CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O carcinoma gÃstrico à a segunda causa de morte por cÃncer no mundo. No Cearà à o segundo mais freqÃente entre os homens e o terceiro entre as mulheres. Dos cÃnceres gÃstricos os adenocarcinomas representam em torno de 95%. A doenÃa tem sido associada a fatores genÃticos e ambientais sendo demonstrada Ãntima relaÃÃo com a infecÃÃo por Helicobacter pylori, principalmente associada à presenÃa do gene cagA e genÃtipos vacAs1m1. Entretanto, apesar dos mecanismos pelos quais a bactÃria promove a carcinogÃnese gÃstrica ainda nÃo estarem esclarecidos, uma das hipÃteses seria atravÃs da inativaÃÃo de supressores tumorais. O objetivo do presente trabalho foi verificar, em adenocarcinomas gÃstricos, se a presenÃa de H. pylori, e de seus genes cagA e vacA, està relacionada com a mutaÃÃo e/ou alteraÃÃo na expressÃo protÃica dos supressores tumorais p53 e p27. Neste estudo, 74 amostras de pacientes foram analisadas quanto à presenÃa de H. pylori, cagA+ e os genÃtipos de vacA, pela reaÃÃo em cadeia da polimerase (PCR). A anÃlise mutacional do gene p53 foi realizada por PCR-SSCP e a detecÃÃo da mutaÃÃo/superexpressÃo do p53 e expressÃo da proteÃna p27 pelo mÃtodo imunohistoquÃmico. A bactÃria foi detectada em 95% das amostras, das quais 63% eram cagA(+). Dentre os alelos de vacA, observou-se predomÃnio de s1 (74%) e m1 (82%), associados em 69% dos casos. Na anÃlise mutacional do p53 verificou-se que 72% dos casos exibiram alteraÃÃo no padrÃo de mobilidade eletroforÃtica, sendo esta associada significativamente à presenÃa do gene cagA. Por outro lado, apenas 29% dos casos apresentaram detecÃÃo pelo mÃtodo imunohistoquÃmico, nÃo sendo encontrada associaÃÃo com a H. pylori. A proteÃna p27 demonstrou acentuada reduÃÃo em sua expressÃo (detectada em apenas 19% dos casos), nÃo demonstrando atividade compensatÃria em relaÃÃo à proteÃna p53 mutada e sem associaÃÃo estatÃstica dos casos negativos com a presenÃa da H. pylori. Finalmente, os resultados sugerem que estes supressores simultaneamente inativados podem ser o ponto chave da desregulaÃÃo do ciclo celular que, associados a outros fatores, favoreÃam o desenvolvimento e progressÃo dos adenocarcinomas gÃstricos. Hà indÃcios de que a presenÃa bacteriana, e dos seus genes cagA(+) e vacA/s1m1, possam influenciar, de forma nÃo esclarecida, as alteraÃÃes moleculares ocorridas nos supressores tumorais p53 e p27. / Gastric carcinoma is the second cause of death by cancer in the world. On State of Ceara-Brazil is the second most frequent type of cancer in men and third in women. Adenocarcinomas account for approximately 95% of all malignant gastric neoplasms. It has been associated to genetic and environmental factors and a intimate relationship between the infection by the bacteria Helicobacter pylori and the gastric carcinoma have been related. The presence of the cagA gene and specific genotypes (s1m1) of the gene vacA have been detected in more pathogenic strains. Although the precise molecular mechanisms by which H. pylori could promote the process of gastric carcinogenesis are under investigation, one hypothesized mechanism involves the tumor supressor genes inactivation. The aim of the present study was to verify if the presence of Helicobacter pylori, cagA and vacA genes is related to mutations in the tumor supressor gene p53 and altered expression of p53 and p27 proteins in gastric adenocarcinomas. Seventy-four (74) samples were analyzed to detect the presence of H. pylori, cagA and genotypes of vacA by Polymerization Chain Reaction (PCR). The mutational analysis of p53 gene was performed by PCR-SSCP (Polymerization Chain Reaction for analysis of the Single-strand Conformation Polymorphism). Analysis of mutation or overexpression of p53 protein and p27 expression was detected by the immunohistochemical method. The bacteria was detected in 95% of the samples, 63% was cagA(+). Among the vacA allele it was observed prevalence of s1 (74%) and m1 (82%), associated in 69% of the cases. Mutation analysis of p53 demonstrated 72% of the cases with altered electrophoretic mobility; The alterations were significatively more frequent in the presence of the cagA gene. Immunohistochemical analysis detected only 29% of cases with the expression of p53 protein. The protein p27 showed accentuated reduction in its expression (detected in only 19% of the cases), it has not demonstrated compensatory activity in relation to the p53 altered protein, neither association to H. pylori presence. Finally, these data suggest that simultaneous inactivation of these tumor suppressors genes may be the key point of deregulation of the cellular cycle that, associated to the other factors, favor the development and progression of the gastric cancer. There is some evidence that the bacterial presence, cagA and vacA/s1m1 genes, may influence, in a not understood way, the alterations observed in the tumor suppressors p53 and p27.

Multiple Sklerose (MS) ist eine heterogene Krankheit des Zentralnervensystems, deren pathologische Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Die gegenwärtige Hypothese ist, daß pro-inflammatorische T-Zellen entscheidend an der Pathogenese der MS beteiligt sind. Man geht davon aus, daß eine Fehlregulation der T-Zell-Kontrolle, möglicherweise bedingt durch ein Ungleichgewicht an Apoptose-regulierenden Molekülen, dabei eine Rolle spielt. Tatsächlich zielen therapeutische Strategien darauf ab, T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Produktion von Zytokinen zu verringern, oder T-Zell-Eliminierung zu fördern. Diese Arbeit sollte zum einen die Bedeutung regulatorischer Faktoren klären, die für das überleben der T-Zellen von MS-Patienten verantwortlich sind. Zum anderen sollten die antiproliferative oder Apoptose-fördende Wirkung potentiell therapeutisch wirksamer Moleküle untersucht werden. Eine eingeschränkte Regulation der autoreaktiven T-Zellen durch Apoptose in der Peripherie und im ZNS trägt möglicherweise zur Pathophysiologie der MS bei. Als Schlüsselfaktoren der Regulation von Apoptose wurden Mitglieder der Bcl-2-Familie in MS-Patienten und Probanden untersucht. Diese Faktoren wurden in Relation zu der Suszeptibilität der T-Zellen gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (sog. Activation-induced cell death oder AICD) überprüft. Um die in-vivo-Elimination der Antigen-reaktiven T-Zellen nachzuahmen, wurde ein in-vitro-Modell des AICD mit repetitiver T-Zell-Stimulation verwendet. Tatsächlich zeigten polyklonale T-Zellen von MS-Patienten eine verringerte Suszeptibilität für AICD, nachgewiesen sowohl durch verminderte Caspaseaktivtät (p=0.013) als auch durch DNA-Fragmentierung (p=0.0071). Weiter wurden höhere Spiegel des Proteins Bcl-XL in den Immunzellen von MS-Patienten mit Immunoblotting gemessen (p=0.014). Eine inverse Korrelation zwischen der Expression an Bcl-XL und der Empfindlichkeit der T-Zellen gegenüber AICD steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten bezüglich der Bedeutung dieses Proteins für die Apoptose-Resistenz von T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, daß dieses Molekül die Ausprägung der experimentell-autoimmun Enzephalomyelitis, des Tiermodells der MS, verstärkt. Zusammen mit den erhöhten Bcl-XL-Werten bei MS-Patienten, ergeben sich nun Perspektiven für einen therapeutischen Ansatz. Abgesehen von dem Konzept die apoptotische Eliminierung von T-Zellen zu unterstützen, streben gegenwärtige therapeutische Strategien an, die Aktivierung und weitere Proliferation der schädlichen T-Zellen zu hemmen. Basierend auf klinischer Erfahrung mit eher unselektiven Therapien, ist es ein therapeutisches Ziel, neue immunomodulatorische Substanzen mit besserer Selektivität zu finden, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis zu maximieren. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedliche Substanzen untersucht die beide den Zellzyklus beeinflussen. Als erster Kandidat wurde der kürzlich entdeckte Todesligand TRAIL (engl.: TNF-related apoptosis inducing ligand) aus der TNF/NGF-Familie untersucht, da diesem bereits T-Zell-regulatorische Funktionen zugeschrieben worden waren, humane Antigen-spezifische T-Zellen jedoch resistent gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind. Der zweite Kandidat mit potenziell therapeutischer Wirkung bei MS ist Atorvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der bereits als Lipidsenker bei Patienten eingesetzt wird. Um die Hypothese zu überprüfen, daß diese Substanzen T-Zell-Rezeptor-Signale beeinflussen können, wurden humane Antigen-spezifische T-Zell-Linien von MS-Patienten und gesunden Probanden eingesetzt. Diese wurden hinsichtlich T-Helfer-Phänotyp und Peptid-Spezifität charakterisiert. Eine Behandlung mit TRAIL führte zur Hemmung der Proliferation in unterschiedlichem Ausmaß (6.2% - 63.8%). Atorvastatin hemmte in Abhängigkeit von der Dosis ebenso die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ unabhängig von der Antigenpräsentation, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Abwesenheit von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen zu vermindern. Diese Eigenschaft weißt auf einen direkten Einfluß auf die T-Zell-Funktion hin. Die TRAIL-induzierte Hypoproliferation war assoziiert mit einer Herunterregulation der Zyklin-abhängigen Kinase CDK4 (engl.: cyclin dependent kinase 4), einem Schlüsselenzym für die nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation einsetzende Transition von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus. Inkubation mit Atorvastatin induzierte ebenso eine Verminderung von CDK4, begleitet von einer Erhöhung von p27Kip1. Die Atorvastatin-vermittelte Proliferations- und Zellzyklus-Blockade konnte durch Mevalonat rückgängig gemacht werden. Mevalonat ist ein Zwischenprodukt des HMG-CoA-Reduktaseweges. Atorvastatin scheint demnach einen direkten Einfluß auf diese Enzymkaskade zu haben, der wichtig für die Isoprenylierung von GTPase-Proteinen der Rho-Familie ist. T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern und nachfolgend zur Öffnung transmembranöser Kalzium-Kanäle (sog. calcium release-activated calcium oder CRAC-Kanäle), die eine für die T-Zellaktivierung notwendige und anhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration hervorruft. Nach Behandlung mit TRAIL wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition des Einstroms extrazellulärer Kalzium-Ionen durch die CRAC-Kanäle beobachtet. Dies wurde mit löslichem TRAIL-Rezeptor-Fusionsprotein, einem TRAIL-Antagonisten, rückgängig gemacht. Die Blockade von Kalzium-abhängigen Aktivierungssignalen stellt damit möglicherweise einen primären immunregulatorischen Mechanismus für diese Todesliganden dar. Jedoch wurde keine Auswirkung von Atorvastatin auf die T-Zellaktivierung beobachtet, da der Einstrom von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflußt wurde. Während Studien zum TRAIL-vermittelten Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung und dem Zellzyklus erst in der präklinischen Phase sind, werden Statine, die ebenfalls den Zellzyklus beeinflussen, bereits in der Therapie anderer Erkrankungen angewand. Darüber hinaus werden derzeit bereits klinische Studien mit Statinen zur MS-Therapie durchgeführt. Weitere Untersuchungen zu den detaillierten Mechanismen antiproliferativer Substanzen mit potenziellem therapeutischen Effekt in der MS ermöglichen die Entwicklung von selektiveren immunomodulatorischen Therapien mit höherem therapeutischen Nutzen für MS-Patienten. / Multiple sclerosis (MS) is a heterogeneous disease of the central nervous system whose pathological mechanisms are far from completely understood. The current hypothesis is that pro-inflammatory T cells are orchestrating the pathogenesis of this condition. It is considered that a dysregulation in T cell control to be involved, with an imbalance in apoptosis-regulating molecules possibly playing a role. In fact, therapeutic strategies aim to reduce T cell activation, proliferation and cytokine production or to promote T cell elimination. The focus of this thesis was to identify the role of regulatory molecules for T cell survival in the immune pathogenesis of MS, and to investigate antiproliferative or apoptosis-promoting effects on T cells by potential therapeutic molecules. A limitation in the apoptotic regulation of autoreactive T cells in the periphery and in the CNS may contribute to the pathophysiology of MS. As key regulators of apoptosis, members of the Bcl-2 family were investigated in both MS patients and controls. These factors were examined in relation to the susceptibility of T cells, from both groups, towards activation-induced cell death (AICD). To mimic the in vivo elimination of antigen-reactive T cells, an in vitro model of AICD involving repetitive T cell receptor mediated stimulation was utilized. In fact, polyclonal T cells from MS patients showed a decreased susceptibility to undergo AICD as shown by both caspase activity (p=0.013) and DNA fragmentation (p=0.0071) assays. Furthermore, Bcl-XL protein levels, as measured by immunoblotting, were increased in the peripheral immune cells of MS patients (p=0.014). An inverse correlation observed between Bcl-XL levels and susceptibility of T cells to undergo AICD is in line with previous data on the significance of this anti-apoptotic protein in T cell resistance. Since this molecule has already been shown to aggravate the outcome of experimental autoimmune encephalitis, the animal model for MS, the observation of elevated Bcl-XL levels in patients offers perspectives towards therapeutic manipulation in MS. Apart from promoting apoptotic elimination, current therapeutic strategies aim at inhibiting activation and further proliferation of potentially harmful T cells. Based on clinical experience with rather non-selective therapies that promote T cell elimination, a therapeutic goal is to identify newer immunomodulatory substances with better selectivity in order to maximize the therapy's benefit to risk ratio. Thus, two different substances, both interfering with cell cycle regulation, were investigated. The first candidate was the recently discovered member of the TNF/NGF family of death ligands, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) since it has been reported to have immunoregulatory functions and since human antigen-specific T cells were shown to be resistant towards apoptosis induction by this ligand. The second candidate drug with potential in MS therapy is atorvastatin, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme (HMG-CoA) reductase inhibitor and lipid-lowering drug, already indicated for anomalies in lipid metabolism. In order to prove the hypothesis that these substances interfere with T cell receptor signaling, human antigen-specific T cell lines from both MS patients and controls, characterized with regards to T helper differentiation and peptide specificity, were employed. Exogenous treatment of TRAIL resulted in an inhibition in proliferation, albeit to varying degrees (6.2% - 63.8% inhibition). Atorvastatin also inhibited proliferation of antigen-specific T cell lines in a dose-dependent manner. Both compounds induced hypoproliferation independently of antigen presentation, as shown by their ability to block T cell proliferation in response to direct T cell receptor engagement, thus indicating a direct influence on T cell function. The growth inhibition by TRAIL was associated with a downregulation of the cell cycle regulator CDK4, indicative of an inhibition of cell cycle progression at the G1/S transition. Incubating T cells with atorvastatin also induced a downregulation of CDK4 expression, which was accompanied by an upregulation of p27Kip1 expression. The atorvastatin-mediated inhibition in proliferation and cell cycle progression could be reversed by mevalonate, an intermediate product of the HMG-CoA reductase pathway, suggesting a direct involvement of atorvastatin in this pathway, necessary for the isoprenylation of small GTPase proteins of the Rho family. Utilizing a thapsigargin model of calcium influx to activate the same calcium-release activated calcium (CRAC) channels as T cell receptor-stimulation by antigen, an inhibition in calcium influx could be observed on pre-incubating T cells with TRAIL. Co-incubating with human recombinant TRAIL receptor 2 fusion protein, a competitive antagonist for TRAIL, reversed this inhibition. A direct influence on calcium influx is indicative of an influence of TRAIL on the activation status of human T cells. Therefore, TRAIL directly inhibits activation of these cells via blockade of calcium influx. However, no impact of atorvastatin on early T cell activation was observed, since calcium influx was unaffected. While TRAIL-mediated interference with T cell activation and further cell cycle progression is still in the pre-clinical phase, statins, which have also been shown here to interfere with the T cell cycle, are already employed in the clinic for other ailments. In fact, clinical trials are currently being undertaken with this group of drugs for MS. Further studies on detailed mechanisms of antiproliferative substances effective in MS will allow the development of highly selective immunomodulatory agents with increased beneficial profile as MS therapy.