (P=0.84) among groups (20.0±0.05%; 13.3±0.05%; 18.0±0.05% e 16.0±0.05). Although there was an apparent advantage of food restriction on the number of viable, total oocytes and cleavage compared to other groups, this did not reflect in the blastocyst production. Likewise, contrasting with the initial hypothesis high DMI or energy intake for a period of 30 days does not seem to have compromised the IVP and conception rate following the transfer of these embryos.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.

A infertilidade é uma condição clínica que acomete até 15% dos casais em idade reprodutiva. Como forma de tratamento para essa parcela da população a Medicina Reprodutiva dispõe de várias técnicas de Reprodução Assistida que visam auxiliar o casal na obtenção da gestação. O primeiro passo para obtenção de sucesso na Medicina Reprodutiva é o correto diagnóstico da infertilidade e, do ponto de vista didático, as causas de infertilidade podem ser classificadas em: feminina, masculina, mista ou desconhecida. A causa feminina de infertilidade apresenta como importante fator o ovariano, representado, principalmente, por alterações no processo de maturação do oócito e/ou no processo de foliculogênese. Com relação à maturação do oócito, um dos possíveis tratamentos oferecidos pela Medicina Reprodutiva é a aplicação da técnica de maturação in vitro (MIV). Infelizmente a MIV não apresenta resultados animadores, e um dos motivos é a falta de um método adequado de seleção dos gametas de humanos que podem ser destinados à ela. No entanto, várias técnicas de seleção de oóticos já foram descritas para espécies animais; dentre elas destaca-se a coloração dos complexos cumuli-oócitos com o corante Azul Cresil Brilhante (BCB). A sua aplicação na espécie humana permanece com ressalvas, uma vez que a comunidade científica preocupa-se com os possíveis efeitos tóxicos dessa substância. Nesta Tese, conseguimos demonstrar, através da avaliação de ensaios de viabilidade e de proliferação celular, e da expressão gênica e proteica, a inocuidade dessa substância para o modelo de cultura primária de células foliculares ovarianas luteinizadas, indicando que o protocolo de coloração com BCB é seguro para a espécie humana. Adicionalmente, conseguimos caracterizar e padronizar o cultivo dessas células, que são amplamente utilizadas em estudos na área da Medicina Reprodutiva. Com relação ao outro fator ovariano de infertilidade (o processo de foliculogênese), sabe-se que a depleção acelerada dos folículos ovarianos pode provocar falência ovariana precoce (FOP), uma condição clínica que acomete até 1% das mulheres em idade reprodutiva e leva à infertilidade. Uma das causas da FOP é a alteração no gene Fragile X Mental Retardation 1 (FMR1) e consequentemente em sua proteína (FMRP). Muito do conhecimento do controle dessa proteína provem de experimentos em neurônios, onde o seu controle já foi elucidado. Nesta Tese, conseguimos demonstrar que o controle dessa proteína nas células ovarianas de humanos é similar ao controle que ocorre nos neurônios, envolvendo a via de sinalização S6K. / Infertility is a clinical condition that affects up to 15% of couples of reproductive age. Reproductive medicine applies many assisted reproductive technologies (ARTs) in order to help them to achieve pregnancy. The first step for infertility treatment success is the correct infertility diagnosis, which is divided into four categories: female, male, mixed or unknown. Female infertility is chiefly represented by ovarian dysfunctions, which are generally related to oocyte maturation and/or folliculogenesis. With regard to oocyte maturation, in vitro oocyte maturation (IVM) is one ART that can be applied but, unfortunately, nowadays it does not present suitable results, since we do not have an effective method of selecting competent human oocytes. On the other hand, in animal reproduction brilliant cresyl blue (BCB) staining has already been described as an appropriate method for oocyte selection. However its clinical applicability to humans is some away off, owing to concerns about its safety. In this thesis we have demonstrated (through many cellular viability and proliferation assays and gene and protein expression), that BCB staining, applying the correct protocol, seems to be safe for use in humans (using the primary culture of human ovarian follicular cells as an experimental model). Additionally, we have characterized and standardized the primary culture of human ovarian follicular cells, and this experimental model is widely applied in reproductive medicine experiments. With regard to folliculogenesis, it is well known that premature ovarian failure/insufficiency (POF/POI) is one condition that can be caused by follicle depletion (when folliculogenesis occurs too fast). This condition affects about 1% of females of reproductive age, causing infertility. Genetic alterations, such as in the fragile X mental retardation 1 (FMR1) gene and its protein FMRP, are considered as one cause of POF/POI. Most of our knowledge about FMRP cellular control comes from studies on neurons, and in these cells we have a clue about its control. In this thesis, we have shown that FMRP control on human granulosa cells is similar to its control on neurons, and this involves the S6K pathway.