Proefschrift Universiteit van Amsterdam. / Met lit. opg. - Met samenvatting in het Nederlands en Portugees.

A atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) e receptor X hepático (LXR) são regulados por ácidos graxos. Entretanto, o papel do LNO2, um produto endógeno da nitração do ácido linoléico por espécies reativas derivadas de óxido nítrico (•NO), na via de sinalização que regula a ativação destes receptores ainda não está elucidada. Assim, considerando a propriedade do LNO2 como doador de •NO, nós investigamos a participação da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK na ativação de PPAR e LXR por LNO2. Os resultados obtidos demonstraram que LNO2, na concentração de 0.01µM, foi um potente ativador de PPAR quando comparado ao ligante natural ácido linoléico, o qual apresentou ativação equivalente do PPAR na concentração de 10µM. O LNO2, contudo não teve efeito na ativação de LXR. LNO2 foi um potente ativador de p21Ras quando comparado ao ácido linoléico. A ativação de Ras ocorreu após 5 minutos de incubação com LNO2 em células parentais. Entretanto, em células transfectadas com p21RasC118S, o LNO2 não foi capaz de ativar Ras. A ativação de Ras e PPAR foi dependente da liberação de •NO a partir de LNO2, o que foi evidenciado na presença de C-PTIO, um seqüestrador de •NO. LNO2 ativou ERK, mas não demonstrou efeito relevante na ativação de p38 MAP kinase. A utilização de um inibidor específico de MEK, PD09895, inibiu a ativação de ERK induzida por LNO2, sugerindo que existe uma conexão entre ERK e a ativação de PPAR. Nós concluímos que a ativação do receptor nuclear PPAR por LNO2 é dependente de •NO e da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK, a qual é capaz de ativar os subtipos α, &$946; e γ do PPAR, modulando, desse modo, a expressão de genes responsivos a este fator de transcrição. / Fatty acids bind to and regulate the activity of peroxissome proliferator-activated (PPAR) and liver X receptors (LXR). However, the role of LNO2, an endogenous product of the nitration of linoleic acid by nitric oxide (•NO)-derived reactive species, on signalling pathways regulating these nuclear receptors is poorly understood. Thus, considering the properties of LNO2 as •NO donor, we investigated the role of p21RasMAP kinases signaling pathway in the activation of PPARs and LXR by LNO2. LNO2 at physiologically relevant concentrations (0.01 µM) activates PPAR. By contrast, linoleic acid, a natural ligand for PPAR, only activated the receptor at much higher concentrations (10µM). However, it did not affect LXR activation. LNO2 is a more potent activator of p21 Ras than linoleic acid at the same conditions. Ras activation occurred within the first 5 minutes after LNO2 addition to parental cells. However, in p21RasC118s transfected cells, were unable to detect activation of Ras. Ras and PPAR activation depends on •NO released from LNO2 as evidenced by the inhibitory effect of C-PTIO, a •NO scavenger. LNO2 activated ERK but displayed no effects relevant on p38 MAP kinase. In addition, the use of specific inhibitors to MEK, PD09895, blocked PPAR activation and ERK phosphorylation by LNO2, suggesting a connection between ERK and the activation of PPAR. We conclude that LNO2 induced THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signalling cascade and activated PPAR (α, β and γ).

Noncovalent factors, such as shape complementarity and electrostatic driving forces, almost exclusively cause the affinity and specificity for which two or more biological macromolecules organize into a functioning complex. The human oncoprotein p21Ras (Ras) and a structurally identical but functionally distant analog, Rap1A (Rap), exhibit high selectivity and specificity when binding to downstream effector proteins that cannot be explained through structural analysis alone. Both Ras and Rap bind to Ral guanine nucleotide dissociation stimulator (RalGDS) with affinities that differ tenfold instigating diverse cellular functions; it is hypothesized that this specificity of RalGDS to discriminate between GTPases is largely electrostatic in nature. To investigate this hypothesis, electrostatic fields at the binding interface between mutants of RalGDS bound to Rap or Ras are measured using vibrational Stark effect (VSE) spectroscopy, in which spectral shifts of a probe oscillator’s energy is related directly to that probe’s local electrostatic environment and measured by Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR). After calibration, the probe is inserted into a known position in RalGDS where it becomes a highly local, sensitive, and directional reporter of fluctuations of the protein’s electrostatic field caused by structural or chemical perturbations of the protein. The thiocyanate (SCN) vibrational spectroscopic probe was systematically incorporated throughout the binding interface of RalGDS. Changes in the absorption energy of the thiocyanate probe upon binding were directly related to the change of the strength of the local electrostatic field in the immediate vicinity of the probe, thereby creating a comprehensive library of the binding interactions between Ras-RalGDS and Rap-RalGDS. The measured SCN absorption energy on the monomeric protein was compared with solvent-accessible surface area (SASA) calculations with the results highlighting the complex structural and electrostatic nature of protein-water interface. Additional SASA studies of the nine RalGDS mutants that bind to Ras or Rap verified that experimentally measured thiocyanate absorption energies are negatively correlated with exposure to water at the protein-water interface. By changing the solvent composition, we confirmed that the cyanocysteine residues that are more exposed to solvent experienced a large difference in absorption energy. These studies reinforce the hypothesis that differences in the electrostatic environment at the binding interfaces of Ras and Rap are responsible for discriminating binding partners. / text

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1997. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [74]-91).

O bócio multinodular (BMN) é definido como aumento da glândula tireóide devido a proliferação de tireócitos e caracteriza-se pela heterogeneidade no crescimento e função das células foliculares. É uma patologia comum, com aumento da prevalência em áreas com deficiência de iodo, sendo este o principal fator etiológico do BMN. O BMN é considerado uma neoplasia benigna da tireóide. A patogênese desta disfunção ainda não foi inteiramente elucidada. Nesta revisão serão abordados os mecanismos envolvidos na patogênese e os principais aspectos etiológicos e clínicos do BMN. / Multinodular goiter (MNG) is an enlargement of the thyroid gland and is characterized by heterogeneity in growth and function of thyroid follicular cells. It is a common pathology, with higher prevalence in iodine deficiency areas. Iodine deficiency is the main etiologic factor for MNG. MNG have been considered a true thyroid neoplasm. The pathogenesis of multinodular goiter is not yet clarified. The purpose of this review is to summarize the current knowledge of MNG with respect to the pathology, etiologic and clinical characteristics.

O bócio multinodular (BMN) é definido como aumento da glândula tireóide devido a proliferação de tireócitos e caracteriza-se pela heterogeneidade no crescimento e função das células foliculares. É uma patologia comum, com aumento da prevalência em áreas com deficiência de iodo, sendo este o principal fator etiológico do BMN. O BMN é considerado uma neoplasia benigna da tireóide. A patogênese desta disfunção ainda não foi inteiramente elucidada. Nesta revisão serão abordados os mecanismos envolvidos na patogênese e os principais aspectos etiológicos e clínicos do BMN. / Multinodular goiter (MNG) is an enlargement of the thyroid gland and is characterized by heterogeneity in growth and function of thyroid follicular cells. It is a common pathology, with higher prevalence in iodine deficiency areas. Iodine deficiency is the main etiologic factor for MNG. MNG have been considered a true thyroid neoplasm. The pathogenesis of multinodular goiter is not yet clarified. The purpose of this review is to summarize the current knowledge of MNG with respect to the pathology, etiologic and clinical characteristics.

O bócio multinodular (BMN) é definido como aumento da glândula tireóide devido a proliferação de tireócitos e caracteriza-se pela heterogeneidade no crescimento e função das células foliculares. É uma patologia comum, com aumento da prevalência em áreas com deficiência de iodo, sendo este o principal fator etiológico do BMN. O BMN é considerado uma neoplasia benigna da tireóide. A patogênese desta disfunção ainda não foi inteiramente elucidada. Nesta revisão serão abordados os mecanismos envolvidos na patogênese e os principais aspectos etiológicos e clínicos do BMN. / Multinodular goiter (MNG) is an enlargement of the thyroid gland and is characterized by heterogeneity in growth and function of thyroid follicular cells. It is a common pathology, with higher prevalence in iodine deficiency areas. Iodine deficiency is the main etiologic factor for MNG. MNG have been considered a true thyroid neoplasm. The pathogenesis of multinodular goiter is not yet clarified. The purpose of this review is to summarize the current knowledge of MNG with respect to the pathology, etiologic and clinical characteristics.

A atividade dos receptores ativados por proliferadores de peroxissoma (PPAR) e receptor X hepático (LXR) são regulados por ácidos graxos. Entretanto, o papel do LNO2, um produto endógeno da nitração do ácido linoléico por espécies reativas derivadas de óxido nítrico (•NO), na via de sinalização que regula a ativação destes receptores ainda não está elucidada. Assim, considerando a propriedade do LNO2 como doador de •NO, nós investigamos a participação da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK na ativação de PPAR e LXR por LNO2. Os resultados obtidos demonstraram que LNO2, na concentração de 0.01µM, foi um potente ativador de PPAR quando comparado ao ligante natural ácido linoléico, o qual apresentou ativação equivalente do PPAR na concentração de 10µM. O LNO2, contudo não teve efeito na ativação de LXR. LNO2 foi um potente ativador de p21Ras quando comparado ao ácido linoléico. A ativação de Ras ocorreu após 5 minutos de incubação com LNO2 em células parentais. Entretanto, em células transfectadas com p21RasC118S, o LNO2 não foi capaz de ativar Ras. A ativação de Ras e PPAR foi dependente da liberação de •NO a partir de LNO2, o que foi evidenciado na presença de C-PTIO, um seqüestrador de •NO. LNO2 ativou ERK, mas não demonstrou efeito relevante na ativação de p38 MAP kinase. A utilização de um inibidor específico de MEK, PD09895, inibiu a ativação de ERK induzida por LNO2, sugerindo que existe uma conexão entre ERK e a ativação de PPAR. Nós concluímos que a ativação do receptor nuclear PPAR por LNO2 é dependente de •NO e da via de sinalização p21Ras/Raf/ERK, a qual é capaz de ativar os subtipos α, &$946; e γ do PPAR, modulando, desse modo, a expressão de genes responsivos a este fator de transcrição. / Fatty acids bind to and regulate the activity of peroxissome proliferator-activated (PPAR) and liver X receptors (LXR). However, the role of LNO2, an endogenous product of the nitration of linoleic acid by nitric oxide (•NO)-derived reactive species, on signalling pathways regulating these nuclear receptors is poorly understood. Thus, considering the properties of LNO2 as •NO donor, we investigated the role of p21RasMAP kinases signaling pathway in the activation of PPARs and LXR by LNO2. LNO2 at physiologically relevant concentrations (0.01 µM) activates PPAR. By contrast, linoleic acid, a natural ligand for PPAR, only activated the receptor at much higher concentrations (10µM). However, it did not affect LXR activation. LNO2 is a more potent activator of p21 Ras than linoleic acid at the same conditions. Ras activation occurred within the first 5 minutes after LNO2 addition to parental cells. However, in p21RasC118s transfected cells, were unable to detect activation of Ras. Ras and PPAR activation depends on •NO released from LNO2 as evidenced by the inhibitory effect of C-PTIO, a •NO scavenger. LNO2 activated ERK but displayed no effects relevant on p38 MAP kinase. In addition, the use of specific inhibitors to MEK, PD09895, blocked PPAR activation and ERK phosphorylation by LNO2, suggesting a connection between ERK and the activation of PPAR. We conclude that LNO2 induced THP-1 cells activating Ras by S-nitrosation and recruiting the MAP kinase ERK, a downstream element of this signalling cascade and activated PPAR (α, β and γ).

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

A subfamília p21 RAS de pequenas GTPases, incluindo KRAS, HRAS e NRAS, participa de muitas redes de sinalização, incluindo proliferação celular, organização do citoesqueleto e apoptose, e é o alvo mais freqüente de mutações ativadoras em câncer. Mutações germinativas em KRAS e HRAS causam graves anormalidades desenvolvimentais levando às síndromes de Noonan, cárdio-facial-cutânea e Costello, porem mutações ativadoras germinativas em NRAS não foram descritas até hoje. A síndrome autoimune linfoproliferativa (ALPS) é o mais comum defeito genético de apoptose linfocitária, cursando com autoimunidade e acúmulo excessivo de linfócitos, particularmente do tipo T + CD4- CD8-. As mutações causadoras de ALPS descritas até hoje afetam a apoptose mediada por Fas, uma das vias extrínsecas de apoptose. Nós demonstramos aqui que os principais achados clínicos de ALPS, bem como uma predisposição para tumores hematológicos, podem ser causados por uma mutação heterozigota ativadora G13D no oncogene NRAS, sem causar prejuízo na apoptose mediada por Fas. O aumento na quantidade intracelular de NRAS ativo, ligado a GTP, induziu a um aumento da sinalização na via RAF/MEK/ERK, o que suprimiu a expressão da proteína pró-apoptótica BIM, e atenuou a apoptose intrínseca mitocondrial. Desta forma, uma mutação germinativa ativadora em NRAS causou um fenótipo clinico diferente do visto em pacientes com mutações em outros membros da família p21 RAS, cursando com um defeito imunológico seletivo, sem distúrbios generalizados do desenvolvimento / The p21 RAS subfamily of small GTPases, including KRAS, HRAS, and NRAS, regulates cell proliferation, cytoskeletal organization and other signaling networks, and is the most frequent target of activating mutations in cancer. Activating germline mutations of KRAS and HRAS cause severe developmental abnormalities leading to Noonan, cardio-facial-cutaneous and Costello syndrome, but activating germline mutations of NRAS have not been reported. Autoimmune lymphoproliferative syndrome (ALPS) is the most common genetic disease of lymphocyte apoptosis and causes autoimmunity as well as excessive lymphocyte accumulation, particularly of CD4-, CD8- ab T cells. Mutations in ALPS typically affect Fas-mediated apoptosis, but certain ALPS individuals have no such mutations. We show here that the salient features of ALPS as well as a predisposition to hematological malignancies can be caused by a heterozygous germline Gly13Asp activating mutation of the NRAS oncogene that does not impair Fas-mediated apoptosis. The increase in active, GTP-bound NRAS augmented RAF/MEK/ERK signaling which markedly decreased the pro-apoptotic protein BIM and attenuated intrinsic, nonreceptor-mediated mitochondrial apoptosis. Thus, germline activating mutations in NRAS differ from other p21 Ras oncoproteins by causing selective immune abnormalities without general developmental defects