Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular. / Los fotorreceptores se encuentran ampliamente distribuidos en todos los dominios de la vida, y se caracterizan por experimentar cambios de conformación inducidos por la presencia o ausencia de luz. Estas moléculas, junto con distintas herramientas ópticas, han permitido la aparición de la optogenética, que consiste en el uso de luz para permitir el comando de distintos procesos biológicos con un fino control espacio-temporal. El uso de luz como tratamiento inductor se destaca debido a que es una señal fácil de regular y con gran resolución espacial, popularizando su uso en sistemas mamíferos. Recientemente, el organismo modelo Saccharomyces cerevisiae ha sido también adoptado como una plataforma para este tipo de aproximaciones, ya que no presenta fotorreceptores descritos, y por lo tanto, no es capaz de sensar la luz. Recientemente, se ha descrito un sistema optogenético llamado Fungal Light- Oxygen-Voltage (FUN-LOV). Este se basa en la interacción de los dominios LOV de las proteínas WHITE COLLAR 1 (WC-1) y VIVID (VVD) del hongo Neurospora crassa, y en la arquitectura clásica de los sistemas de doble híbrido. FUN-LOV presentó notables niveles de inducción en la transcripción de un gen reportero luciferasa, y bajo ruido en condiciones de oscuridad, por lo que se presenta como uno de los sistemas optogenéticos más robustos reportados hasta la fecha. Sin embargo, poco se sabe sobre el papel que cumplen los distintos dominios de las proteínas que participan en este tipo de arquitectura para la funcionalidad y robustez del sistema optogenético. Es por esto que este seminario de título se presenta como una revisión de la modularidad y robustez del sistema FUN-LOV. Para esto se intercambiaron los dominios de unión a DNA (DBD) y de activación (AD) del sistema original por el de diferentes factores de transcripción (TF), ampliamente descritos en S. cerevisiae, tales como el DBD de las proteínas LexA y Cup2p, y el AD de VP16. Con el objetivo de realizar esta evaluación se generaron las correspondientes construcciones genéticas in silico, para luego ensamblarlas in vivo usando clonamiento por recombinación en levaduras. La evaluación de los sistemas se realizó de forma indirecta a través de la cuantificación de la actividad del gen reportero luciferasa (LUC) en respuesta a luz azul (BL) y al estímulo particular de cada dominio intercambiado (cobre, luz roja). Como resultado se obtuvo que ambos sistemas en los que se hizo un cambio a nivel de DBD/promotor, presentaron una pérdida en su funcionalidad y robustez, lo que sugiere fuertemente que dichos módulos son de vital importancia para este tipo de sistemas optogenéticos. Por su parte, el sistema FUN-LOV VP16 mantuvo su funcionalidad como interruptor-optogenético, pero presentó un menor nivel de inducción de actividad luciferasa, además de una cinética más lenta comparado con el sistema ya reportado. Finalmente, se concluye que el sistema FUN-LOV no es modular a nivel de DBD/promotor, ya que al remplazar estos módulos el sistema pierde su funcionalidad y robustez. Por otro lado, el sistema es modular a nivel de AD, ya que mantiene su funcionalidad, mientras que la robustez varía dependiendo de la naturaleza del AD a utilizar. / Photoreceptors are widely distributed in all the domains of life and are characterized by undergoing conformational changes induced by the presence or absence of light. These molecules, together with different optical tools, have allowed the appearance of optogenetics, which involves the use of light to allow the command of different biological processes with a fine spatio-temporal control. Light as an inducer treatment is remarkable since it is easy to regulate and provides great spatial resolution, which has boosted its use in mammalian systems. Recently, the model organism Saccharomyces cerevisiae has been adopted as an ideal platform for this kind of systems, due to the absence of described photoreceptors, and therefore, it is not capable to sense the light. Recently, an optogenetic system called FUN-LOV has been described. FUN-LOV is based on the interaction of Neurospora crassa photoreceptors WC-1 and VVD, and on the classical architecture of the double hybrid systems. FUN-LOV showed remarkable levels of luciferase gene expression, and low noise in dark conditions, so it is presented as one of the most robust optogenetic systems reported so far. Nonetheless, little is known about the role played by the different protein domains for the functionality and robustness of the optogenetic system. Therefore, this title seminar is presented as a revision of modularity and robustness of the FUN-LOV system. For this, the DBD and AD of the original system were exchanged for different TF domains widely described in S. cerevisiae, such as the DBD of the LexA and Cup2 proteins, and the AD of VP16. The evaluation was carried out generating the genetic constructions in silico, to then assemble them in vivo using yeast recombinational cloning. The evaluation of the systems was performed indirectly through the activity quantification of LUC reporter gene in response to BL and the particular stimulus for each domain exchanged (copper, red light). As results, a loss of functionality and robustness was observed when the domains where exchanged at the DBD/promoter level, strongly suggesting that these modules are crucial for this type of optogenetic systems. On other side, the FUN-LOV VP16 system keep its functionality as an opto-switch, but showed a lower induction of luciferase activity, and slower kinetics in relation with the already reported system. Finally, we concluded that FUN-LOV is not a modular system at the DBD/promoter level, because functionality and robustness of the system are lost when these modules were replaced. Nonetheless, the system is modular at the AD level, since it maintained its functionality, meanwhile the robustness varies depending on the nature of the AD used. / FONDECYT-Regular 1171151 y el Instituto Milenio de Biología Integrativa (iBio).

Os neurônios do grupamento catecolaminérgico C1, localizados na porção ventrolateral do bulbo, são classicamente conhecidos por seu envolvimento no controle cardiovascular. O modelo atual propõe que os neurônios C1 são recrutados em situações que ofereçam risco de vida aos indivíduos, desencadeando respostas generalizadas e estereotipadas em defesa da homeostase. Tais respostas envolvem ajustes cardiovasculares, imunológicos, neuroendócrinos, metabólicos, termorregulatórios e respiratórios. Ferramentas anatômicas e funcionais foram utilizadas para investigar se os neurônios C1 contribuem para os ajustes respiratórios induzidos pela hipóxia e pela hipercpania. Os resultados mostram que os neurônios C1 contribuem para a aumento da ventilação induzido pela hipóxia, mas não pela hiperpania, via aumento da frequência da respiratória. Além disso, demonstramos que o aumento da frequência respiratória promovido pela ativação do grupamento C1 depende da ativação de receptores glutamatérgicos, mas não adrenérgicos, localizados na região do complexo pré-Bötzinger. / The catecholaminergic C1 neurons, located in the rostral ventrolateral portion of the medulla, are classically known by their involvement in the cardiovascular control. Recent models suggest that C1 neurons are recruited in situations of life risk, triggering generalized and stereotyped responses to homeostasis. Such responses involve cardiovascular, immunologic, neuroendocrine, metabolic, thermoregulatory and respiratory adjustments. Thus, anatomic and functional tools were used to assess the contribution of C1 neurons to the respiratory adjustments induced by hypoxia and hypercapnia. The results show that these neurons contribute to the increase of ventilation induced by hypoxia, but not by hypercapnia, via an increase of the breathing frequency. Moreover, we demonstrated that increase of breathing frequency promoted by the activation of C1 neurons depend on the activation of glutamatergic receptors, but not adrenergic, located in the pre-Bötzinge complex.

[ES] La lesión medular traumática (LM) se refiere a una condición neurológica en la que un insulto mecánico interrumpe la adecuada comunicación de impulsos nerviosos a través del sistema nervioso central (SNC), resultando en la pérdida de función locomotora por debajo del área lesionada. Lamentablemente, en la actualidad aún no existe cura efectiva para restaurar la funcionalidad después de una LM. La búsqueda de un tratamiento eficiente sigue siendo un gran desafío debido a nuestra aún incompleta comprensión de la multitud de procesos biológicos desencadenados por la lesión. La terapia celular destaca como la aproximación más recurrente para el tratamiento de la LM. En las últimas décadas, se han explorado varias estrategias celulares, siendo una de las más prometedoras el trasplante de células progenitoras neurales (CPN). Muchos estudios preclínicos demostrado el potencial del trasplante de CPN para proporcionar una recuperación motora en modelos animales, sin embargo, las mejoras funcionales en ensayos clinicos humanos son limitadas. Por lo tanto, aún se deben realizar esfuerzos para descubrir la cascada precisa de procesos moleculares a lo largo de la fisiopatología de LM, así como el mecanismo subyacente de los CPN. En ese contexto, el Capítulo 1 del presente trabajo tuvo como objetivo proporcionar una caracterización de los cambios en el perfil transcripcional medular a lo largo de las diferentes etapas temporales de una lesión severa contusiva. Además, hemos descrito el impacto transcripcional del trasplante de CPN en ratas lesionadas. Hemos demostrado que mientras la LM conllevó una fuerte desregulación de varios componentes de señalización de AMPc (entre ellos EPAC2), el trasplante de CPN pudo restaurar estas alteraciones transcripcionales. Para explorar el papel de EPAC2 en el mecanismo terapéutico mediado por CPN, realizamos un experimento de inhibición sostenida de EPAC2 mediante la administración de ESI-05. En comparación con los animales solo trasplantados, los animales CPN +ESI-05 mostraron un aumento en el área de cicatriz, una exacerbación de la polarización de la microglía hacia un perfil inflamatorio y una ampliación de la brecha de neuronas preservadas a lo largo de la lesión, sugiriendo que el trnasplante de CPN en el contexto de LM implican un mecanismo dependiente de EPAC2, reduciendo la neuroinflamación y proporcionando un entorno neuro-permisivo. El Capítulo 2 explora el potencial del AMPc para la regeneración de la LM. Hemos diseñado una estrategia innovadora para inducir AMPc en las neuronas corticoespinales a través de la activación optogenética de un adenilato ciclasa foto-inducible (bPAC). La estimulación optogenética en ratas con una hemisección dorsal torácica promovió una recuperación locomotora en comparación con el grupo control. Además, la estimulación de bPAC aumentó el número de neuronas marcadas retrógradamente desde el segmento lumbar tanto en la corteza motora como en la formación rafe-reticular, pero no en el núcleo rojo.La inmunotinción del tracto rafespinal mostró que la estimulación de bPAC aumenta el ratio de axones serotonérgicos caudales a la lesión correlacionando con una mejora funcional. Por último, la depleción del sistema serotoninérgico mediante la administración de 5,7-Dihydroxytryptamina suprimió la abolió la mejora mediada por bPAC, confirmando la implicación de la vía serotoninérgica en la recuperación de los animales estimulados. En resumen, se han proporcionado nuevos conocimientos sobre los cambios transcripcionales que ocurren a lo largo de la progresión de la LM y tras el trasplante de CPN, con énfasis en la señalización de AMPc. La manipulación optogenética de AMPc en las neuronas corticoespinales después de la LM ha demostrado ser efectiva para la recuperación funcional y permitido descubrir una ruta cortical alternativa a través del tracto descendente serotoninérgico / [CA] Lesió medul·lar traumàtica (LM) es una condició neurològica en la qual un traumatisme interromp la comunicació adequada dels impulsos a través del sistema nerviós central (SNC), amb el resultat de la pèrdua de la funció locomotora per baix de la zona lesionada. Lamentablement, en l'actualitat encara no hi ha una cura efectiva per a restaurar completament la funcionalitat de la medul·la espinal després de la lesió. La recerca d'un tractament eficient per a la LM roman un repte complex a causa de la nostra comprensió encara incompleta de la gran quantitat de processos biològics desencadenats per la lesió primària. La teràpia cel·lular destaca com l'aproximació més recurrent per al tractament de la LM. En les dècades passades, s'ha explorat diverses estratègies basades en cèl·lules i una de les més prometedores és el trasplantament de cèl·lules progenitores neurals (CPN). Molts estudis preclínics han demostrat el potencial del trasplantament de CPN per proporcionar una recuperació motora en models animals, no obstant això, les millores funcionals en pacients humans tractats són limitades. Per tant, encara s'han de fer esforços per a descobrir la cascada precisa de processos moleculars al llarg de la fisiopatologia de la LM, així com el mecanisme subjacent dels CPN. El Capítol 1 del present treball va tindre com a objectiu proporcionar una caracterització dels canvis en el perfil transcripcional espinal al la llarga de les diferents etapes temporals de una lesió contusiva. A més, s'ha descrit l'impacte transcripcional del trasplantament d'CPN en animals lesionats. S'ha demostrat que mentre la LM va causar una forta desregulació de diversos components de senyalització de AMPc (sent EPAC2 el gen més regulat a la baixa), el transplantament de CPN van ser capaç de restaurar les alteracions derivades de la LM. Per a explorar el paper d'EPAC2 en el mecanisme terapèutic mediat per CPN, es va realitzar un experiment de inhibició sostinguda d'EPAC2 degut a l'administració d'ESI en animals lesionats. En comparació amb els animals només trasplantats, els animals CPN+ESI-05 van mostrar un augment de l'àrea de cicatriu, una exacerbació de la polarització de les micròglies cap a un perfil inflamatori i una ampliació de la bretxa de neurones preservades a través de la lesió.Aquests resultats suggereixen que el trasplantament de CPN en el context de la LM involucren un mecanisme depenent d'EPAC2, reduint la neuroinflamació i proporcionant un entorn més neuropermissiu. El Capítol 2 va tindre com objectiu explotar el potencial de regeneració de AMPc dissenyant una nova estratègia per a les induccions artificials de AMPc en les neurones corticoespinals mitjançant l'activació optogenètica d'una adenilat ciclasa fotoinduïble (bPAC). L'estimulació diària de AMPc en rates que pateixen una hemisècció dorsal toràcica va promoure una recuperació en comparació amb els control. L'estimulació de bPAC va augmentar el nombre de neurones marcades retrògradament des del segment lumbar, tant a l'escorça motora com a la formació rafe-reticular, però no al nucli roig. A més, la immunotinció del tracte rafespinal va mostrar que l'estimulació de bPAC va augmentar la ràtio d'axons serotoninèrgic cabals a la lesió, cosa que es va correlacionar significativament amb una millora dels paràmetres funcionals. Finalment, la depleció del sistema serotoninèrgic mitjançant l'administració de 5,7-Dihydroxytryptamina va abolir la millora mediada per bPAC, confirmant la implicació de la via serotoninèrgica en la recuperació. En resum, la investigació ha proporcionat coneixements sobre els canvis transcripcionals que tenen lloc a la llarga de la progressió de la LM i després del trasplantament de CPN, amb un èmfasi especial en la senyalització d'AMPc. La manipulació optogenètica d'AMPc a les neurones corticoespinals després de la LM ha demostrat ser efectiva per a la recuperació funcional i ha permès descobrir una ruta cortical alternativa a través del tracte descendent serotoninèrg / [EN] Traumatic spinal cord injury (SCI) refers to a neurological condition in which a mechanic insult disrupts the proper communication of the impulses through the central nervous system (CNS), resulting on the loss of locomotor function below the injured area. Unfortunately, nowadays there is still no effective cure to completely restore the functionality of the spinal cord after the injury. Cell therapy is the most recurring approach for SCI treatment. In the past decades several cell-based strategies have been explored, being one of the most promising the transplantation of neural progenitor cells (NPCs). Many pre-clinical studies evidenced the potential of the NPCs transplantation to provide a substantial motor recovery in animal models, yet functional improvements in clinical trials have been limited. Therefore, efforts still need to be made in disclosing the precise cascade of molecular processes along SCI pathophysiology as well as the NPCs underlying mechanism. In that context, Chapter 1 of the present work aimed to provide a comprehensive characterization of the spinal transcriptional changes along the different temporal stages of rats suffering a severe contusive injury. Additionally, we have described the transcriptional impact of acute and subacute NPCs transplantation in injured animals. Interestingly we have shown that while SCI caused a strong dysregulation of several cAMP-signaling components (being EPAC2 the most downregulated gene), NPCs was able to restore SCI-derived alterations over this pathway with EPAC2 significant upregulation. In order to further explore EPAC2 role in NPCs-mediated therapeutical mechanism we performed a loss-of-function experiment by sustained EPAC2 inhibition via ESI-05 administration along with NPCs transplantation after SCI. Compared with only transplanted animals, NPCs+ESI-05 animals showed increased scar area, exacerbated microglia polarization into an inflammatory profile and widened gaps of preserved neurons across the lesion. Overall, these results suggest that NPC therapeutic mechanisms in the context of SCI involve an EPAC2-dependent mechanism, reducing neuroinflammation and providing a neuro-permissive environment. Chapter 2 aimed to further explore cAMP potential for SCI regeneration. We designed a novel strategy for artificial cAMP inductions in corticospinal neurons via optogenetic activation of a photoinducible adenylyl cyclase (bPAC). Daily optogenetic cAMP stimulation in rats suffering a thoracic dorsal hemisection, which completely disrupt the dorsal aspect of the corticospinal tract (CST), promoted and early and sustained locomotor recovery compared to non-treated control animals. We have shown that bPAC stimulation increased the number of retrograde traced neurons from the lumbar segment both in the motor cortex and the raphe-reticular formation, but not in the red nuclei. Moreover, immunolabelling of the raphespinal tract by 5-HT showed that bPAC stimulation increased the ratio of descending serotoninergic axons caudal to the injury which significantly correlated with improved functional parameters. Our results from corticobulbar projection study, WGA trans-synaptic tracing, and P-CREB analysis suggest that bPAC modulation of cortico-serotonergic pathway might occurs at the brainstem level. Lastly, the serotonergic system depletion by 5,7-Dihydroxytryptamine administration suppressed bPAC-mediated recovery, confirming the implication of the serotonergic tract in the recovery of stimulated animals. In summary, our research has provided new insights into the transcriptional changes that occur along SCI progression and after NPCs transplantation with a special emphasis on cAMP signaling. Optogenetic cAMP manipulation in corticospinal neurons after SCI has proven to be effective for functional recovery and allowed to unveil a cortical rerouting pathway through the serotonergic descending tract. / This research was funded by FEDER/Ministerio de Ciencia e Innovación – Agencia Estatal de Investigación [RTI2018-095872-BC21/ERDF]. Part of the equipment employed in this work was funded by Generalitat Valenciana and cofinanced with ERDF funds (OP ERDF of Comunitat Valenciana 2014– 2020) and the UE; Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER) incluido en el Programa Operativo FEDER de la Comunidad Valenciana 2014-2020. B. MartinezRojas was supported by a grant from the Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana and the European Social Fundation ACIF/2019/120. / Martínez Rojas, B. (2024). Transcriptional Insights for Spinal Cord Injury and Neural Precursor Cell Therapy: Toward a Novel Optogenetics-Based Treatment for cAMP Neuronal Induction [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202972

[ES] La capacidad de las células madre para proliferar formando distintas células especializadas les otorga la potencialidad de servir de base para terapias efectivas para patologías cuyo tratamiento era inimaginable hasta hace apenas dos décadas. Sin embargo, esta capacidad se encuentra mediada por estímulos fisiológicos, químicos, y eléctricos, específicos y complejos, que dificultan su traslación a la rutina clínica. Por ello, las células madre representan un campo de estudio en el que se invierten amplios esfuerzos por parte de la comunidad científica. En el ámbito de la regeneración nerviosa, para modular su desarrollo y diferenciación el tratamiento farmacológico, la electroestimulación, y la estimulación optogenética son técnicas que están consiguiendo prometedores resultados. Es por ello por lo que en la presente tesis se ha desarrollado un conjunto de sistemas electrónicos para permitir la aplicación combinada de estas técnicas in vitro, con perspectiva a su aplicación in vivo. Hemos diseñado una novedosa tecnología para la liberación eléctricamente controlada de fármacos. Esta tecnología está basada en nanopartículas de sílice mesoporosa y puertas moleculares de bipiridina-heparina. Las puertas moleculares son electroquímicamente reactivas, y encierran los fármacos en el interior de las nanopartículas, liberándolos ante un estímulo eléctrico. Hemos caracterizado esta tecnología, y la hemos validado mediante la liberación controlada de rodamina en cultivos celulares de HeLa. Para la combinación de liberación controlada de fármacos y electroestimulación hemos desarrollado dispositivos que permiten aplicar los estímulos eléctricos de forma configurable desde una interfaz gráfica de usuario. Además, hemos diseñado un módulo de expansión que permite multiplexar las señales eléctricas a diferentes cultivos celulares. Además, hemos diseñado un dispositivo de estimulación optogenética. Este tipo de estimulación consiste en la modificación genética de las células para que sean sensibles a la radiación lumínica de determinada longitud de onda. En el ámbito de la regeneración de tejido mediante células precursoras neurales, es de interés poder inducir ondas de calcio, favoreciendo su diferenciación en neuronas y la formación de circuitos sinápticos. El dispositivo diseñado permite obtener imágenes en tiempo real mediante microscopía confocal de las respuestas transitorias de las células al ser irradiadas. El dispositivo se ha validado irradiando neuronas modificadas con luz pulsada de 100 ms. También hemos diseñado un dispositivo electrónico complementario de medida de irradiancia con el doble fin de permitir la calibración del equipo de irradiancia y medir la irradiancia en tiempo real durante los experimentos in vitro. Los resultados del uso de los bioactuadores en procesos complejos y dinámicos, como la regeneración de tejido nervioso, son limitados en lazo abierto. Uno de los principales aspectos analizados es el desarrollo de biosensores que permitiesen la cuantización de ciertas biomoléculas para ajustar la estimulación suministrada en tiempo real. Por ejemplo, la segregación de serotonina es una respuesta identificada en la elongación de células precursoras neurales, pero hay otras biomoléculas de interés para la implementación de un control en lazo cerrado. Entre las tecnologías en el estado del arte, los biosensores basados en transistores de efecto de campo (FET) funcionalizados con aptámeros son realmente prometedores para esta aplicación. Sin embargo, esta tecnología no permitía la medición simultánea de más de una biomolécula objetivo en un volumen reducido debido a las interferencias entre los distintos FETs, cuyos terminales se encuentran inmersos en la solución. Por ello, hemos desarrollado instrumentación electrónica capaz de medir simultáneamente varios de estos biosensores, y la hemos validado mediante la medición simultánea de pH y la detección preliminar de serotonina y glutamato. / [CA] La capacitat de les cèl·lules mare per a proliferar formant diferents cèl·lules especialitzades els atorga la potencialitat de servir de base per a teràpies efectives per a patologies el tractament de les quals era inimaginable fins fa a penes dues dècades. No obstant això, aquesta capacitat es troba mediada per estímuls fisiològics, químics, i elèctrics, específics i complexos, que dificulten la seua translació a la rutina clínica. Per això, les cèl·lules mare representen un camp d'estudi en el qual s'inverteixen amplis esforços per part de la comunitat científica. En l'àmbit de la regeneració nerviosa, per a modular el seu desenvolupament i diferenciació el tractament farmacològic, l'electroestimulació, i l'estimulació optogenética són tècniques que estan aconseguint prometedors resultats. És per això que en la present tesi s'ha desenvolupat un conjunt de sistemes electrònics per a permetre l'aplicació combinada d'aquestes tècniques in vitro, amb perspectiva a la seua aplicació in vivo. Hem dissenyat una nova tecnologia per a l'alliberament elèctricament controlat de fàrmacs. Aquesta tecnologia està basada en nanopartícules de sílice mesoporosa i portes moleculars de bipiridina-heparina. Les portes moleculars són electroquímicament reactives, i tanquen els fàrmacs a l'interior de les nanopartícules, alliberant-los davant un estímul elèctric. Hem caracteritzat aquesta tecnologia, i l'hem validada mitjançant l'alliberament controlat de rodamina en cultius cel·lulars de HeLa. Per a la combinació d'alliberament controlat de fàrmacs i electroestimulació hem desenvolupat dispositius que permeten aplicar els estímuls elèctrics de manera configurable des d'una interfície gràfica d'usuari. A més, hem dissenyat un mòdul d'expansió que permet multiplexar els senyals elèctrics a diferents cultius cel·lulars. A més, hem dissenyat un dispositiu d'estimulació optogenètica. Aquest tipus d'estimulació consisteix en la modificació genètica de les cèl·lules perquè siguen sensibles a la radiació lumínica de determinada longitud d'ona. En l'àmbit de la regeneració de teixit mitjançant cèl·lules precursores neurals, és d'interés poder induir ones de calci, afavorint la seua diferenciació en neurones i la formació de circuits sinàptics. El dispositiu dissenyat permet obtindré imatges en temps real mitjançant microscòpia confocal de les respostes transitòries de les cèl·lules en ser irradiades. El dispositiu s'ha validat irradiant neurones modificades amb llum polsada de 100 ms. També hem dissenyat un dispositiu electrònic complementari de mesura d'irradiància amb el doble fi de permetre el calibratge de l'equip d'irradiància i mesurar la irradiància en temps real durant els experiments in vitro. Els resultats de l'ús dels bioactuadors en processos complexos i dinàmics, com la regeneració de teixit nerviós, són limitats en llaç obert. Un dels principals aspectes analitzats és el desenvolupament de biosensors que permeteren la quantització de certes biomolècules per a ajustar l'estimulació subministrada en temps real. Per exemple, la segregació de serotonina és una resposta identificada amb l'elongació de les cèl·lules precursores neurals, però hi ha altres biomolècules d'interés per a la implementació d'un control en llaç tancat. Entre les tecnologies en l'estat de l'art, els biosensors basats en transistors d'efecte de camp (FET) funcionalitzats amb aptàmers són realment prometedors per a aquesta aplicació. No obstant això, aquesta tecnologia no permetia el mesurament simultani de més d'una biomolècula objectiu en un volum reduït a causa de les interferències entre els diferents FETs, els terminals dels quals es troben immersos en la solució. Per això, hem desenvolupat instrumentació electrònica capaç de mesurar simultàniament diversos d'aquests biosensors i els hem validat amb mesurament simultani del pH i la detecció preliminar de serotonina i glutamat. / [EN] The stem cells' ability to proliferate to form different specialized cells gives them the potential to serve as the basis for effective therapies for pathologies whose treatment was unimaginable until just two decades ago. However, this capacity is mediated by specific and complex physiological, chemical, and electrical stimuli that complicate their translation to clinical routine. For this reason, stem cells represent a field of study in which the scientific community is investing a great deal of effort. In the field of nerve regeneration, to modulate their development and differentiation, pharmacological treatment, electrostimulation, and optogenetic stimulation are techniques that are achieving promising results. For this reason, we have developed a set of electronic systems to allow the combined application of these techniques in vitro, with a view to their application in vivo. We have designed a novel technology for the electrically controlled release of drugs. This technology is based on mesoporous silica nanoparticles and bipyridine-heparin molecular gates. The molecular gates are electrochemically reactive and entrap the drugs inside the nanoparticles, releasing them upon electrical stimulus. We have characterized this technology and validated it by controlled release of rhodamine in HeLa cell cultures. For combining electrostimulation and controlled drug release we have developed devices that allow applying the different electrical stimuli in a configurable way from a graphical user interface. In addition, we have designed an expansion module that allows multiplexing electrical signals to different cell cultures. In addition, we have designed an optogenetic stimulation device. This type of stimulation consists of genetically modifying cells to make them sensitive to light radiation of a specific wavelength. In tissue regeneration using neural precursor cells, it is interesting to be able to induce calcium waves, favoring the cell differentiation into neurons and the formation of synaptic circuits. The designed device enable the obtention of real-time images through confocal microscopy of the transient responses of cells upon irradiation. The device has been validated by irradiating modified neurons with 100 ms pulsed light stimulation. We have also designed a complementary electronic irradiance measurement device to allow calibration of the irradiator equipment and measuring irradiance in real time during in vitro experiments. The results of using bioactuators in complex and dynamic processes, such as nerve tissue regeneration, are limited in an open loop. One of the main aspects analyzed is the development of biosensors that would allow quantifying of specific biomolecules to adjust the stimulation provided in real time. For instance, serotonin secretion is an identified response of neural precursor cells elongation, among other biomolecules of interest for the implementation of a closed-loop control. Among the state-of-the-art technologies, biosensors based on field effect transistors (FETs) functionalized with aptamers are promising for this application. However, this technology did not allow the simultaneous measurement of more than one target biomolecule in a small volume due to interferences between the different FETs, whose terminals are immersed in the solution. This is why we have developed electronic instrumentation capable of simultaneously measuring several of these biosensors, and we have validated it with the simultaneous pH measurement and the preliminary detection of serotonin and glutamate. / Monreal Trigo, J. (2023). Electronic Devices for the Combination of Electrically Controlled Drug Release, Electrostimulation, and Optogenetic Stimulation for Nerve Tissue Regeneration [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/193841

[ES] Esta tesis doctoral se enfoca en la creación y validación de sistemas optoelectrónicos para aplicaciones biomédicas, en concreto para la terapia fototérmica contra el cáncer de piel y la optogenética para la regeneración de tejido nervioso. En su transcurso, se ha desarrollado un conjunto de herramientas y dispositivos que abarcan desde la experimentación sobre cultivos celulares hasta modelos computacionales que simulan el tratamiento. Para la terapia fototérmica, se ha diseñado y construido un equipo de experimentación in vitro validado sobre cultivos celulares. Este dispositivo, equipado con funcionalidades para controlar la potencia del láser, gestionar los tiempos de irradiación, realizar un posicionamiento automático de varias muestras bajo el haz, y monitorizar la evolución de la temperatura, se presenta como una herramienta altamente beneficiosa para la investigación en esta área. Después, se exploró la simulación mediante el Método de Elementos Finitos para analizar el comportamiento de las nanopartículas y sus suspensiones en agua, arrojando luz sobre sus potenciales aplicaciones en terapias fototérmicas y campos relacionados. Gracias al aprendizaje obtenido en los primeros pasos de este estudio, se logró el desarrollo de dos nuevos equipos que habilitan la realización de experimentos in vivo. Además, se ha implementado un modelo computacional diseñado para investigar el impacto de la terapia fototérmica en tejido biológico. Por último, se desarrolló un dispositivo optoelectrónico de reducidas dimensiones y alta potencia para la estimulación optogenética de neuronas modificadas genéticamente, con el objetivo de observar el transitorio de la estimulación y así entender en mayor medida las posibilidades que ofrece la optogenética en el campo de la regeneración de tejidos. / [CA] Aquesta tesi doctoral es centra en la creació i validació de sistemes optoelectrònics per a aplicacions biomèdiques, específicament per a la teràpia fototèrmica contra el càncer de pell i l'optogenètica per a la regeneració del teixit nerviós. Durant el seu desenvolupament, s'han dut a terme un conjunt d'eines i dispositius, des de l'experimentació en cultius cel·lulars fins a models computacionals que simulen el tractament. Per a la teràpia fototèrmica, s'ha dissenyat i construït un dispositiu de experimentació in vitro validat en cultius cel·lulars. Aquest dispositiu, equipat amb funcionalitats per controlar la potència del làser, gestionar els temps d'irradiació, realitzar un posicionament automàtic de diverses mostres sota el feix i monitoritzar l'evolució de la temperatura, es presenta com una eina altament beneficiosa per a la recerca en aquest àmbit. A continuació, s'ha explorat la simulació mitjançant el Mètode d'Elements Finits per analitzar el comportament de les nanopartícules i les seves suspensions en aigua, aportant llum a les seves possibles aplicacions en teràpies fototèrmiques i camps relacionats. Gràcies al coneixement adquirit en les primeres etapes d'aquest estudi, s'ha aconseguit el desenvolupament de dos nous dispositius que possibiliten realitzar experiments in vivo. A més, s'ha implementat un model computacional dissenyat per investigar l'impacte de la teràpia fototèrmica en teixit biològic. Finalment, s'ha desenvolupat un dispositiu optoelectrònic de reduïdes dimensions i alta potència per a l'estimulació optogenètica de neurones modificades genèticament, amb l'objectiu d'observar la estimulació transitoria i comprendre millor les possibilitats que ofereix l'optogenètica en el camp de la regeneració de teixits. / [EN] This doctoral thesis focuses on the creation and validation of optoelectronic systems for biomedical applications, specifically for photothermal therapy against skin cancer and optogenetics for nerve tissue regeneration. During its course, a set of tools and devices has been developed, ranging from experimentation on cell cultures to computational models simulating the treatment. For photothermal therapy, an in vitro device has been designed and constructed for experimentation in cell cultures. This device, equipped with functionalities to control laser power, manage irradiation times, perform automatic positioning of multiple samples under the beam, and monitor temperature evolution, emerges as a highly beneficial tool for research in this area. Next, simulation using the Finite Element Method was explored to analyze the behavior of nanoparticles and their suspensions in water, shedding light on their potential applications in photothermal therapies and related fields. Thanks to the knowledge gained in the early stages of this study, the development of two new devices enabling in vivo experiments was achieved. Furthermore, a computational model designed to investigate the impact of photothermal therapy on biological tissue has been implemented. Finally, a compact, high-power optoelectronic device was developed for the optogenetic stimulation of genetically modified neurons, with the aim of observing the stimulation transient and gaining a better understanding of the possibilities that optogenetics offers in the field of tissue regeneration. / El material y las instalaciones utilizados en el desarrollo de este trabajo fueron financiados por las ayudas PID2021-126304OB-C44 y PID2021-124359OB-I00 de MCIN/AEI/10.13039/5011000110-33, el programa H2020 FetOpen con el proyecto número 964562, la ayuda de la Conselleria de Educación, Investigación, Cultura y Deporte de la Generalitat Valenciana CIPROM/2021/007 y el proyecto PROMETEO 2018/024, la Fundación Social Europea ACIF/2019/120, y el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades con las becas doctorales FPU17/03239 y FPU17/03800. El trabajo ha recibido también financiación de la Agencia Estatal de Investigación con los proyectos números RTI2018-100910-B-C41, RTI2018-100910-B-C43-AR y PID2021-126304OB-C41, el Instituto de Salud Carlos III - CIBER-BBN: Safe N Medtech and Smart-4-Fabry Projects (asociado a los programas europeos del marco H2020 (H2020/2014-2020) con la ayuda número 814607) y el Ministerio de Ciencia e Innovación con las beca predoctorales FPU17/03800 y FPU17/03239 / Terrés Haro, JM. (2023). Sistemas optoelectrónicos para terapias fototérmicas dirigidas al cáncer de piel y optogenética en la regeneración de tejido nervioso [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/202285