Dissertation--Juristische Fakultät--Göttingen--Georg-August-Universität, 2003. / Bibliogr. p. 280-314.

La coqueluche est une maladie respiratoire aiguë, causée par la bactérie à Gram négatif Bordetella pertussis. L’hémagglutinine filamenteuse (FHA) est une adhésine responsable de la colonisation du tractus respiratoire de l’hôte, ainsi qu’un antigène vaccinal important. La FHA est transportée à la surface de la bactérie par une protéine de membrane externe, FhaC, selon la voie de sécrétion à deux partenaires (voie TPS). Le couple FHA/FhaC sert de modèle aux systèmes TPS. FhaC fait également partie de la superfamille de transporteurs TpsB/Omp85 qui regroupe des protéines de la membrane externe des bactéries et de certains organites eucaryotes (dont les chloroplastes et mitochondries). La structure cristallographique de FhaC est la première à avoir été obtenue parmi les protéines de cette superfamille. Le tonneau β de FhaC est composé de 16 brins anti-parallèles, reliés par des boucles extracellulaires ou périplasmiques. Le canal formé par FhaC est obstrué par une hélice amino-terminale (H1) et une boucle de surface conservée dans la superfamille repliée à l’intérieur du tonneau (L6). Le domaine périplasmique de FhaC contient deux domaines « POTRA » (pour Polypeptide Transport Associated) en tandem. Ces domaines sont conservés dans la superfamille et seraient responsables d’interactions protéine-protéine. Mon travail de thèse a consisté à appréhender, à partir de la structure de FhaC, les mécanismes moléculaires de la sécrétion de la FHA. J’ai étudié le rôle d’une tétrade de résidus conservés dans la boucle L6, puis j’ai caractérisé les déterminants d’interaction présents dans les domaines POTRA de FhaC. Nos travaux ont montré que la tétrade conservée VRGY localisée à l’extrémité de L6 est impliquée dans la fonction de FhaC. Les substitutions de l’arginine et de la tyrosine en alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) ont montré que l’arginine était essentielle à la sécrétion de la FHA. De plus, la structure cristallographique de FhaC-R450A indique que la substitution ne perturbe pas la position de L6. L’analyse des propriétés du canal de ces deux variants reconstitués en bicouche lipidique montre en revanche une perturbation des canaux de FhaC-Y452A. Les substitutions n’altèrent pas l’étape de reconnaissance de FHA par FhaC. L’arginine serait donc impliquée dans une étape tardive de la sécrétion, alors que la tyrosine semble participer au positionnement de L6 ou à la régulation de sa mobilité au cours de la sécrétion et pourrait stabiliser FhaC « au repos ». J’ai également caractérisé les déterminants d’interaction des deux domaines POTRA de FhaC et montré que des résidus de l’extrémité de POTRA1 sont impliqués dans le recrutement de la FHA, probablement par interaction électrostatique. Deux sites majeurs d’interaction ont été identifiés dans des sillons hydrophobes des POTRA1 et 2, qui seraient compatibles avec l’hypothèse que les deux protéines interagissent par « beta augmentation ». L’étude du couple FHA/FhaC est un modèle pour la voie de sécrétion TPS. Nos résultats indiquent que les motifs structuraux conservés sont impliqués dans la fonction de la protéine et apportent des précisions sur les mécanismes moléculaires de la voie TPS et des transporteurs de la superfamille TpsB/Omp85. / Whooping cough is an acute respiratory disease caused by the Gram-negative bacterium Bordetella pertussis. The filamentous hemagglutinin (FHA) is an adhesin involved in colonization of the host’s respiratory tract, and a major vaccine antigen. FHA is transported to the cell surface by an outer membrane protein, FhaC by the two-partner secretion (TPS) pathway. The FHA/FhaC pair is a model for TPS systems. FhaC belongs to the TpsB/Omp85 superfamily whose members are found in the outer membranes of bacteria and organelles such as chloroplasts and mitochondria. The crystal structure of FhaC has been the first in this superfamily. The β barrel of FhaC is composed of 16 anti-parallel strands, linked by extracellular loops and periplasmic turns. The FhaC channel is blocked by an amino-terminal helix (H1) and a conserved extracellular loop (L6). The periplasmic domain of FhaC has two POTRA domains (“Polypeptide Transport Associated”) that are conserved in the TpsB/Omp85 superfamily and involved in protein-protein interactions. My PhD work aimed at investigating the molecular mechanisms of FHA secretion based on the FhaC structure. I analyzed the role of a conserved tetrad in the L6 loop, and I also characterized the determinants of interaction with FHA in the POTRA domains of FhaC. Our work has shown that the conserved VRGY tetrad of L6 is involved in FhaC’s function. Substitution of arginine and tyrosine by alanine (FhaC-R450A et FhaC-Y452A) indicated that the arginine residue is essential for FHA secretion. Moreover, the crystal structure of FhaC-R450A showed that the positioning of L6 is similar to that in the wild type protein. Channel analyses of both variants reconstituted in lipid bilayers indicated that the FhaC-Y452A channels are affected. Both substitutions have no effect on the recognition step in the periplasm. The arginine residue is thus most likely involved in a late step of FHA secretion, while the tyrosine residue might participate in the positioning of L6 positioning or the regulation of its mobility in the course of secretion; it could stabilize FhaC in its “resting state”. I also characterized the determinants of interaction with FHA of the POTRA domains of FhaC and showed that residues at the extremity of POTRA1 might be involved in FHA recruitment, probably by electrostatic interactions. Two major sites of interactions were identified in hydrophobic grooves in both POTRA1 and 2, which are in agreement with a model of interaction between the 2 proteins by “beta augmentation”. The FHA/FhaC pair is a model for the TPS pathway. Our results indicate that conserved structural motifs of FhaC are involved in the function of the protein and give new insights into the molecular mechanisms of the TPS pathway and of transporters of the TpsB/Omp85 superfamily.

La vaste majorité des plantes terrestres sont impliquées dans des interactions symbiotiques avec des champignons du sol. Ces interactions, appelées mycorhizes, jouent un rôle clé dans l’écologie des plantes en influençant plusieurs facettes de leur croissance ou de leur reproduction (e.g., nutrition, protection contre les pathogènes, activation du système immunitaire). Toutefois, nous connaissons encore très peu de choses sur l’assemblage des communautés mycorhiziennes en milieu naturel : existe-t-il de la spécificité entre certaines espèces de plantes et de champignons, ou ces associations sont-elles le fruit du hasard et des conditions locales seulement? Cette question pose un défi tant sur le plan fondamental, où nous cherchons à comprendre comment les mutualismes persistent évolutivement, que sur la plan appliqué, où nous aimerions connaître comment les écosystèmes naturels s’assemblent pour guider nos pratiques de restauration écologique. Ainsi, mon doctorat a gravité autour de cette question : quels sont les mécanismes responsables de l’assemblage des communautés mycorhiziennes? En d’autres termes, qu’est-ce qui détermine qu’une plante s’associera avec certains champignons, et ne s’associera pas avec d’autres, en milieu naturel. En premier lieu, j’ai approché cette question sur le plan théorique en utilisant la théorie des réseaux comme outil pour détecter les associations préférentielles entre plantes et champignons. J’ai aussi développé, pour prédire ces associations préférentielles, un cadre théorique basé sur les traits fonctionnels des organismes, en adaptant le triangle CSR de J.P. Grime. Finalement, j’ai pu tester mes hypothèses par des observations en milieu naturel et des expériences en milieu contrôlé. L’ensemble de mes travaux ont contribué à mettre en lumière deux éléments clés de l’assemblage des communautés mycorhiziennes. Premièrement, l’assemblage semble se faire de manière hiérarchique, où d’abord des contraintes neutres comme l’abondance et la distribution spatiale déterminent quelles espèces auront l’opportunité d’interagir entre elles et ensuite, une sélection déterministe des partenaires s’opère, où les ii plantes ayant des traits fonctionnels similaires tendent à interagir avec un pool similaire de champignons mycorhiziens. Deuxièmement, bien qu’il semble y avoir de la sélection déterministe de partenaires, tant en milieu naturel qu’en milieu contrôlé, ce choix de partenaires demeure extrêmement flexible et dépend probablement des conditions locales et de phénomènes stochastiques (e.g., conditions du sol, luminosité, effets de priorité par les plantes voisines, etc.). Ces résultats permettent de mieux comprendre la spécificité dans la symbiose mycorhizienne. Ils suggèrent aussi que ces communautés symbiotiques seront fortement résilientes aux perturbations (e.g., extinction locale d’une espèce), car la spécificité dans le choix de partenaires que l’on observe sur le terrain ne semble pas résulter d’évènements de coévolution réciproque et de spécialisation.

Mémoire de master recherche 2e année : Droit du travail : Lille 2 : 2006. / Bibliogr. f. 148-158.

L'objectif des travaux relatés dans ce manuscrit est de proposer une méthodologie qui garantit une réduction du nombre de critères de sélection de partenaires à utiliser (donc de ressources à consommer), tout en permettant de choisir les critères les plus représentatifs pour l'utilisateur. L'ensemble des critères ainsi choisi par l'utilisateur à travers un paramètre de contrôle, n'influence pas le classement des partenaires potentiels ou s'il l'influence, celle-ci est maîtrisée et connue par l'utilisateur. La méthodologie s'appuie sur une structuration de critères faisant appel à la notion de distance causale ou sémantique. Pour ce faire, les algorithmes de " Dijkstra " et de Classification Ascendante Hiérarchique (CAH) ont été utilisés de manière successive. Cette démarche de structuration est appliquée à un ensemble de 101 critères de sélection. Les résultats sont interprétés afin d'en démontrer la portée dans le processus de recherche de partenaires.

SOX9 est un facteur de transcription à domaine HMG. Il est impliqué dans de multiples processus biologiques au cours du développement et de la vie adulte. En particulier, SOX9 joue un rôle important dans l'homéostasie de l'épithélium intestinal. Nous avons montré que SOX9, cible positive de la voie de signalisation oncogénique Wnt/(beta)-caténine, réprime l'expression de PKC(alpha). Cette répression implique un nouveau mécanisme d'action qui ne nécessite ni la fixation du domaine HMG à l'ADN ni le domaine de transactivation de SOX9. Nous avons également identifié MiniSOX9, un nouveau variant d'épissage de SOX9, résultant de la rétention du second intron. MiniSOX9 est fortement exprimé dans les tumeurs coliques. Il agit en tant que dominant négatif de SOX9, inhibiteur de l'expression du suppresseur de tumeurs PKC(alpha) et activateur de la voie de signalisation oncogénique Wnt/(beta)-caténine. Nos données suggèrent ainsi un rôle primordial de MiniSOX9 dans la tumorigenèse intestinale. Enfin, notre étude protéomique des partenaires de SOX9 et de MiniSOX9 permet d'ouvrir de nouvelles perspectives quant aux rôles de ces deux protéines dans l'homéostasie et la tumorigenèse intestinale / SOX9 is an HMG transcription factor involved in numerous biological processes during development and adult life. It plays an important role especially in the intestinal epithelium homeostasis. In the present study, we demonstrate that SOX9, a positive target of the oncogenic signaling pathway Wnt/(beta)-catenin, represses PKC(alpha) expression. This repression involves a new mechanism of action requiring neither HMG domain binding to DNA nor the transactivation domain of SOX9. We also report the discovery of MiniSOX9, a new SOX9 splice variant, resulting from the second intron retention. MiniSOX9 is highly expressed in colon tumors. It acts as a SOX9 dominant negative, as a repressor of the expression of the tumor suppressor PKC(alpha), and as an activator of the oncogenic signaling pathway Wnt/(beta)-catenin. Our data suggest a crucial role of MiniSOX9 in intestinal tumorigenesis. Finally, a proteomic analysis allowed us to identify potential new SOX9 and MiniSOX9 partners which will be useful to decipher the roles of these two proteins in intestinal homeostasis and tumorigenesis

Ets-1 est un facteur de transcription, membre de la famille Ets, possédant un domaine de liaison à l’ADN hautement conservé, qui permet de reconnaître un cœur consensus GGAA/T présent dans le promoteur de ses gènes cibles. Ce facteur régule des gènes impliqués dans divers processus physiologiques tels que le développement, l’hématopoïèse et l’angiogenèse ou pathologiques notamment dans la progression et l’invasion tumorale. Malgré les efforts engagés par la communauté scientifique ces dix dernières années, il y a peu de stratégies de ciblage thérapeutique d’Ets-1 qui peuvent être transposées dans un cadre clinique. Compte tenu du fait que ce facteur de transcription est un marqueur de mauvais pronostic pour de nombreux carcinomes, dont entre autres, ceux du sein, des poumons ou encore du colon, la mise en évidence d’une stratégie de ciblage de son activité pro-tumorale pourrait constituer une avancée majeure dans la lutte contre le cancer. Ets-1 n’agit pas seule au niveau de ses promoteurs cibles mais en coopération avec une variété de co-régulateurs transcriptionnels. De plus, ce facteur est ciblé par de nombreuses voies de transduction des signaux cellulaires. L’identification de nouveaux partenaires interagissant avec Ets-1 devrait donc nous permettre de mieux appréhender ses réseaux de régulation afin de mettre au point une stratégie de ciblage de son activité. Dans ce but, nous avons mis en œuvre un système de purification de partenaires basé sur la forte affinité entre la biotine et la streptavidine, appelé « streptavidin pull-down ». Nous avons ainsi identifié de nouveaux partenaires protéiques potentiels. Parmi ceux-ci, nous avons pu confirmer comme partenaires interagissant avec Ets-1, des protéines de réparation de l’ADN tels que le complexe DNA-PK et la PARP-1. La poly(ADP-ribose) polymérase -1 (PARP-1) est une enzyme aux rôles multiples qui catalyse la poly(ADP-ribosyl)ation ou PARylation. Si elle fut identifiée à l’origine comme une protéine de réparation de l’ADN, de nombreux travaux ont montré ces dernières années qu’elle est un co-régulateur majeur des mécanismes de transcription. Nous avons démontré qu’Ets-1 interagit directement avec la PARP-1 et est PARylée par celle-ci. L’utilisation d’inhibiteurs catalytiques de la PARP-1 sur des cellules de lignées cancéreuses, exprimant Ets-1, a pour conséquences l’accumulation massive de ce facteur et une augmentation de son activité transcriptionnelle. Ceci suggère une implication de la PARylation dans la stabilité d’Ets-1 en lien avec sa dégradation par le protéasome. Cependant, sous inhibition de la PARP-1, l’accumulation d’Ets-1 est toxique pour la cellule cancéreuse. En effet, nous avons observé une forte augmentation des dommages à l’ADN qui corrèle avec la mort des cellules tumorales. Nous supposons qu’une activité non régulée d’Ets-1 est néfaste pour le devenir cellulaire d’autant plus quand une enzyme de réparation de l’ADN comme la PARP-1 est inhibée.Ces résultats mettent en évidence un nouveau mécanisme de régulation d’Ets-1 au sein des cellules cancéreuses en liaison avec les protéines de réparation de l’ADN. De plus, l’utilisation d’inhibiteurs de la PARP-1 pourrait constituer une nouvelle stratégie afin de cibler spécifiquement les tumeurs exprimant Ets-1. / Ets-1 is a transcription factor, member of the Ets family, having a well-conserved DNA binding domain which recognizes a core consensus sequence, GGAA/T, present in the promoter of target genes. This factor regulates genes involved in various physiological processes such as development, haematopoiesis, and angiogenesis and in pathological processes notably cancer progression and invasion. Despite the efforts of the scientific community during these past 10 years, few strategies for Ets-1 therapeutic targeting can be apply to clinical medicine. Considering the fact that this transcription factor is a poor prognostic marker for numerous carcinomas, such as breast, lung or colorectal cancers, the finding of a new strategy for targeting its activity in tumours could be a new advance in the fight against cancer. Ets-1 does not act alone on its target promoters but with a wide range of transcriptional co-regulators. Moreover, this factor is a target for many signal transduction pathways. Identifying novel proteins that interact with Ets-1 should permit a better understanding of its regulation networks to develop a strategy for targeting its activity. For this purpose, we used a purification system to identify interacting partners based on the strong affinity between biotin and streptavidin, called streptavidin pull-down. We thereby identified new potentials interaction partners. Among those, we could confirm as Ets-1 partners, DNA repair proteins, such as the DNA-PK complex and PARP-1. The poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) is an enzyme with various roles that catalyses poly(ADP-ribosyl)ation or PARylation. Originally, it was identified as a DNA repair protein. Nevertheless, these past few years, many studies have highlighted its role as a co-regulator in transcription processes. We demonstrated that Ets-1 directly interact with PARP-1 and is PARylated in return. In Ets-1-expressing cancer cells, the catalytic inhibition of PARP-1 caused massive accumulation of this factor and enhanced its transcriptional activity. These results suggest that PARylation is involved in Ets-1 protein stability linked to its proteasomal degradation. Nevertheless, under PARP-1 inhibition, accumulation of Ets-1 is toxic for cancer cells. Indeed, we observed a strong increase in DNA damage that leads to cancer cells death. We assume that an unregulated activity of Ets-1 is harmful to the cellular outcome even more when a DNA repair protein such as PARP-1 is inhibited.These results give new insight into Ets-1 regulation in cancer cells linked to DNA repair proteins. Furthermore, our findings suggest that PARP-1 inhibitors would be useful in a new therapeutic strategy that specifically targets Ets-1-expressing tumours.

Thèse (M.E.R.) -- Université du Québec à Chicoutimi, avec l'Université du Québec à Hull, 1995. / Page 99 manquante. CaQCU Bibliogr.: f. 209-216. Document électronique également accessible en format PDF. CaQCU

Plasmodium falciparum (Pf) est un parasite intracellulaire capable d’infecter l’Homme. Dans les 48h après l’invasion des érythrocytes, il passe par le stade d’une cellule géante multinucléée qui se divise en 16 à 32 parasites. Cette multiplication rapide nécessite des mécanismes spécifiques de régulation très subtilement orchestrés. Parmi les modifications post-traductionnelles décrites chez les cellules eucaryotes, la phosphorylation réversible des protéines par les kinases/phosphatases est une des voies majeures dans la transduction des signaux cellulaires. Chez Plasmodium, des études de génétique inverse ont démontré que PfPP1, phosphatase majeure du parasite, est essentielle pour sa survie. L’activité de PP1 est connue pour être contrôlée par divers régulateurs endogènes. Cependant, malgré leur importance dans le ciblage de l’holoenzyme à un compartiment subcellulaire spécifique et/ou dans la régulation de son activité, peu de recherches ont été consacrées à l’identification de partenaires de PP1 chez Pf.Dans le but d’approfondir nos connaissances sur la régulation de PfPP1 et son impact sur la biologie de Pf, nous étudions les partenaires de cette enzyme qui seraient impliqués dans le contrôle de la phosphatase. Nos recherches récentes, basées sur des études de génomique comparative, ont permis d’identifier 4 régulateurs de PfPP1 : PfLRR1, PfI3, PfI2 et PfeiF2β. Au-delà de la capacité de ces protéines à contrôler la fonction de PP1 in vitro, nous avons montré par génétique inverse que leur rôle est vital pour Pf. En parallèle, nous avons entrepris une démarche plus globale pour la recherche de nouveaux partenaires/régulateurs de PfPP1. Nous avons notamment réalisé un criblage par double hybride de levure (Y2H) où PfPP1 est utilisé comme appât.Dans la 1ère partie de ma thèse, nous avons analysé les clones obtenus en criblage Y2H et initié la caractérisation de plusieurs d’entre eux. Notre choix d’étude s’est porté par la suite sur PF3D7_091900 et PF3D7_1202600, retrouvées 8 et 10 fois lors du criblage et présentant une interaction forte avec PP1. Mon projet de thèse avait pour but de caractériser au niveau moléculaire et fonctionnel le rôle de ces protéines sur l’activité de PP1 et de déterminer les régions/motifs de ces potentiels régulateurs pouvant intervenir au niveau de la relation structure/fonction du complexe qu’ils forment avec PfPP1.Dans une 2ème partie, nous avons étudié la séquence de ces protéines. PF3D7_0919900, protéine spécifique du parasite, possède le motif RVxF, souvent impliqué dans l’interaction avec PP1 et présente des motifs RCC1 connus pour interagir avec des protéines. Ainsi elle sera nommée RCC-PIP pour Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. PF3D7_1202600 est, quant à elle, un orthologue de Caliban chez la drosophile, et sera nommée CLP pour Caliban-Like Protein. Elle présente 17 motifs RVxF dont 7 se situent dans le fragment obtenu suite au criblage. Différentes approches ont confirmé que ces 2 protéines sont des partenaires de PfPP1. Cependant, la réalisation d’un test pNPP in vitro a mis en évidence une fonction activatrice de RCC-PIP, alors que CLP ne présente pas d’effet.Dans une 3ème partie, l’objectif était d’étudier plus en détails RCC-PIP. Nous avons démontré que le motif RVxF est impliqué dans l’interaction avec PfPP1. Puis nous avons étudié les motifs RCC1 et leur interactome par la réalisation d’un criblage Y2H en utilisant ces motifs comme appât. Une kinase a été trouvée (PfCDPK7) suggérant que RCC-PIP aurait un rôle de plateforme capable d’interagir avec 2 enzymes antagonistes. L’étude du rôle de RCC-PIP chez le parasite est actuellement en cours. La réalisation d’un knock-in a démontré l’accessibilité du locus. Un knock-out a également été effectué, mais l’absence d’intégration du plasmide indique que RCC-PIP serait essentielle au parasite. Pour confirmer cette observation, un knock-out conditionnel chez P. berghei est en cours de réalisation. / Plasmodium falciparum is an intracellular parasite that evolves in several stages of development in the vertebrate host. Within 48 hours after the invasion of erythrocytes, it goes through the stage of a multinucleated giant cell which divides into as many parasites as nuclei (16-32 parasites). This growth/fast division requires specific regulatory mechanisms subtly orchestrated. Among the post-translational modifications described in eukaryotic cells, the reversible phosphorylation of proteins by kinases/phosphatases is one of the major pathways in the cellular signal transduction. In Plasmodium, PP1 is predicted to catalyze the majority of protein dephosphorylation events, and has been shown to be essential in its survival using reverse genetic approaches. The activity of PP1 is known to be tightly controlled by various endogenous regulators. However, despite their importance in targeting the holoenzyme to a specific subcellular compartment and/or regulating its activity, little has been devoted to identify PP1 partners in the parasite.In order to deepen our understanding of the regulation of PfPP1 and its impact on the biology of Plasmodium, we study the partners of this enzyme that may be involved in the control of its location, its specificity and activity. Our recent research, based on comparative genomic studies, have identified 4 regulators of PfPP1: PfLRR1, PfI3, PfI2 and PfeiF2β. In parallel, since Plasmodium has a particular cell cycle and the function of PP1 should be adapted, we have undertaken a more global approach to the search for new partners/regulators of PfPP1 using different approaches including a yeast two-hybrid screening where PfPP1 was used as bait.In the first part of my thesis, the clones obtained in Y2H screening were analyzed and 2 clones were selected for further characterization. These clones, corresponding to PF3D7_091900 and PF3D7_1202600 were identified 8 and 10 times during the screening, a good indication about their expression in blood stages and their interactions with PfPP1 can be still detectable under high stringency conditions. Hence, my thesis project aimed to characterize molecularly and functionally of the role of these proteins on PfPP1. _x000D_In the second part, we have analysed the sequence of these two proteins. PF3D7_0919900, a parasite-specific protein, shows the canonical binding motif « RVxF », known to be involved in the interaction with PP1, and present on the fragment obtained following the screening. The sequence also has RCC1 motifs known to interact with proteins. Thereafter, this protein was designated as RCC-PIP for Regulator of Chromosome Condensation - Phosphatase Interacting Protein. As far as PF3D7_1202600 is concerned, it seems to be an ortholog of Caliban expressed by Drosophila, and designated Pf Caliban CLP-Like Protein. It has 17 potential RVXF binding motif, of which 7 are located in the fragment obtained following the screening. Different approaches such as GST pull-down or ELISA, identified these two proteins as partners of PfPP1. Using pNPP in vitro assay, we showed a slight activation of PfPP1 by RCC-PIP, while CLP had no effect.In the third part, the objective was to study in more detail the RCC-PIP. We showed that the RVxF motif is involved in the interaction with PfPP1. We then tied to identify the partners of RCC1 by screening a cDNA library of P. falciparum using RCC1 containing protein as bait. We showed that RCC-PIP is able to interact with a kinase (PfCDPK7) suggesting that RCC-PIP may act as a platform since it is able to interact with 2 enzymes with opposed activities. Analysis of the role of RCC-PIP in the parasite is currently underway. The production of a knock-in demonstrated the accessibility of the locus. A knock-out was also carried out, but the lack of integration of the plasmid suggests that RCC-PIP is essential to the parasite. To confirm this observation, a conditional knock-out in P. berghei is in progress.

Le polynucléaire neutrophile (PMN), cellule clé de l’immunité innée, est la première cellule à être recrutée sur le site inflammatoire. Après avoir détruit l’agent pathogène, il entre en apoptose puis est éliminé par les macrophages pour éviter le déversement de son contenu lytique, dangereux pour l’environnement. La régulation de la balance survie/apoptose du neutrophile est donc une étape cruciale de la résolution de l’inflammation. Notre laboratoire a mis en évidence la présence du Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) dans le neutrophile mature. PCNA est exprimé dans le noyau des cellules proliférantes, où il est impliqué dans la réplication/réparation de l’ADN et dans le contrôle du cycle cellulaire. PCNA est une protéine trimérique conservée au cours de l’évolution dépourvue d’activité enzymatique. En effet, PCNA constitue une “plateforme” qui interagit avec différents partenaires protéiques et orchestre leurs fonctions. De plus, pour assurer sa fonction, PCNA doit être obligatoirement sous forme trimérique. Dans le neutrophile mature, il a été démontré que PCNA avait une localisation exclusivement cytosolique et qu’il contrôlait spécifiquement la survie du neutrophile. La translocation de PCNA du noyau au cytosol a lieu pendant la différenciation granulocytaire. Elle est dépendante d'une séquence d'export nucléaire (NES) accessible et fonctionnelle que lorsque PCNA est monomérique. Le but de ma thèse a été d’étudier la plateforme de PCNA dans le cytosol du neutrophile afin d'identifier les protéines associées à PCNA afin de comprendre sa fonction dans les neutrophiles. Nous avons montré la présence de la forme monomérique et de la forme trimérique de PCNA dans le cytosol du neutrophile mature. Nous avons démontré une activité anti-apoptotique de la forme monomérique dans des cellules PLB985 différenciées en neutrophiles. De plus, nous avons identifié des peptides exposés sur la surface monomérique de PCNA qui sont utilisé comme des compétiteurs pour déplacer les interactions entre PCNA et ses partenaires dans le cytosol des neutrophiles. Ces peptides modulent la survie des neutrophiles. Grâce à des analyses de Spectrométrie de Masse, nous avons identifié des nouveaux partenaires de PCNA dans le cytosol du neutrophile impliqués dans plusieurs voies métaboliques. Cela suggère que PCNA régule la survie du neutrophile en interagissant avec différents protéines cytosoliques. Parmi les partenaires identifiés, nous avons trouvé les sous-unités cytosoliques de la NADPH oxydase, enzyme responsable de la production de formes réactives de l’oxygène, à la base de l’activité microbicide du neutrophile. Nous avons montré en particulier l’interaction entre p47phox et PCNA. Nous avons enfin étudié l’implication fonctionnelle de l’interaction de PCNA avec la NADPH oxydase dans des cellules PLB985 et également dans des neutrophiles humains. L’ensemble des résultats suggère que PCNA cytoplasmique maintient le neutrophile dans un état de repos, et aide l’assemblage de la NADPH oxydase lors de son activation. Le réseau protéique associé à PCNA régule l’activité et la survie du neutrophile en modulant différentes voies de signalisation. / Polymorphonuclear neutrophils (PMN), key cells of innate immunity are the first cell recruited to the inflammatory site. After destroying the pathogen, neutrophils undergo apoptosis and are cleared by macrophages to prevent the spillage of their lytic content that is dangerous for the environment. The regulation of the survival/apoptosis balance of neutrophil is a crucial step in the inflammation resolution. Our laboratory has shown the presence of Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) in mature neutrophils. PCNA is expressed in the nucleus of proliferating cells, where it is involved in DNA replication/repair and in cell cycle control. PCNA is a trimeric protein conserved during evolution and deprived of enzymatic activity. Indeed, PCNA is a “platform” that interacts with different partner proteins and orchestrates their functions. Furthermore, PCNA must be in trimeric form to play its role. In mature neutrophils, PCNA has an exclusively cytosolic localization where it specifically controls their survival. The PCNA translocation from nucleus to the cytosol happened during the granulocytic differentiation. This nuclear-to-cytosol relocalisation is dependent on a nuclear export sequence (NES), which is accessible and functional when PCNA is monomeric. The aim of my thesis was to study the PCNA platform in the neutrophil cytosol to identify the proteins associated with PCNA in order to understand its function in neutrophils. We have shown the expression of monomeric and trimeric forms of PCNA in the cytosol of mature neutrophils. We have demonstrated the anti-apoptotic activity of the monomeric form in PLB985 cells differentiated in neutrophils. Moreover, we have identified the surface-exposed peptides from the monomeric PCNA which are used as competitors of interactions between PCNA and its partner in the cytosol of neutrophils. These peptides modulate neutrophils survival. Thanks to the analysis of Mass Spectrometry, we have identified new partners of PCNA in the neutrophil cytosol involved in several metabolic pathways. This suggests that PCNA regulates neutrophil survival by interacting with different cytosolic proteins. Among the identified partners, we have found the cytosolic subunits of the NADPH oxidase, the enzyme responsible of the reactive oxygen species production, at the base of the neutrophil microbicidal activity. We have shown especially the interaction between p47phox and PCNA. Finally, we have investigated the functional implication of the interaction of PCNA with the NADPH oxidase in PLB985 cells and also in human neutrophils. Taken altogether, results suggest that the cytosolic PCNA maintains the resting state of neutrophils, and it helps the assembly of the NADPH oxidase when activated. The protein network associated with PCNA regulates the activity and the survival of neutrophil by modulating several pathways.