The KIL gene of vaccinia virus encodes for a host range protein; in the absence of which, the virus is unable to grow in certain cell lines (RK-13 and some human cell lines). KIL function can be complemented in RK-13 cells by the cowpox host range gene product CP77 despite a lack of homology between the two proteins except for ankyrin repeats. We investigated the role of ankyrin repeats ofthe K1L gene in the host-range restriction of growth in RK-13 cells. The growth of a recombinant vaccinia virus, with the K1L gene mutated in the most conserved ankyrin repeat, was severely impaired as evidenced by lack of plaque formation and reduction in viral titers. Infection of RK-I3 cells with the mutant recombinant vaccinia virus resulted in total shutdown of both cellular and viral protein synthesis early in infection, indicating that the host restriction mediated by the ankyrin repeat is due to a translational block. A comparison of the cellular localization of the K1L wild type and mutated forms showed no difference, as both localized exclusively in the cytoplasm of RK-I3 cells. We also investigated the interaction of the vaccinia virus K1L protein with cellular proteins in RK-13 cells and co-immunoprecipitated a 90 kDa protein identified as the rabbit homologue of human ACAP2, a GTPase-activating protein with ankyrin repeats. Our result suggests the importance of ankyrin repeat for host-range function of K1L in RK-13 cells and identifies ACAP2 as a cellular protein which may be interacting with K1L.

No description available.

Vaccinia virus (VACV) is the most intensively studied orthopoxvirus and acts as an excellent model to investigate host-pathogen interactions. VACV encodes about 200 proteins, many of which modulate the immune response. This study focusses on two of these: C16 and C4, that share 43.7 % amino acid identity. Given the sequence similarity, we explored whether C16 and C4 have any shared functions, whilst also searching for novel functions. To gain mechanistic insight, we sought to identify binding partners and determine the residues responsible. C16 has two reported functions. Firstly, it inhibits DNA-PK-mediated DNA sensing, and this study found that C4 can perform this function as well. Like C16, C4 associates with the Ku heterodimer to block its binding to DNA leading to reduced production of cytokines and chemokines. For both proteins, the function localised to the C termini and was abrogated by mutating three residues. Secondly, C16 induces a hypoxic response by binding to PHD2. This function was mapped to the N-terminal 156 residues and a full length C16 mutant (D70K,D82K) lost the ability to induce a hypoxic response. In contrast, C4 did not bind PHD2. C4 inhibits NF-κB signalling by an unknown mechanism. Reporter gene assays showed that C16 also suppresses NF-κB activity and, intriguingly, this was carried out by both the N and C termini. C16 acts at or downstream of p65 and the N terminus of C16 associated with p65 independently of PHD2-binding. Conversely, C4 acted upstream of p65, did not display an interaction with p65, and the function was restricted to its C-terminal region. Novel binding partners were identified by a screen utilising tandem mass tagging and mass spectrometry, and selected hits were validated. The C terminus of C16 associated with VACV protein K1, a known NF-κB inhibitor. Additionally, C16 bound to the transcriptional regulator ARID4B. C4 did not interact with these proteins, but the N-terminal region of C4 associated with filamins A and B. The functional consequences of these interactions remain to be determined. In vivo, C4 and C16 share some redundancy in that a double deletion virus exhibits an attenuated virulence phenotype that is not observed by single deletion viruses in the intradermal model of infection. However, non-redundant functions also contribute to virulence in that both single deletion viruses display attenuated virulence compared to a wild-type Western Reserve virus in the intranasal model of infection. Data presented also reveal that C4 inhibits the recruitment of immune cells to the site of infection, as was previously described for C16. Overall, this investigation highlights the complexity of host-pathogen interactions showing that VACV encodes two multifunctional proteins with both shared and unique functions. Moreover, their inhibition of DNA-PK emphasises the importance of this PRR as a DNA sensor in vivo.

Einleitung Die Kuhpockenvirusinfektion (CPXV-Infektion) ist eine sporadisch auftretende, meldepflichtige Erkrankung mit zoonotischem Potenzial. Sie wurde in den letzten sechs Jahrzehnten in vielen Säugetierspezies inkl. des Menschen beschrieben und erforscht. Sie äußert sich in zwei Verlaufsformen: mild, lokalisiert, selbstlimitierend oder generalisiert, dramatisch bis letal. Als Erregerreservoir dienen dem Virus wildlebende Nager (Wühlmäuse). Aktuell ist für diese Infektion keine kausale Therapie zugelassen, Prävention kann mittels prophylaktischer Impfung mit dem Modifizierten Vaccinia Virus Ankara (MVA)-Impfstoff erzielt werden. Für Neuweltkameliden wurde die CPXV-Infektion bisher nur dreimal beschrieben. Detaillierte Erkenntnisse zur Epidemiologie, klinischem Erscheinungsbild und Prävention dieser Infektion bei Neuweltkameliden fehlen. Vier unabhängige Cluster von CPXV-Infektion in ostdeutschen Alpakabeständen in nur fünf Jahren, bekannt geworden durch fünf Alpakas mit generalisierter CPXV-Infektion mit jeweils letalem Ausgang als Patienten der Klinik für Klauentiere Leipzig, gaben Anlass, die Infektion bei dieser Spezies genauer zu untersuchen. Ziele der Untersuchungen Ziel der Studie war, auf Basis einer Literaturrecherche einen Überblick über das Wesen der CPXV-Infektion und ihre Relevanz bei Neuweltkameliden zu gewinnen. Anhand von Bestandsuntersuchungen in vier Alpakabeständen sollten Informationen zur Epidemiologie der CPXV-Infektion mit Erregernachweis im Einzeltier, Erregerverbreitung in der Herde und Erregerreservoir gesammelt werden. Ebenso wurde in zwei der vier Alpakabestände eine Bestandsimpfung mit dem MVA-Impfstoff durchgeführt, um die Verträglichkeit und die Immunogenität dieses Impfstoffes beim Alpaka zu überprüfen. Tiere, Material und Methoden Vier Alpakabestände (107 Alpakas) wurden zweimal im Abstand von 19 – 54 Tagen besucht. Anhand der klinischen Untersuchung und verschiedener Proben (Blut, Tupferproben, Krusten von Hautläsionen, Kot) wurden CPXV-infizierte Tiere identifiziert. Wildlebende Nager als potenzielles Erregerreservoir wurden in der Umgebung der Bestände gefangen. Ein indirekter Immunfluoreszenztest (IFA) wurde zum Nachweis CPXV-spezifischer Antikörper aus dem Serum (Alpakas) bzw. Serum/Transsudat (Nager) eingesetzt, eine real-time PCR diente zum Nachweis von CPXV-spezifischer DNA aus Kot/Tupferproben/Krusten (Alpakas) bzw. Organproben (Nager). In zwei Alpakabeständen wurden 94 Tiere mit dem MVA-Impfstoff zweimal im Abstand von vier Wochen geimpft. Eine Ausnahmegenehmigung nach §17c Abs. 4 Nr. 2 Buchstabe a) des Tierseuchengesetzes vom 22. Juni 2004 (BGBl.I S. 1260) lag für beide Bestände vor. Vier Wochen nach jeder Impfung und 6 bzw. 12 Monate nach der 2. Impfung wurden von allen Tieren Serum (für IFA) und Tupferproben (für PCR) entnommen. Etwaige Impfreaktionen wurden vier Wochen nach jeder Impfung aufgezeichnet. Bei 14 Crias wurde 2 – 12 Wochen post partum eine Serumprobe auf spezifische maternale Antikörper untersucht. Ergebnisse Insgesamt wurden 28 von 107 Tieren mittels IFA und/oder PCR als CPXV-infiziert identifiziert. Die Seroprävalenz pro Bestand schwankte zwischen 16,1 % und 81,2 %. Auch beim Alpaka traten zwei klinische Verlaufsformen auf: mild, lokalisiert, selbstlimitierend vs. generalisiert, letal. In zwei Beständen wurden CPXV-spezifische Antikörper in den gefangenen Nagern gefunden. Im dritten Bestand konnte CPXV aus einer Feldmaus (Microtus arvalis) isoliert werden. Vollgenomsequenzierung dieses Isolates und der Vergleich mit dem Genom von CPXV aus einem Alpaka des gleichen Bestandes ergaben 99,997 % Übereinstimmung. In diesem Bestand wurde CPXV an einer Bürste zur Fellpflege nachgewiesen, die Erregerübertragung durch indirekten Tierkontakt und tierbezogene Utensilien erscheint bei Alpakas am wahrscheinlichsten. Die MVA-Impfung war auch bei Alpakas sicher und gut verträglich. Nach zweimaliger Grundimmunisierung konnte eine Antikörper-Seroprävalenz pro Bestand von 81,3 % bzw. 91,7 % nachgewiesen werden. Im Laufe eines Jahres sank diese auf 15,6 % bzw. 45,8 %, Neuerkrankungen wurden nicht detektiert. In 50,0 % der beprobten Crias wurden maternale Antikörper nachgewiesen. Schlussfolgerungen Das ubiquitäre Erregerreservoir Wühlmaus in Verbindung mit an Popularität zunehmenden Alpakas, als vollempfängliche Spezies für CPXV weisen auf ein gesteigertes Risiko für zukünftige zoonotische CPXV-Infektionen hin. Die MVA-Impfung schützt Alpakas erfolgreich vor einer generalisierten CPXV-Infektion. Die Dauer des Impfschutzes und geeignete Auffrischungs-Impfregime gilt es in Langzeitstudien zu erforschen.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung / Introduction Cowpox virus (CPXV) infection is a reportable and potentially zoonotic disease that occurs sporadically in a variety of animals and in humans. It has been extensively researched and described in both domestic and zoo animals as well as in humans. Although infected individuals generally have a mild form of disease, cases of fatal generalized CPXV infection have also been described. Prevention by prophylactic vaccination using modified vaccinia virus Ankara (MVA) vaccine is the only method of protecting animals against disease. CPXV infection has been described in South American camelids, but data on its epidemiology, clinical features and prevention are lacking. Four CPXV outbreaks occurred in unrelated alpaca herds in Eastern Germany in a five-year period. The diagnosis in those herds was based on five cases with severe, generalized and lethal CPXV infection referred to the Department for Ruminants and Swine in Leipzig. The outbreaks provided us with an opportunity to better understand CPXV-infection in this species. Aims of the study The first aim of the study was to conduct a literature review of the clinical features of CPXV infection in South American Camelids and to compare their clinical signs with those of other animal species. The second goal was to evaluate the epidemiology of CPXV infection in four alpaca herds by evaluating the mode of virus transmission and the occurrence of CPXV in individual alpacas and in putative reservoir hosts. The third goal was to determine the safety and immunogenicity of MVA vaccine in alpacas by using in a prime-boost MVA vaccination regimen in two alpaca herds. Material and methods Four alpaca herds (107 animals) were evaluated on two separate occasions, and samples (serum, swab samples, crusts of suspicious pox lesions, feces) were collected to identify CPXV-infected animals. Wild small mammals were trapped on the alpaca farms to investigate the potential source of infection. Serum (alpacas, rodents) and/or transudate (rodents) samples were used to detect CPXV-specific antibodies using an indirect immunofluorescence assay (IFA). Swab samples, crusts and feces (alpacas) or organ tissue (rodents) were used for the detection of CPXV-specific DNA in a real-time PCR. A total of 94 animals from two alpaca herds were vaccinated twice with MVA vaccine. A special exemption was obtained from the relevant Ministries of the Federal States under German law. Blood samples (serum, IFA) and swab samples (PCR) were collected 4 weeks after prime and boost vaccination as well as 6 and 12 months after boost vaccination. In 14 crias, 1 blood sample was collected 2 – 12 weeks after birth to determine the presence of specific maternal antibodies (serum, IFA). Results A total of 28 of 107 animals were diagnosed with CPXV using IFA and/or PCR. Herd seroprevalence ranged from 16.1% to 81.2%. The clinical signs in infected animals were mostly mild, localized and self-limiting, but 5 animals had generalized signs and died. In two herds, CPXV-specific antibodies were found in the local rodent population. In the third herd, CPXV was isolated from a common vole (Microtus arvalis); full genome sequencing and comparison with the genome of CPXV from an alpaca on the same farm revealed a 99.997% match. Virus transmission through indirect contact seems likely because CPXV-specific DNA was detected on a brush used for grooming. MVA vaccine was well tolerated and safe in vaccinated alpacas. Seroprevalence after booster vaccination was 81.3% in one herd and 91.7% in the other. Detectable antibody titers declined to 15.6% and 45.8% over a 12-month period after booster vaccination. New CPXV infections were not detected in this period. Specific maternal antibodies were detected in 50.0% of newborn crias. Conclusions With the recent increase in their popularity, alpacas may pose an increased risk of zoonotic disease spread because of their susceptibility to CPXV infection and their relatively close proximity to reservoir hosts such as rodents. Prevention of generalized CPXV infection in alpacas using MVA vaccine appears feasible. The duration of immunity and appropriate booster vaccination regimens need to be verified in long-term studies.:Inhalt 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Das Alpaka 2.1.1 Zoologische Einordnung, Herkunft, Nutzung 2.1.2 Haltung 2.1.3 Viruserkrankungen bei Neuweltkameliden in Europa 2.2 Die Kuhpockenvirusinfektion 2.2.1 Ätiologie 2.2.2 Wirtsspektrum und Erregerreservoir 2.2.3 Diagnostik 2.2.4 Klinisches Erscheinungsbild 2.2.5 Differentialdiagnosen 2.2.6 Therapie/Prophylaxe 2.3 Der MVA-Impfstoff 2.4 Schlussfolgerung aus der Literaturrecherche und Zielstellung 3 Publikation 1 4 Publikation 2 5 Publikation 3 6 Diskussion 7 Zusammenfassung 8 Summary 9 Literaturverzeichnis 10 Danksagung