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Il sarcoma di Ewing (ES) è un tumore maligno pediatrico dell’apparato scheletrico; è associato a una traslocazione specifica codificante la proteina di fusione EWS-FLI1 e all’alta espressione di CD99, una glicoproteina di membrana fisiologicamente coinvolta in diversi processi biologici. EWS-FLI1 e CD99, sono riportati avere ruoli divergenti nella modulazione della malignità e del differenziamento di ES. CD99 inoltre è riportato modulare il pathway di MAPK, il quale interagendo con molteplici fattori di trascrizione partecipa a processi di proliferazione e differenziamento. In questo studio abbiamo investigato in due linee cellulari di ES silenziate per CD99 (TC-71shCD99 e IOR/CARshCD99) l’attività basale di diversi fattori trascrizionali quali: NF-kBp65, AP1, Elk-1, E2F e CREB. L’unico fattore trascrizionale statisticamente significativo è risultato essere NF-kBp65 e abbiamo valutato il suo ruolo nel differenziamento neurale di cellule di ES e la relazione con EWS-FLI1 e CD99. L’attività trascrizionale di NF-kB è stata valutata attraverso gene reporter assay in linee cellulari di ES a diversa espressione di CD99, EWS-FLI1 e NF-kB stesso. Il differenziamento neurale è stato valutato come espressione di βIII-Tubulin in immunofluorescenza. Il silenziamento di CD99 induce una down-modulazione dell’attività trascrizionale di NF-kB, mentre il knockdown di EWS-FLI1 ne induce un’aumento. Inoltre, il silenziamento di EWS-FLI1 non è in grado di contrastare la riduzione dell’attività di NF-kB osservata dopo silenziamento di CD99, suggerendo un ruolo dominante del CD99 nel signaling di NF-kB. Cellule deprivate di CD99 ma non di EWS-FLI1, mostrano un fenotipo differenziato in senso neurale, fenotipo che viene perso quando le cellule sono indotte a sovraesprimere NF-kB. Inoltre, in cellule CD99 positive, il silenziamento di NF-kB induce un leggero differenziamento neurale. In conclusione, questi dati hanno evidenziato il ruolo di NF-kB nel differenziamento di cellule di ES e che potrebbe essere un potenziale target nel ridurre la progressione di questo tumore. / Ewing sarcoma (ES) is a pediatric high-grade malignant bone tumor, associated with a specific chromosomal translocation encoding the EWS-FLI1 fusion protein and high expression of CD99, a membrane protein physiologically involved in several biological processes. EWS-FLI1 and CD99 were reported to have divergent roles in modulating ES malignancy and neural differentiation. CD99 was also found to modulate MAPK pathway which can cooperate with several transcription factors in proliferation and differentiation processes. In this study we investigated in two different cell lines silenced for CD99 (TC-71shCD99 and IOR/CARshCD99 models) the basal activity of different transcription factors such as: NF-kBp65, AP1, Elk-1, E2F and CREB. The only transcription factor statistically significant was nuclear factor-kappa B (NF-kB) and we investigated its role on neural differentiation in ES cells and its relationship with EWS-FLI1 and CD99. Transcriptional activity of NF-kB was evaluated by gene reporter assay in ES cell lines modified for the expression of CD99, EWS-FLI1 and NF-kB itself. Neural differentiation was detected by evaluating βIII-Tubulin using immunofluorescence microscopy. CD99 silencing was found to decrease NF-kB activity. On the contrary, EWS-FLI1 knockdown increased NF-kB transactivation. EWS-FLI1 silencing was not able to rescue the reduction of NF-kB activity observed after CD99 deprivation, suggesting that CD99 is dominant in NF-kB signaling. Cells deprived of CD99 but not of EWS-FLI1 showed a neural differentiated phenotype, which was lost when cells were induced to overexpress NF-kB. In contrast, in CD99 positive cells, silencing of NF-kB induced a weak neural differentiation. Our findings support the concept that NF-kB activity plays a role in the differentiation of ES cells, identifying NF-kB as a potential target for reducing Ewing tumor progression.

Obiettivi: nonostante i miglioramenti nel trattamento, circa il 30% dei pazienti pediatrici affetti da Linfoma di Hodgkin (LH) in stadio avanzato recidiva o muore per progressione di malattia e i correnti metodi predittivi biologico-clinici non consentono di individuare tali pazienti. L’obiettivo dello studio è stato quello di definire un profilo molecolare di rischio che correli con l’outcome in questi pazienti. Materiali e metodi: studio retrospettico condotto su pazienti pediatrici affetti da LH omogeneamente trattati dal 2004 in poi. Su tali pazienti è stato intrapreso uno studio di validazione di marcatori molecolari già identificati in studi esplorativi precedenti. 27 geni sono stati analizzati in RT PCR su campioni di tessuto istologico prelevato alla diagnosi fissato in formalina e processato in paraffina relativi a una coorte di 37 pazienti, 12 ad outcome sfavorevole e 25 ad outcome favorevole. Risultati: dall’analisi univariata è emerso che solo l’espressione di CASP3 e CYCS, appartenenti al pathway apoptotico, è in grado di influenzare l’EFS in modo significativo nella nostra coorte di pazienti. Lo studio delle possibili combinazioni di questi geni ha mostrato l’esistenza di 3 gruppi di rischio che correlano con l’EFS: alto rischio (down regolazione di entrambi i geni), rischio intermedio (down regolazione di uno solo dei 2 geni), basso rischio (up regolazione di entrambi i geni). Dall’analisi multivariata è emerso che CASP3 è l’unica variabile che mantiene la sua indipendenza nell’influenzare la prognosi con un rischio di eventi di oltre il doppio di chi ha un’espressione bassa di questo gene. Conclusioni: i risultati ottenuti sulla nostra coorte di pazienti pediatrici affetti da LH confermano l’impatto sulla prognosi di due marcatori molecolari CASP3 e CYCS coinvolti nel patwhay apoptotico. La valutazione del profilo di espressione di tali geni, potrebbe pertanto essere utilizzata in corso di stadiazione, come criterio di predittività. / Purpose: despite improvement in the treatment of advanced Hodgkin lymphoma (HL), approximately 30% of pediatric patients relapse or die as result of the disease. Current methods to predict prognosis determined by clinical and biological parameters, fail to identify these patients accurately. The aim of this study was to define a molecular profile of risk correlates with outcome in these patients. Methods: retrospective study of pediatric patients with LH homogeneously treated from 2004 onwards. Of these patients was undertaken a validation study of molecular markers already identified in exploratory studies previously. 27 best predictor genes in HL was evaluated in RT PCR in formalin-fixed paraffin embedded diagnostic lymph-node samples obtained from 37 pediatric patients with HL, including 25 responders and 12 non responders to standard treatment and compared the expression profiles of patients with favorable and unfavourable clinical outcome. Results: univariate regression analysis revealed that only the expression of CASP3 and CYCS genes, involved in the apoptotic pathway, is able to significantly predict failure to treatment in our cohort of patients. The study of the possible combinations of these genes has shown the existence of 3 risk groups that correlate with EFS: high risk (down regulation of both genes), intermediate risk (down regulation of only one of the 2 genes), low risk (up regulation of both genes). Multivariate analysis showed that CASP3 is the only variable that maintains its independence in influencing the prognosis with a risk of events more than double in patients with low expression of this gene Conclusions: The results of our cohort of pediatric patients with HL confirm the impact on prognosis of two molecular markers CASP3 and CYCS involved in the apoptotic pathway. The evaluation of the expression profile of these genes, may therefore be used in the course of staging, as a criterion of predictivity.

L’osteosarcoma (OS) è il tumore primitivo dell’osso più comune in età pediatrica e adolescenziale. L’OS è stato recentemente riconsiderato come una patologia da de-differenziamento, legata all’interruzione del processo cui vanno incontro i precursori osteoblastici, quali le cellule staminali mesenchimali (MSCs), per trasformarsi in osteoblasti maturi. Il sistema IGF è coinvolto nella regolazione della proliferazione e del differenziamento di cellule di OS. IRS-1 è un mediatore critico di tale via di segnalazione e il suo livello di espressione modula il differenziamento di cellule ematopoietiche. Lo scopo di questa tesi è stato quello di definire il ruolo di IRS-1 nel differenziamento osteoblastico di MSCs e cellule di OS. Il potenziale differenziativo di cellule di OS umano e murino e di MSCs derivate da midollo osseo è stato valutato tramite Alizarin Red staining e Real Time-PCR. Dai dati ottenuti è emerso come i livelli di espressione di IRS-1 diminuiscano durante il differenziamento osteoblastico. Conseguentemente, i livelli di espressione di IRS-1 sono stati manipolati utilizzando shRNA per down-regolare l’espressione della proteina o un plasmide per sovra-esprimerla. Sia la down-regolazione sia la sovra-espressione di IRS-1 hanno inibito il differenziamento osteoblastico delle linee cellulari considerate. Allo scopo di valutare il contributo di IRS-1 nella via di segnalazione di IGF-1R è stato utilizzato l’inibitore di tale recettore, αIR-3. Anche in questo caso è stata osservata una riduzione della capacità differenziativa. L’inibitore del proteasoma MG-132 ha portato ad un aumento dei livelli di IRS-1, portando nuovamente all’inibizione del differenziamento osteoblastico e suggerendo che l’ubiquitinazione di questa proteina potrebbe avere un ruolo importante nel mantenimento di appropriati livelli di espressione di IRS-1. I risultati ottenuti indicano la criticità dei livelli di espressione di IRS-1 nella determinazione della capacità differenziativa sia di cellule di OS umano e murino, sia delle MSCs. / Osteosarcoma (OS) is the most common primary malignant bone tumor affecting children and adolescents. OS has recently been re-considered as a differentiation disease, caused by genetic and epigenetic alterations which may impair normal bone development by blocking multipotent mesenchymal stem cell (MSCs) differentiation into osteoblasts. The IGF-system is involved in regulating OS cell proliferation and differentiation. IRS-1 is a critical mediator of IGF-1R signaling and its expression level modulates hematopoietic cell differentiation. The aim of this study is to define the role of IRS-1 in the osteoblastic differentiation of MSCs and OS cells. Differentiating potential of human and murine OS cell lines and bone marrow-derived mouse MSCs was evaluated by Alizarin Red staining and real-time PCR. We found that IRS-1 expression level decreased during differentiation. Consequently, IRS-1 expression levels were manipulated using shRNAs to knock-down, or a plasmid to over-express the protein. Both down-regulation and over-expression of IRS-1 inhibited osteoblastic differentiation. To understand the contribution of IRS-1 in the IGF-1R pathway we used the αIR-3 IGF-1R blocking antibody, which inhibited the differentiation process. The proteasome inhibitor MG-132 led to an increase in IRS-1 protein level that again inhibited osteoblastic differentiation, suggesting ubiquitination may play a role in maintaining the appropriate expression level of IRS-1. Taken together, these results indicate that IRS-1 expression level is critical for determining the differentiating capacity of MSCs as well as human and mouse OS cells and that precise regulation of IRS-1 expression by cells is required for this commitment to osteoblastic differentiation.

L’acido perfluorottanoico (PFOA) e l’acido perfluoronanoico (PFNA) sono composti perfluorurati (PFCs) comunemente utilizzati nell’industria, negli ultimi 60 anni, per diverse applicazioni. A causa della loro resistenza alla degradazione, questi composti sono in grado di accumularsi nell’ambiente e negli organismi viventi, da cui possono essere assunti in particolare attraverso la dieta. Le esistenti evidenze sugli effetti dell’esposizione negli animali, tra cui la potenziale cancerogenicità, hanno accresciuto l’interesse sui possibili rischi per la salute nell’uomo. Recenti studi sull’uomo indicano che i PFC sono presenti nel siero, con livelli molto alti soprattutto nei lavoratori cronicamente esposti, e sono associati positivamente al cancro al seno e alla prostata. Inoltre, sono state riportate proprietà estrogen-like e variazioni nei livelli di metilazione sui promotori di alcuni geni. L’esposizione in utero è stata associata positivamente a ipometilazione globale del DNA nel siero cordonale. L’obiettivo di questo studio è stato quello di indagare gli effetti dell’esposizione a questi perfluorurati su linee cellulari tumorali e primarie umane (MOLM-13, RPMI, HEPG2, MCF7,WBC, HMEC e MCF12A), appartenenti a diversi tessuti target, utilizzando un ampio range di concentrazioni (3.12 nM - 500 μM). In particolare, si è valutato: la vitalità, il ciclo cellulare, l’espressione genica, la metilazione globale del DNA e la metilazione gene specifica. Dai risultati è emerso come entrambi i perfluorurati abbiano effetti biologici: PFOA presenta un effetto prevalente citostatico, PFNA prevalentemente citotossico. L’effetto è, però, prevalente sulle linee cellulari primarie di epitelio mammario (HMEC, MCF12A), anche a concentrazioni riscontrate in lavoratori cronicamente esposti (≥31,25 µM). Dall’analisi su queste cellule primarie, non risultano variazioni significative della metilazione globale del DNA alle concentrazioni di 15,6 e 31,25 µM. Emergono invece variazioni sui geni marcatori del cancro al seno, del ciclo cellulare, dell’apoptosi, del pathway di PPAR-α e degli estrogeni, ad una concentrazione di 31,25 µM di entrambi i PFCs. / Perfluorooctanoic acid (PFOA) and perfluoronanoico acid (PFNA) are perfluorinated compounds (PFCs) largely employed during the last 60 years for several applications. Because of their resistance to degradation, they accumulate in the environment and organisms, for which the principal route of intake is the diet. The available information concerning their adverse effects on health in animals has recently increased the interest on the possible health risks in humans. Studies in humans indicate that PFCs are in serum at very high levels, especially in workers chronically exposed. Positive association with breast cancer and prostate cancer have been reported, but also estrogen -like property and variations in levels of methylation on genes promoters. In utero exposure was positively associated with global DNA hypomethylation in cord blood serum. The aim of this study was to investigate the effects of exposure to these perfluorinated on tumor and primary human cell lines ( MOLM -13, RPMI, HEPG2, MCF7, WBC, HMEC, MCF12A, belonging to different target tissues, using a wide range of concentrations (3.12 nM - 500 µM). In particular, it was assessed: the viability, cell cycle, gene expression, the global DNA methylation and gene specific methylation. The results showed that PFOA has a cytostatic effect, PFNA is mainly cytotoxic. The prevalent effect is on mammary epithelium primary cell(HMEC, MCF12A), even at concentrations found in chronically exposed workers (≥ 31.25 µM). The results don’t show significant changes in global DNA methylation at concentrations of 15.6 and 31.25 µM on the same cells, but we found variations of the methylation level on breast cancer markers genes and cell cycle, apoptosis, PPAR-α and estrogen pathways genes, after exposure to a concentration of 31.25 µM of PFCs.

Cer and So are involved in regulation of apoptosis and cell cycle arrest while on the other hand S1P promotes cell growth and inhibits apoptosis. The antagonistic effects of these metabolites are regulated by enzymes that interconvert Cer, So, and S1P. In this work two of these enzymes were studied: sphingosine phosphate lyase and acid ceramidase. First several methods to determine the activity of these enzymes were developed and optimized, resulting in the publication of sensitive fluorogenic and chromatographic methods for enzyme activity. Particularly the assay optimized for acid ceramidase activity was used in the finding and identification of new inhibitors in several compound libraries. As a result compounds RBM2-1B, RBM2-1D and RBM2-1E were identified as acid ceramidase and dihydroceramide desaturase inhibitors. Furthermore compounds RBM1-12, RBM1-13 and SABRAC were also described as acid ceramidase inhibitors. Since several publications described the upregulation of acid ceramidase in advanced prostate cancer, we decided to investigate the particular effect of the acid ceramidase inhibition in a cellular model of advanced prostate cancer. Using cells PC-3/Mc we inhibited acid ceramidase through two different approaches: first silencing the gen ASAH1 and comparing the effects with chemical inhibition of the enzyme using compounds RBM1-12, RBM1-13 and SABRAC. We evaluate the effect of acid ceramidase inhibition in cell growth, invasivity and 3D growth in vitro, finding a diminished growth and 3D growth in both cells those knockdown for ASAH1 and treated with inhibitors. Finally, the effect of ASAH1 silencing in in vivo tumor growth and lung colonization was also determined. To this end male NOD-SCID mice were used for xenotransplants with cells PC-3/Mc_ASAH1_KD or control and the tumor growth or lung colonization was followed by luminometry. We found that the silencing of ASAH1 in PC-3/Mc cells delayed the growth and also the lung colonization, highlighting the potential of acid ceramidase inhibition as adjuvant in the treatment of prostate cancer and also in the prevention of metastases formation.

FALCÃO, Ana Herminia Portela Bandeira de Melo. Avaliação da farmacovigilância na quimioterapia antineoplásica com o protocolo FEC (5-fluorouracil, epirrubicina e ciclofosfamida) em pacientes com câncer de mama. 2009. 161 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2013-04-29T12:05:46Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_ahpbmfalcão.pdf: 8087459 bytes, checksum: 7b8a3c247f4c214983d6aa6d54383bba (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Fernandes(erikaleitefernandes@gmail.com) on 2013-04-29T16:29:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_ahpbmfalcão.pdf: 8087459 bytes, checksum: 7b8a3c247f4c214983d6aa6d54383bba (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-29T16:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_ahpbmfalcão.pdf: 8087459 bytes, checksum: 7b8a3c247f4c214983d6aa6d54383bba (MD5) Previous issue date: 2009 / Pharmacovigilance is the science concerning the detection, assessment, understanding and prevention of adverse reactions or any other possible drug-related problems. In Brazil, pharmacovigilance is in the developmental stage. The culture of spontaneous reporting not yet fully spread, especially in oncology, where the occurrence of adverse reaction is often unnoticed because it is considered as an expected event, and therefore immaterial. This study evaluated the pharmacovigilance actions carried out at a hospital in the city of Teresina, PI, through the monitoring of patients with breast cancer undergoing anticancer therapy with the FEC protocol. An investigation was undertaken based on a review of the medical records of these patients to detect the registry: of adverse reactions resulting from cancer chemotherapy and the distinction of them according to the degrees of severity established by the National Cancer Institute (NCI); of clinical interventions due to ADR that occurred during therapy and possible changes in the plan of treatment protocol (delays in the achievement of cycles of chemotherapy or temporary suspension of therapy, reductions in the recommended doses) related with adverse reactions. Of all the adverse reactions observed during the investigation, 2,07% were not registered in accordance with the terminology adopted by NCI qualitative and 15,06% were not graded as to severity. In addition, 100% of ADRs were not reported to the recognized health authority (ANVISA) and there is not an institutional database with these adverse reactions. There were also 17 identified (70,83%) clinical interventions due to ADR performed on an outpatient basid and 7 (29,17%) clinical interventions due to ADR that required hospitalization of the patient; delays or temporary suspension of achievement of cycles of chemotherapy with 8,70% due to clinical causes among these adverse reactions; and 8 (5,84%) cases of dose reduction due to the presence and severity of adverse reactions. It is concluded that the pharmacovigilance actions of the hospital are still preliminary, with organizational flaws that reduce the reliability of the information recorded. In addition, there was evidence of the importance of pharmacovigilance in oncology, where the toxicity of drugs used may be considered a limiting factor necessary for an ideal therapeutic practice. / A farmacovigilância é a ciência relativa à detecção, avaliação, compreensão e prevenção de reações adversas ou quaisquer outros possíveis problemas relacionados a medicamentos. No Brasil, a farmacovigilância encontra-se em desenvolvimento. Ainda não está completamente disseminada a cultura da notificação espontânea, principalmente na oncologia, onde a ocorrência de reação adversa passa muitas vezes despercebida por ser considerada como um evento esperado, e, portanto, sem importância significativa. Este estudo avaliou as ações de farmacovigilância desenvolvidas numa instituição hospitalar da cidade de Teresina-PI, através da monitorização de pacientes portadores de câncer de mama submetidos à terapia antineoplásica com o regime de combinação FEC. Para isso, foi realizada uma investigação baseada em uma revisão dos prontuários desses pacientes para detectar o registro: de reações adversas decorrentes da quimioterapia antineoplásica vigente e da distinção das mesmas, segundo os graus de severidade estabelecidos pelo National Cancer Institute (NCI); de intercorrências clínicas devido à RAM ocorridas durante a terapia e de possíveis alterações no plano do tratamento protocolado (atrasos na realização dos ciclos de quimioterapia ou suspensão temporária da terapia, reduções das doses preconizadas) relacionadas com reações adversas. De todas as reações adversas observadas durante a investigação, 2,07% foram registradas em não conformidade com a terminologia qualitativa adotada pelo NCI e 15,06% não foram graduadas quanto à severidade; além disso, 100% das RAMs não foram notificadas à autoridade sanitária competente (ANVISA) e não existe um banco de dados institucional com essas reações adversas. Foram ainda identificadas 17 (70,83%) intervenções clínicas devido à RAM realizadas em nível ambulatorial e 7 (29,17%) intervenções clínicas devido à RAM que exigiram a hospitalização do paciente; atrasos ou suspensão temporária da realização dos ciclos de quimioterapia, com 8,70% decorrentes de causas clínicas, entre estas reações adversas; e 8 (5,84%) casos de redução das doses protocoladas devido à presença e severidade de reações adversas. Conclui-se que as ações de farmacovigilância da instituição hospitalar ainda são incipientes, com falhas organizacionais que diminuem a confiabilidade das informações registradas; além disso, houve a comprovação da importância da farmacovigilância em oncologia, onde a toxicidade dos fármacos utilizados pode ser considerada fator limitante primário para uma prática terapêutica ideal.