Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-20T18:14:03Z No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:48:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:49:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:49:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseCAB.pdf: 11456750 bytes, checksum: 7ab706a3e4cc604844c73a7452eece9a (MD5) Previous issue date: 2015-11-25 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Peroxiredoxins (Prx) are antioxidant proteins capable of decomposing a variety of hydroperoxide are very abundant in the cell and in eukaryotes are distributed in many cell compartments. The Prx are able to reduce their substrates using a highly reactive cysteine residue, named peroxidatic cysteine (CP-S-), which is maintained in the thiolate form as a consequence of the active site environment. In hydroperoxide decomposition process the CP is oxidized to cysteine sulfenic acid (CP-SOH). These vast majorities of these proteins are obligate dimers and has a second cysteine involved in the catalytic cycle, named resolution cysteine (CR), which forms a disulfide with CP and is often reduced by the enzyme thioredoxin (Trx). In addition to the reduction of Prx, the Trx are involved in several other biological processes such as cell growth, inhibition of apoptosis, transcriptional activation and DNA synthesis. When cell are exposed to oxidative stress, the CP can suffer overoxidation, forming species such as cysteine sulfinic acid (CP-SO2H) and cysteine sulfonic acid (CP-SO2H), which are not reduced by Trx. However, the CP overoxidation results in a change of the of Prx quaternary structure, resulting in the formation of high molecular weight structures (HMW) with molecular chaperone property and related to signal transduction triggered by hydroperoxides. Saccharomyces cerevisiae, have two isoforms of cytosolic Prx (Tsa1 and Tsa2), which shares high similarity (86% identity and 96% similarity), but differ in cellular abundance and expression levels. However, these enzymes are often considered redundant proteins. This study aimed the comparative analysis searching for functional and structural differences between Tsa1 and Tsa2. We evaluated Tsa1 and Tsa2 relationships with its oxidizing (hydroperoxide) and reducing substrates (Trx1 and Trx2). We also performed structural and kinetic analysis showed a significant relationship between maintaining the decameric structure the activity of enzymes which occurs by a series polar interactions but not equal to the active site amino acids. Highlighting the Thr44 of Tsa1 (Ser in Tsa2) which is involved in decamer structure stabilization by a CH-π interaction type with the Tyr77 and through the Oγ atom (from Thr) polar interactions with Phe45 and Leu41. Overoxidation susceptibility assays were performed using Tsa1 and Tsa2, and our results revealed that organic hydroperoxides were able to promote the CP overoxidation more efficiently when compared to H2O2. In turn, Tsa2 was very more resistant to CP overoxidation than Tsa1. This difference was also investigated concerning the catalytic triad Thr (Tsa1) to Ser (Tsa2). We generated mutants carrying reciprocal substitutions Tsa1T44S and Tsa2S44T and our results revealed that Tsa1T44S become more resistant to CP overoxidation and Tsa2S44T become more sensitive. The formation of high molecular weight structures (HMW) of Tsa1, Tsa2 and mutants were also investigated by size exclusion chromatography (SEC) and transmission electron microscopy (TEM). The Tsa1, Tsa2 and mutants HMW formation were analyzed by size exclusion chromatograph (SEC) and transmission electron microscopy (TEM). The results showed an increase of HMW formation after Trx system reaction using high concentrations of CHP. Were observed the stacking of the ring-shaped structures besides spherical species. Our results demonstrate that Tsa1 and Tsa2 proteins differ significantly in overoxidation susceptibility and HMW complex formation, indicating that these proteins have not redundant biological roles and small changes in active site promote high functional and structural changes in these enzymes. / Peroxirredoxinas (Prx) são proteínas antioxidantes capazes de decompor uma grande variedade de hidroperóxidos, são muito abundantes na célula e em eucariotos estão distribuídas nos diversos compartimentos celulares. As Prx são capazes de reduzir seus substratos utilizando um resíduo de cisteína altamente reativa, denominada de cisteína peroxidásica (CP-S-), que se apresenta na forma de tiolato. No processo de decomposição de hidroperóxidos é oxidada a cisteína ácido sulfênico (CP-SOH). A grande maioria destas proteínas se apresenta como dímeros obrigatórios e apesar de algumas Prx apresentarem somente uma cisteína, grande parcela possui uma segunda cisteína envolvida no ciclo catalítico que recebe o nome de cisteína de resolução (CR), a qual forma um dissulfeto com CP, que frequentemente é reduzido pela enzima tiorredoxina (Trx). Adicionalmente à redução das Prx, as Trx estão envolvidas em diversos outros processos biológicos como crescimento celular, inibição de apoptose, ativação de transcrição e síntese de DNA. Quando a célula é exposta a elevado estresse oxidativo, pode ocorrer a superoxidação de CP formando espécies superoxidadas como a cisteína ácido sulfínico (CP-SO2H) e sulfônico (CPSO3H) que não podem ser reduzidas por Trx. Entretanto, também resulta na alteração da estrutura quaternária das Prx, levando à formação de estruturas de alto peso molecular (HMW) que possuem propriedade de chaperona molecular e estão relacionadas a transdução de sinal desencadeada por hidroperóxidos. Em Saccharomyces cerevisiae, há duas isoformas citosólicas de Prx (Tsa1 e Tsa2), que possuem grande semelhança (86% de identidade e 96% de similaridade), mas apresentam diferenças na concentração celular e nível de expressão. Entretanto, muitas vezes são consideradas proteínas redundantes. Este trabalho teve como objetivos uma análise comparativa aprofundada buscando um maior entendimento das diferenças funcionais e estruturais de Tsa1 e Tsa2. Foram avaliados a relação de Tsa1 e Tsa2 com seus substratos oxidantes (hidroperóxidos) e substratos redutores (Trx1 e Trx2). Análises estruturais e cinéticas demonstraram uma importante relação entre a manutenção da estrutura decamérica a atividade das enzimas a qual ocorre por uma serie interações polares similares mas não iguais entre aminoácidos do sítio ativo. Com destaque para a Thr44 de Tsa1 (Ser em Tsa2) que possui importância na estabilização da estrutura decamérica através de uma interação do tipo C-H-π com Tyr77 e através do átomo de O que possui interações polares com Phe45 e Leu41. Também foram realizadas análises de susceptibilidade a superoxidação de Tsa1 e Tsa2, e demonstrou-se que peróxidos orgânicos são capazes de promover mais eficientemente a superoxidação quando comparados a H2O2, sendo que Tsa1 apresenta uma maior sensibilidade a superoxidação. Essa diferença foi também relacionada à substituição Thr/Ser e análises de susceptibilidade a superoxidação dos mutantes Tsa1T44S e Tsa2S44T demonstraram que a substituição reciproca tornou Tsa1T44S mais resistente a superoxidação e Tsa2S44T mais sensível. A formação de estruturas de alto peso molecular (HMW) de Tsa1, Tsa2 e mutantes foram investigadas através de cromatografia de exclusão molecular (SEC) e microscopia eletrônica de transmissão (TEM). Os resultados demonstraram um aumento da formação de HMW após reações de superoxidação utilizando o sistema Trx em altas concentrações de CHP e foi verificada a presença de empilhamentos de decâmeros, além de esferas, descritas na literatura. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram de forma clara que as proteínas Tsa1 e Tsa2 diferem de forma significativa tanto na suscetibilidade a superoxidação quanto na formação de complexos HMW distintos, indicando fortemente que estas proteínas possuem papeis biológicos não redundantes e que alterações sutis de aminoácidos no sitio ativo promovem grandes alterações funcionais e estruturais nas enzimas.

Dans la nature, les plantes sont constamment exposées à des modifications de leur environnement générant un stress oxydant auquel elles doivent s’adapter du fait de leur immobilité. Les végétaux ont donc développé un grand nombre de mécanismes antioxydants permettant de protéger leurs fonctions vitales. L’étude d’une enzyme de type peroxyrédoxine (PRX) localisée dans le chloroplaste montre que son activité antioxydante est importante pour la croissance et la tolérance des végétaux aux contraintes environnementales. De plus, cette PRX pourrait interagir avec d’autres protéines impliquées notamment dans des mécanismes antioxydants et dans le métabolisme du carbone. Parmi elles, une protéine de type fibrilline participant à la protection des structures photosynthétiques, pourrait avec la PRX protéger la photosynthèse, fonction propre aux végétaux et essentielle pour la vie sur terre. / In nature, plants are constantly exposed to environmental changes leading to oxidative stress, to which they must adapt due to their immobility. Plants have developed many antioxidant systems allowing them to maintain their vital functions. The study of a peroxiredoxin, enzyme (PRX) localized in chloroplasts, shows that its direct antioxidant activity is essential for growth and tolerance of plants to environmental constraints. In addition, this PRX could interact with other proteins especially involved in antioxidant mechanisms and carbon metabolism. Among them, fibrillin proteins, which participate in the protection of the photosynthetic structures, could preserve with the PRX the plant photosynthesis, which is essential for the life on earth.