Les glucanes périplasmiques osmorégulés (OPG) sont des constituants du périplasme de l’enveloppe de la plupart des bactéries à Gram négatif dont la concentration augmente en réponse à la baisse d’osmolarité du milieu. Les OPG sont d’importants facteurs de virulence chez les bactéries pathogènes pour l’animal ou pour les végétaux puisque leur absence conduit à une forte diminution, voire à une perte totale de la virulence. Notre modèle d’étude, Dickeya dadantii, est une entérobactérie phytopathogène responsable de la formation d’une pourriture molle sur un large spectre de plantes hôtes. L’absence d’OPG chez un mutant opgG ou opgH provoque un phénotype pleïotrope incluant une perte totale de la virulence. L’objectif de cette thèse est de tenter de mieux comprendre le rôle des OPG au sein du périplasme. Une mutation suppressive du phénotype Opg- localisée dans le gène rcsC a été isolée. Cette mutation rcsC2 conduit à une baisse de phosphorylation de RcsB due à l’augmentation de l’activité phosphatase de RcsC. Elle restaure de nombreux phénotypes y compris la virulence sur tubercule de pomme de terre mais pas sur feuille d’endive. La protéine RcsC fait partie du système à deux composants RcsCD-RcsB. ’ensemble des phénotypes observés indiquent que l’absence d’OPG active le système RcsCD-RcsB. L’opéron opgGH a été placé sous le contrôle d’un promoteur inductible par l’arabinose, ce qui nous a permis de moduler finement la quantité d’OPG produite en fonction de la concentration d’arabinose présente dans le milieu. Nous avons ainsi pu montrer que la quantité d’OPG module l’activité du système RcsCD-RcsB. De plus, nous avons pu identifier d’autres gènes régulés par les OPG. Les résultats suggèrent que certains de ces gènes pourraient être régulés par des systèmes à deux composants différents de RcsCD-RcsB. Il semble donc que les OPG interviennent dans la signalisation cellulaire par une ou plusieurs interactions à déterminer avec différents systèmes à deux composants. / The Osmoregulated Periplasmic Glucans (OPG) are general periplasmic components of the envelope of most Gram negative bacteria. Their concentration increases as the osmolarity of the medium decreases. OPG are important virulence factors in plant or animal pathogenic bacteria, since their absence leads to a strong decrease or even complete loss of virulence. Our study model, Dickeya dadantii, is a phytopathogenic enterobacteria causing soft rot disease in a wide range of plant species. The opgG or opgH mutants are unable to synthesize OPGs and display a pleiotropic phenotype including a complete loss of virulence. The aim of this study is to better understand the role of OPG in the periplasm. The genetic study of a suppressor mutation in an opgG mutant was carried out. The suppressing mutation is located in the rcsC gene. This mutation, called rcsC2, increases the RcsC phosphatase activity, thus leading to a decrease of RcsB phosphorylation. It restores many phenotypes including virulence on potato tubers but not on chicory leave. The RcsC protein belongs to the RcsCD-RcsB two-component system. In D. dadantii, all the phenotypes observed suggest that the lack of OPG leads to an increased phosphorylation of RcsB by RcsC. The opgGH operon was cloned under the control of an arabinose-inducible promoter which enables us to finely tune the amount of OPG in response to arabinose concentration. We show that the amount of OPG modulates the activity of the RcsCD-RcsB system. We were able to identify new OPG-regulated genes using the system described above. Results suggest that some of these genes could be to be regulated by additional regulators. Thus, OPG are involved in cell signaling pathways through one or several interactions with several two-component systems.

La communication intercellulaire se produit non seulement chez les eucaryotes, mais aussi chez certaines bactéries. Un tel exemple est la cyanobactérie filamenteuse Anabaena sp. PCC 7120, capable de former des hétérocystes suite à une carence en azote combiné. Un filament d'Anabaena est coordonné comme une unité multicellulaire; comment les cellules communiquent-elles le long de chaque filament et comment échangent-elles des ressources nutritionnelles demeurent des mécanismes encore mal élucidés. Des études récentes ont démontré que des molécules de petites tailles peuvent être échangées entre les cytoplasmes à travers des jonctions intercellulaires. De plus, le périplasme semble être continu le long de chaque filament, avec une membrane extérieure commune pour toutes les cellules. Toutefois, il n’est pas déterminé si le "périplasme continu" peut servir comme une route alternative pour les échanges moléculaires le long des filaments.Dans cette étude, la propriété du périplasme chez Anabaena a été évaluée par le suivi du mouvement de protéines fluorescentes (GFP ou iLOV) en utilisant des techniques microscopiques. Les protéines fluorescentes ont été exportées vers l'espace périplasmique, soit d'un hétérocyste soit d’une cellule végétative. Nous avons pu montrer que ces protéines fluorescentes restent dans le périplasme de la cellule d’origine, et que la GFP peut diffuser librement, mais seulement dans le périplasme d'un hétérocyste ou d’une cellule végétative. Ainsi, bien que le périplasme semble être continu le long du filament, une barrière intercellulaire semble exister pour empêcher la libre diffusion des protéines à la taille de ~27 kDa (GFP) ou ~13 kDa (iLOV). La couche de peptidoglycane pourrait constituer cette barrière et nous estimons que la limite pour la diffusion à travers cette barrière se situe entre 0.53 et 13 kDa.En parallèle, les voies métaboliques des cellules végétatives et des hétérocystes ont été comparées en utilisant une approche transcriptomique. L'expression différentielle des gènes impliqués dans le métabolisme nous permet d’appréhender la nature des métabolites pouvant être échangées entres ces deux types cellulaires. / Cell-cell communication occurs not only in eukaryotes but also in bacteria. One such example is the filamentous cyanobacterium Anabaena sp. PCC 7120, which is able to differentiate a specialized cell type named heterocyst upon nitrogen deprivation. A filament of Anabaena is coordinated as a multicellular unity; how the cells along each filament communicate and exchange resources are not yet fully understood. Recent studies demonstrated that small molecules can be rapidly exchanged from cytoplasm to cytoplasm through intercellular junctions. In addition, the periplasm appears to be continuous along each filament, with a shared outer membrane for all cells. However, whether the ‘continuous periplasm’ serves as an alternative route for molecular exchanges along the filament remains unknown. In this study, the property of periplasm in Anabaena was assessed by monitoring the movement of fluorescent proteins (GFP or iLOV) using microscopic techniques. Fluorescent proteins were exported to the periplasmic space of either a heterocyst or a vegetative cell and their diffusion was tested. We found that both GFP and iLOV remains in the producing cells, and at least GFP could diffuse freely in the periplasm of a heterocyst or a vegetative cell but failed to cross cell borders. Thus although periplasm appears to be continuous along the filament, barriers exist to prevent free diffusion of proteins up to the size of ~27 kDa (GFP) or ~13 kDa (iLOV). One candidate as diffusion barrier in the periplasm may be the peptidoglycan and we estimate the limit for diffusion of the barrier in the range between 0.53 to 13 kDa. In parallel, the biosynthetic pathways operating in vegetative cells and heterocysts were compared using oligonucleotide microarray. Differential expression of the genes involved in amino acids metabolism give clues as to which nitrogen-containing compounds might serve as the transfer vehicle in cell-cell exchanges.

Les espèces Neisseria gonorrhoeae et Neisseria meningitidis, sont des bactéries pathogènes obligatoires de l'Homme, qui ont acquis différents mécanismes de défense pour détecter et combattre le stress oxydant généré par les mécanismes de défense de l'hôte lors de l'infection. La protéine PilB périplasmique, ferait partie de ces mécanismes et serait de ce fait associée à leur pathogénicité. PilB est composée de trois domaines : un domaine N-terminal (Nter) à activité disulfure oxydoréductase, et les domaines central et C-terminal à activité Méthionine Sulfoxyde Réductase (Msr) respectivement de classe A et B. L'étude des domaines isolés de PilB avait montré que le domaine Nter réduit sélectivement le domaine MsrB. Par ailleurs, le domaine Nter présente un repliement de type DsbE. Les DsbE sont des disulfure oxydoréductases périplasmiques impliquées dans la maturation des cytochromes c. En particulier, la DsbE1 de N. meningitidis a été identifiée par le Dr Adeline Gand lors de son doctorat.Lors de ma thèse, l'étude des protéines PilB de N. meningitidis et de Fusobacterium nucleatum m'a permis de montrer que : 1) la sélectivité de réduction du domaine Nter pour le domaine MsrB n'est pas conservée, 2) la sélectivité de réduction des domaines Nter observée sur les domaines isolés n'est pas retrouvée sur les PilB entiers ; et 3) dans tous les PilB, la réduction du domaine MsrB par le domaine Nter peut se faire selon un mécanisme intramoléculaire. De plus, nous avons étudié in vivo l'effet de la délétion du gène pilB sur la survie d'une souche de N. meningitidis en présence d'agents oxydants. D'autre part, le domaine N-terminal de la protéine DsbD (nDsbD) de N. meningitidis a été identifié comme étant le réducteur périplasmique de PilB et de la DsbE1 de N. meningitidis. Enfin, la caractérisation de l'activité apocytochrome c réductase de la DsbE1 de N. meningitidis a été complétée par des approches in vitro et in vivo chez N. meningitidis / The Neisseria gonorrhoeae and Neisseria meningitidis species are human obligatory pathogenic bacteria, which acquired various defense mechanisms to detect and fight oxidative stress generated by mechanisms of host defense during infection. The periplasmic PilB protein, specific to these bacteria, would be part of such mechanisms and would be associated with their pathogenicity. PilB is composed of three domains: an N-terminal domain (Nter) with disulfide oxidoreductase activity, and central and C-terminal domains with Methionine sulfoxide reductase activity (Msr) of A and B class respectively. The study of isolated domains of PilB showed that the Nter domain selectively reduced MsrB domain. Moreover, this Nter domain presents a DsbE-fold. The DsbE are periplasmic disulfide oxidoreductases involved in the maturation of cytochrome c. In particular, Dr. Adeline Gand identified the DsbE1 from N. meningitidis during his PhD. During my PhD, the study of PilB proteins from N. meningitidis and Fusobacterium nucleatum allowed me to show that: 1) the selective reduction of Nter domain for the MsrB domain is not conserved, 2) the selective reduction of Nter domains observed on the isolated domains is not found in entire PilB, and 3) in all PilB, the MsrB domain reduction by Nter domain could be an intramolecular mechanism. Moreover, we studied the in vivo effect of the pilB gene deletion on the survival of a strain of N. meningitidis in the presence of oxidants. And, the N-terminal domain of DsbD protein (nDsbD) from N. meningitidis was identified as the reducing partner of periplasmic PilB and DsbE1 of N. meningitidis. Finally, the characterization of apocytochrome c reductase activity of DsbE1 N. meningitidis was complemented by in vitro and in vivo approaches in N. meningitidis

Campylobacter est responsable de la majorité des gastro-entérites bactériennes dans le monde. Sa membrane externe contient des porines qui permettent les échanges entre la bactérie et le milieu extérieur. Elles sont une des voies principales d’entrée pour les antibiotiques et les nutriments. Le premier objectif de mon travail était de participer à la caractérisation des porines MOMP et Omp50. Nous avons purifié ces protéines dans le cadre de collaborations pour l’étude des propriétés biophysiques de ces porines (M. Wintherhalter, Université Jacob, Allemagne) et la détermination de leur structure par cristallisation (J. Naismith, Université St Andrews, Écosse). La deuxième partie de ma thèse a été consacrée à l’étude et la caractérisation du produit du gène Cj1169c qui est en opéron avec le gène codant Omp50. Nous avons cloné et exprimé le gène Cj1169c chez Escherichia coli, ce qui a permis de purifier la protéine et de produire des anticorps spécifiques. Ces anticorps ont été utilisés pour étudier la prévalence de Cj1169c chez les espèces les plus fréquentes. Nous avons montré qu’elle était présente uniquement chez C. jejuni et C. lari et absente chez C. coli. En deuxième lieu, nous avons caractérisé sa production en fonction de conditions de culture et montré qu’elle dépendait du pH et de la température. Nous avons ensuite démontré que cette protéine est située dans le périplasme de Campylobacter. Puis, en raison de la présence de deux résidus de cystéines dans sa séquence, nous avons étudié son comportement en présence et en absence d’agents réducteurs de ponts disulfures. De plus, des résultats préliminaires suggèrent que cette protéine interagit avec Omp50. / Campylobacter is a leading cause of bacterial gastroenteritis worldwide. Its outer membrane contains porins which are pore forming protein that transport hydrophilic compounds like nutrients and antibiotics into the bacteria. My first objective was to purify the two porins MOMP and Omp50 from C. jejuni, in order to allow the study of the biophysical properties of porins (Collaboration with Mr. Wintherhalter, Jacob University, Germany), and to determine the structure of these porins by crystallization (Collaboration with J. Naismith, St Andrews University, Scotland).The second part of my thesis was devoted to the study of the product of the gene Cj1169c which is operonic with the Omp50 coding gene. We cloned and expressed the gene Cj1169c in Escherichia coli, purified the protein and produced Cj1169c-specific antibodies. We studied the prevalence of this protein in the most frequent species of Campylobacter and found the protein only in C. jejuni and C. lari never in C. coli. Then, we also studied the Cj1169c production in the function of several growing conditions, and we found that it depended on the pH and temperature. Besides, we demonstrated by several methods that this protein is located in the periplasmic compartment of the bacteria. Furthermore, because it contains two cysteins residues in its primary sequence, we studied the Cj1169c behavior in the presence and absence of disulfide bond reducing agents. In addition, preliminary results suggest that this protein interacts with Omp50.