Le lysosome est un organite acide qui contient de nombreuses hydrolases responsables de la dégradation d’une grande variété de molécules issues majoritairement des voies d’endocytose et d’autophagie. La membrane de l’organite contient, elle aussi, un certain nombre de protéines qui assurent diverses fonctions telles que la génération d’un gradient de pH intralysosomal, la translocation de produits de dégradation vers le cytosol, la régulation des contacts membranaires, etc. Cependant, au vu de la grande diversité des produits générés par l’hydrolyse intralysosomale et susceptibles d’être transportés vers le cytosol, et de la complexité des mécanismes de contact/fusion/fission qui impliquent la membrane lysosomale, il est hautement probable que de nombreuses protéines membranaires restent à être identifiées. Nous avons mis en évidence un nouveau candidat membranaire lysosomal au cours d’une analyse protéomique réalisée sur des fractions enrichies en membranes de lysosomes. Cette protéine de 372 acides aminés, que nous avons dénommée p40, présente de nombreux segments transmembranaires prédits, quatre motifs potentiels d’adressage aux lysosomes et une homologie de séquence partielle avec des transporteurs de sucres nucléotidylés. Nous avons recherché la localisation de p40 dans la cellule par des techniques de fractionnement subcellulaire, appliquées sur le foie de souris. Nous avons comparé la distribution de cette protéine au sein des fractions obtenues par centrifugation différentielle et par centrifugation isopycnique sur un gradient continu de saccharose (avec et sans traitement préalable de la souris avec du Triton WR-1339) à celles de protéines marqueurs des organites. Nous avons combiné cette approche à une analyse morphologique par microscopie à fluorescence confocale de la localisation de p40 dans des cellules eucaryotes transfectées. Nos résultats nous ont permis de démontrer la localisation lysosomale de p40. D’autre part, nous avons mis en évidence que le temps de demi-vie de p40 est d’environ 10 heures et que p40 est une protéine dépourvue de chaînes oligosaccharidiques, fortement associée aux membranes. Nous avons ensuite entrepris de rechercher une possible activité de transport pour p40, suggérée par l’homologie de séquence détectée avec des transporteurs connus. Pour cela, nous avons utilisé une technique d’électrophysiologie perfectionnée, bien adaptée à la réalisation d’un large criblage de substrats potentiels d’une hypothétique activité de transport. Bien que nous ayons testé près de 70 composés au total, nous n’avons pas mis en évidence la fonction de p40 par cette approche. Dans un troisième temps, nous nous sommes intéressés à la façon dont la protéine p40 néosynthétisée est spécifiquement ciblée vers les lysosomes. Nous avons muté les quatre motifs potentiels d’adressage aux lysosomes présents dans la séquence de p40 et nous avons observé l’impact de ces mutations sur sa localisation subcellulaire. Ces travaux ont révélé que l’envoi de p40 vers les lysosomes est assuré par un signal de type « dileucine » situé 11 résidus en amont de l’extrémité C-terminale de la protéine : le motif EQERL360L361. En effet, la substitution des deux résidus leucine critiques par d’autres acides aminés abolit le transport de la protéine p40 vers les lysosomes et induisait son envoi vers la membrane plasmique. En conclusion, notre recherche visant à caractériser p40 montre que cette protéine nouvellement identifiée est une protéine membranaire lysosomale non glycosylée, ciblée vers les lysosomes à partir du TGN par un signal d’adressage EQERL360L361 localisé dans sa queue C-terminale. Des études complémentaires sont nécessaires afin de cerner la fonction assurée par p40 au sein de la membrane des lysosomes.

Made available in DSpace on 2018-08-01T21:35:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_12099_Dissertação_Isabella Bittencourt da Valle.pdf: 8090609 bytes, checksum: 6e09574c3fb07de58cf9e66e8e26d822 (MD5) Previous issue date: 2018-04-23 / O prognóstico de pacientes com Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) é majoritariamente desfavorável, principalmente devido à elevada taxa de recidiva e mortalidade. Até o momento, não existem marcadores biológicos clinicamente disponíveis que indiquem eventos de transformação tumoral ou prognóstico em CEO. Portanto, grande interesse tem sido direcionado aos genes reguladores do ciclo celular, como a participação da expressão gênica de P63 na oncogênese através da sua atividade na regulação da proliferação e diferenciação celular em CEO. Este trabalho teve como objetivo analisar a aplicabilidade de p63 como biomarcador de prognóstico e progressão tumoral. Realizou-se estudo multicêntrico internacional, no qual foram obtidas amostras biológicas, dados clínicos e seguimento clínico de 109 indivíduos com CEO provenientes do Brasil e Reino Unido. As lâminas histológicas obtidas foram avaliadas quanto à gradação tumoral, infiltrado linfocitário tumoral (TIL), padrão de invasão tumoral e invasão perineural, vascular e linfática. Tissue Microarray (TMA) foi construído considerando 3 áreas: epitélio adjacente ao tumor, displasia e tumor. Os TMAs foram submedidos à imunohistoquímica para análise de expressão de p63 e p40 (&#916;Np63) e hibridização in situ de RNA para investigar p63 mRNA. Para avaliar a expressão de p63 e p40 foi considerada a marcação nuclear em queratinócitos através de H-Score. A avaliação de p63 mRNA se deu por um guia de pontuação (score 0-4) conforme a quantidade de pontos em cada célula. O nível de significância considerado para todos os testes estatísticos foi de 95%. Teste Qui-Quadrado foi empregado para instituir associações entre as variáveis clinico-patológicas estudadas. A comparação entre a expressão da proteína p63, p40 e de p63 mRNA nas diferentes regiões foi realizada através do teste de Wilcoxon. Curvas de sobrevida global e sobrevida livre de doença foram obtidas pelo modelo de Kaplan-Meier e regressão de Cox. Nossos resultados mostraram associação entre a elevada presença de TIL no tumor com estadiamentos iniciais (p=0,001) enquanto tabagismo mostrou relação com menor TIL (p=0,044) e padrões de invasão tumoral dos tipos III e IV (p=0,032). Indivíduos etilistas/ex-etilistas apresentaram mais invasão vascular que os não etilistas (p=0,015). A expressão de p63 nos tumores foi maior que nas displasias (p=0,001) e foi associada a tumores maiores (T3 e T4) (p=0,001). Foi observada diferença quanto à expressão de p40 entre displasia e tumor (p<0,001) e displasias de alto risco apresentaram alta expressão de p40 (p=0,022). A elevada expressão de p40 tumoral mostrou associação com tumores pouco diferenciados (p=0,010) e com invasão de vasos linfáticos (p=0,022). Não foi observada diferença de expressão de p63 mRNA entre as regiões estudadas. Indivíduos com estadios iniciais (p=0,001) e não tabagistas (p=0,035) tiveram maior sobrevida global. Mostraram pior sobrevida livre de doença indivíduos cujos padrões de invasão tumoral eram III e IV (p=0,014) e que apresentavam tumores maiores (p=0,004). Concluímos com este estudo que a expressão de p63, de p40, são úteis como marcadores de progressão tumoral, mas não comportam-se como bons marcadores de prognóstico uma vez que não mostraram influenciar os índices de sobrevida global e sobrevida livre de doença.

Detta är en fallstudie där två olika Laserskannrar jämförs. Dessa skannrar skiljer sig då de använder två skilda metoder för punktmolnsregistrering. Dessa två metoder är: SLAM (Simultaneous Localization and Mapping) -baserad punktmolnsregistrering och punktmolnsregistrering med den indirekta två-stegs-metoden. Målet med projektet var således att granska den statiska SLAM-baserade skannern Leica RTC 360 3D och jämföra den med den mer traditionsenliga terrestra laserskannern Leica Scanstation P40. Denna undersökning är relevant eftersom det finns en tydlig skillnad mellan dessa laserskannrar både ur en planerings- och en effektivitetssynpunkt. Den statiska SLAM skannern RTC 360 har möjligheten att vara väldigt tidseffektiv då den använder sig av SLAM algoritmen VIS (Visual Inertial System) för punkmolnsregistrering i fält, samt att skannern använder en IMU (Inertial Measurement Unit) som möjliggör skanningar med hög kvalitet utan att instrumentet är ordentligt horisonterat. Vilket är en förutsättning för att kunna genomföra en skanning med P40. Punktmolnen från dessa två laserskannrar jämförs med varandra och granskas visuellt för att analysera vilka skillnader som finns mellan dem. Samma punktäthet används och skanningarna genomförs från samma positioner med båda instrumenten. Utöver detta görs en statistisk undersökning med hjälp av kontrollpunkter och RMS-värden beräknas med hjälp av dessa. För att tillåta denna statistiska analys, georefererades båda punktmolnen med indirekt georeferering till referenssystemet SWEREF 99 16 30 i plan samt RH 2000 i höjd. Just denna process var något enklare att genomföra med P40 än med RTC 360. Då P40 data var något bättre anpassat för bearbetning i Leica Cyclone. Vilket var de program som främst användes för bearbetning av data. RTC 360 använder två pulser för att skanna in varje punkt, vilket resulterade i att den skannade in något fler punkter. Framförallt märktes denna funktion på områden som traditionellt är svåra att skanna med en laserskanner, främst blanka, svarta områden. Det visade sig av kontrollpunkterna att det fanns en liten variation mellan punktmolnenskvalitet där lasersdata från P40 höll 1–2 millimeters kvalitet. Ur detta resultat kunde slutsatsen dras att Leica Scanstation P40 är något bättre för geodetiska ändamål med mycket höga krav på georefereringen. I det flesta andra sammanhang är RTC 360 att rekommendera. Leicas RTC 360 är ett bra exempel på hur SLAM-algoritmen kan användas för att förenkla många laserskanningsprojekt. Även i de projekten med höga krav på detaljrikedom. / This is a case study which aims to compare two different laser scanners. The main difference between these two scanners is that they use different solutions for registration of point clouds. These two solutions are SLAM (Simultaneous Localization and Mapping) as well as the indirect two-step approach. The thesis aims at comparing the static SLAM-based scanner Leica RTC 360 with the more traditional scanner Leica Scanstation P40. This is a relevant study due to the big differences between these two scanners, in the aspect of both how much preparation that is need and how effective both scanners are. The static SLAM scanner RTC 360 has the possibility to be very time efficient due to use of the SLAM-algorithm called VIS (Visual Inertial System) that are used for alignment of different point clouds as early as in the fieldwork. The RTC 360 also uses an IMU (Inertial Measurement Unit) that allows the laser scanner to do complete and detailed scans without the need to be perfectly levelled. The P40 on the other hand do need to be precisely levelled to be able to complete a scan. The point clouds from these two laser scanners are compared with each other by reviewing the visual features of the two clouds and finding differences between the point clouds. The same point density was used in both clouds and the scans took place from the same positions with both scanners. A statistical comparison was also made. This statistical analysis was made with use of control points and RMS values that were established with the help of these. This statistical analysis was made possible by the fact that both point clouds were georeferenced to the reference system SWEREF 99 16 30 as well the system RH 2000 for height. This process of georeferencing both clouds was easier to perform with the P40 than the RTC 360. Because the laser data from P40 were slightly better suited for the program Leica Cyclone, which were the program that was used for most of the data processing. RTC 360 uses two individual laser-pulses for each scanned point. This resulted in that the RTC 360 scanned some more points compared to the P40. This difference was extra noticeable on surfaces that usually are difficult for laser scanners to scan, such as plain, black surfaces. The control points showed that quality of both point clouds was very similar to each other. The P40 showed slightly higher accuracy, about 1-2millimeter, relative to the RTC 360 scanner. This resulted in the conclusion that P40 were slightly better for geodic purposes with very high demands on the georeferencing. In most of the other cases RTC 360 is the recommended scanner. Leica RTC 360 is a good example of how the SLAM-algorithm can be used to make many laser scanning projects easier and more efficient.

Thesis (Ph.D.)--University of Alabama at Birmingham, 2008. / Title from first page of PDF file (viewed on June 24, 2009). Includes bibliographical references (p. 88-101).