Submitted by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-05-18T17:10:51Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alessandro Fernandes Vaz - 2014.pdf: 2674595 bytes, checksum: 4be2a3df9927e868ec83389dd6ab3365 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Erika Demachki (erikademachki@gmail.com) on 2015-05-18T17:13:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alessandro Fernandes Vaz - 2014.pdf: 2674595 bytes, checksum: 4be2a3df9927e868ec83389dd6ab3365 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-18T17:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Alessandro Fernandes Vaz - 2014.pdf: 2674595 bytes, checksum: 4be2a3df9927e868ec83389dd6ab3365 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-07-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Paracoccidioides spp. is the etiological agent of paracoccidioidomycosis, the most important endemic systemic mycosis in Latin America. Paracoccidioides spp. is a dimorphic fungus; mycelia is found in soil at temperatures below 25ºC, while in host tissues, and temperature around 36-37ºC the fungus takes the yeast form. Infection begins with the inhalation of conidia or mycelia propagules that upon reaching the host lungs differentiate into yeast, establishing disease. The morphological transition from mycelia-to-yeast is involved in the virulence of this pathogen and this aspect of morphogenesis deserves special attention due to its relevance to the fungal virulence. In the present study, we employed proteomic strategies using liquid chromatography coupled to mass spectrometry to evaluate the differential proteomic profile of cells ongoing transition from mycelia-to-yeast after 22 h of temperature shift from 22ºC to 36ºC (P. brasiliensis Pb-18 phylogenetic lineage S1). Nine hundred and ninety-one proteins were identified (350 in the mycelia, 288 in the transition and 353 in the yeast), and 251 were differentially regulated. The analysis of the functional categories to which those proteins belong provided us a comprehension on the metabolic reprogramming that occurs during the cell differentiation process, providing putative virulence factors. / Paracoccidioides spp. é o agente etiológico da paracoccidioidomicose, a mais importante micose sistêmica endêmica da América Latina. Paracoccidioides spp. é um fungo dimórfico, que apresenta alteração morfológica de acordo com a temperatura do ambiente. A forma miceliana é encontrada no solo a temperaturas inferiores a 25 ºC, enquanto que em tecidos do hospedeiro e sob temperaturas de 36-37 ºC o fungo assume forma leveduriforme. A infecção se inicia com a inalação de conídios presentes na forma filamentosa do fungo, os quais ao atingirem os pulmões se diferenciam na forma leveduriforme, estabelecendo a paracoccidioidomicose. A transição de micélio para levedura está envolvida na virulência desse patógeno e esse aspecto da morfogênese do fungo não está totalmente compreendido. No presente estudo, foi utilizada a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (nanoUPLC-MSE) para avaliar o perfil proteômico durante a transição de micélio para levedura após 22 h da mudança da temperatura de 22ºC para 36ºC (P. brasiliensis – isolado Pb18). Um total de 991 proteínas foram identificadas (350 em micélio, 288 na transição e 353 em levedrua) e 251 foram diferencialmente expressas durante o processo de diferenciação celular. Entre as proteínas que foram abundantes em micélio estão as subunidades da ATPase que participa na cadeia transportadora de elétrons e enzimas envolvidas na fermentação alcoólica. Proteínas relacionadas à via glicolítica e alguns potenciais fatores de virulência começam sua acumulação após 22 h do início da transição morfológica. Em levedura enzimas relacionadas com a glicólise e a beta-oxidação tiveram alta expressão. As análises das categorias funcionais a que essas proteínas pertencem, forneceram uma melhor compreensão da reorganização metabólica que ocorre durante a transição morfológica de micélio para levedura, incluindo possíveis fatores de virulência.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-02-06T18:00:08Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Francinete Faustino da Silva - 2014..pdf: 2636030 bytes, checksum: 541cdc7c62049af013a9e3343fd197d1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-02-19T14:26:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Francinete Faustino da Silva - 2014..pdf: 2636030 bytes, checksum: 541cdc7c62049af013a9e3343fd197d1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-02-19T14:26:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Paula Francinete Faustino da Silva - 2014..pdf: 2636030 bytes, checksum: 541cdc7c62049af013a9e3343fd197d1 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-04-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Nearly 60% of the Paracoccidioides genes encode proteins annotated as hypothetical proteins or predicted proteins (HPs). Transcriptomes studies revealed 2364 HPs expressed in mycelium and yeast form; during the transition from mycelium to yeast; and under conditions that mimic the infection pathway. In this study, we describe a global detection and functional inference for the HPs in Paracoccidioides. For these analysis we used computational methods based on sequence similarity, search for targeting signals, presence of known protein domains and also a functional classification based on Gene Ontology. Our analysis allowed the HPs to be classified into different functional categories such as metabolism, organelle organization, cell communication, protein localization, cell cycle, signaling and cell differentiation. We also performed a functional enrichment analysis of the transcripts expressed under different growth conditions. The best represented functional domains are those involved in the regulation of gene expression, suggesting that these HPs may be involved in regulation of the gene response and adaptation. The transcriptional profiling of six HPs confirms that they are highly expressed in the presence of human blood and plasma and also during phase transition, a crucial event for establishment of the infection process. Additionally, we have cloned and expressed the gene encoding the hypothetical protein PAAG_08614 from Pb01. The transcript and protein expression were evaluated by qPCR e western-blot, respectively. PAAG_08614 is preferentially expressed in mycelium and during mycelium to yeast transition. This work constitutes the first large-scale characterization of the proteins of unknown functional from Paracoccidioides spp. and helps the functional assignment of hypothetical proteins, as well as the understanding of the data generated from structural and functional genome. / Aproximadamente 60% dos genes de Paracoccidioides ssp. codificam proteínas anotadas como proteínas hipotéticas ou proteínas preditas (HPs). Estudos Transcricionais revelaram 2.364 HPs foram expressas nas fases de micélio e levedura; durante a transição de micélio para levedura; e em condições que mimetizam as vias de infecção. Neste estudo, descrevemos uma detecção global e inferência funcional para as HPs de Paracoccidioides. Para essas análises foram utilizados métodos computacionais baseados na similaridade de sequência, procurar de peptídeos de sinais, presença de domínios de proteínas conhecidas e também uma classificação funcional baseada no Gene Ontology. Nossa análise permitiu a classificação das HPs em diferentes categorias funcionais, tais como o metabolismo, organização de organela, comunicação celular, localização de proteínas, ciclo celular, sinalização e diferenciação celular. Também realizamos uma análise de enriquecimento funcional dos transcritos expressos em diferentes condições de cultivo. Os domínios funcionais mais bem representados são os envolvidos na regulação da expressão gênica, o que sugere que estas proteínas estão envolvidas na regulação da resposta e adaptação do fungo às diferentes condições impostas pelo ambiente. A análise do perfil transcricional de seis HPs confirmou que elas são altamente expressas na presença de sangue e de plasma humano e também durante a fase de transição, um evento crucial para o estabelecimento do processo de infecção. Adicionalmente, o gene que codifica a proteína hipotética de PAAG_08614 de Pb01 foi clonado e expresso. A expressão dos transcritos e proteínas foram avaliadas por qPCR e western-blot, respectivamente. A PAAG_08614 é preferencialmente expressa na fase de micélio e durante a transição micélio para levedura. Este trabalho representa a primeira caracterização em grande escala das proteínas de função desconhecida de Paracoccidioides spp. e ajuda na atribuição funcional de proteínas hipotéticas, assim como uma melhor compreensão dos dados gerados a partir do genoma estrutural e funcional.

Submitted by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-15T19:59:02Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Matias (lua_matias@yahoo.com.br) on 2015-05-19T14:14:18Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-19T14:14:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite - 2014.pdf: 2374224 bytes, checksum: bbdd09c7a011fbfa20239423f0d7f3fb (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2014-03-13 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The fungi of the genus Paracoccidioides sp are etiologic agents of disease paracoccidioidomycosis (PCM), are termodimórficos and have the ability to move the saprobiótica form to yeast form at a temperature around 37 ° C. The uptake is essential for the growth and adaptation of the fungus in host tissue, where nitrogen-dependent pathways have close relationship with pathogenicity. Pathogenic organisms possess a regulatory system called Nitrogen Catabolic Represion which is induced when nitrogen availability is limiting in surround causing the expression of genes necessary for nutrient uptake when preferred sources such as glutamine and ammonia are scarce. This regulatory process comprises a complex system in the infectious process. This study aims to identify proteins regulated by nitrogen depletion, where the pathogenic fungus Pb01-like was analyzed as a proteomic response. Pb01-like was grown in minimal medium control MMcM (+N) and treated MMcM (-N) for 6 hours at 37 ° C, cytoplasmic proteins were extracted and subjected to tryptic digestion and quantification. The proteomic profile revealed an expression of 135 proteins, 40 proteins induced or identified the treaty, 58 repressed or identified control and 44 proteins were expressed constitutively. In silico analyzes showed that the gene is regulated by formamidase areA transcription factor that responds conditions of nitrogen depletion in Aspergillus nidulans and the surrounding medium the enzymatic activity for the gene of formamidase Pb01-like induced depletion of nitrogen during. The amino acid sequence of the regulatory gene areA important in the metabolism of nitrogen was aligned between Pb01-like, Pb18, Aspergillus nidulans and Neurospora crasssa where this alignment showed high identity and homology of conserved zinc finger domains and DUF 1752. Metabolic pathways such as fermentation, gluconeogenesis, protein synthesis, nitrogen metabolism were induced for the depletion of nitrogen, showing a possible modulation of the metabolism of the fungus in order to be able to adapt to environments with nitrogen limitation. / Os fungos do genêro Paracoccidioides sp são agentes etiológicos da doença paracoccidioidomicose (PCM), são termodimórficos e possuem a capacidade de transitar da forma miceliana para a forma de levedura à temperatura em torno de 37°C. A captação de nitrogênio é essencial para o crescimento e adaptação do fungo em tecido hospedeiro, onde vias dependentes de nitrogênio possuem estreita relação com a patogenicidade. Organismos patogênicos possuem um sistema regulatório conhecido como Nitrogen Catabolic Repression que é induzido quando a disponibilidade de nitrogênio é limitante no meio, ocasionando a expressão de genes necessários para a captação do nutriente quando fontes preferenciais como a glutamina e amônia estão escassas. Esse processo regulatório compõe um complexo sistema no processo infeccioso. Este trabalho tem o objetivo de identificar proteínas reguladas pela depleção de nitrogênio, onde o fungo patogênico Pb01-like foi analisado quanto sua resposta proteômica. Pb01-like foi cultivado em meio mínimo controle MMcM (+N) e tratado MMcM (-N) por 6 horas a 37°C, as proteínas citoplasmáticas foram extraídas e submetidas a quantificação e digestão triptica. O perfil proteômico revelou uma expressão 135 proteínas, sendo 40 proteínas induzidas ou identificadas apenas no tratado, 58 proteínas reprimidas ou identificadas apenas no controle e 44 foram expressas constitutivamente. Análises in silíco revelou que o gene da formamidase é regulado pelo fator de transcrição areA, em Aspergillus nidulans que responde as condições de depleção de nitrogênio do meio circundante sendo a atividade enzimática para o gene da formamidase de Pb01-like induzida durante a depleção de nitrogênio. A sequência de aminoácidos do fator de transcrição areA importante regulador do metabolismo de nitrogênio foi alinhado entre Pb01-like, Pb18, Aspergillus nidulans e Neurospora crasssa onde esse alinhamento demonstrou uma alta identidade e homologia dos domínios conservados dedo de zinco e DUF 1752. Vias metabólicas como a fermentação, gliconeogênese, síntese de proteínas, metabolismo de nitrogênio estavam induzidas durante a depleção de nitrogênio, demonstrando uma possível modulação do metabolismo do fungo afim de conseguir adaptar-se a ambientes com limitação de nitrogênio.

Submitted by Franciele Moreira (francielemoreyra@gmail.com) on 2017-08-04T16:47:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Juliana Santana de Curcio - 2014.pdf: 2001377 bytes, checksum: 2f9ef22cd0a300cc93ee483fab0fb9c1 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T15:54:46Z (GMT). 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Therefore the knowledge of the constitution of the proteins of membranes is important to understand some processes developed by Paracoccidioides sp. for its growth and survival within the host. To this end, two techniques of separation and identification of proteins were employed. The first methodology used two-dimensional electrophoresis and mass spectrometry, where the extract of membranes proteins was obtained after steps of ultracentrifugation and the second methodology used liquid chromatography coupled with mass spectrometry, to this methodology three protocols were employed to obtain the extract of membranes proteins. The first methodology employed ultracentrifugation, and the second e third methodology used ultracentrifugation/sonication and ultracentrifugation with elevation of pH respectively. After these steps, the extract of membranes proteins was obtained through of ultracentrifugation and elevation of pH with sodium carbonate. Transmission Electron Microscopy (TEM) was performed to confirm the quality of the sample, a fraction enriched in cell membranes of Paracoccidioides sp.. Posteriorly the proteins obtained by standard methodology were subjected to tryptic digestion and analyzed by NanoUPLC-MSE.. In silico analyzes of the identified proteins were performed to determine the location and possible association of the proteins with the cell membranes. From total of proteins identified, one hundred thirty -three proteins were identified as belonging the cell membranes of Paracoccidioides sp.. Eighty-eight proteins showed at least one transmembrane domain and thirteen identified proteins showed a signal peptide at the N-terminus, beyond the transmembrane domain. Different forms of association of the proteins with membranes of Paracoccidioides sp. were detected, including domain transmembrane, GPI anchor, prenylation, myristoylation, palmitoylation. The most of the of integral membrane proteins identified in proteome were annotated in the genome of Paracoccidioides sp. Together these results show the establishment of an experimental protocol for the extraction of membranes proteins of Paracoccidioides spp., as well identify proteins from membrane fractions this fungus. / Paracoccidioides spp. representa um gênero de fungos termodimórficos, agentes etiológicos da paracoccidioidomicose, a micose sistêmica mais comum na América Latina. Durante o processo infeccioso proteínas localizadas em membranas celulares são responsáveis por muitos processos essenciais para a sobrevivência do patógeno, como transporte de nutrientes, adesão, sinalização e produção de energia. Basicamente membranas celulares são constituídas de uma bicamada lipídica com proteínas associadas. As proteínas de membranas associam-se a bicamada lipídica através de domínios transmembrana, por adição de uma modificação pós traducional e por meio de interações eletrostáticas. Portanto, o conhecimento da constituição proteica das membranas de Paracoccidioides sp. permite entender alguns dos processos desenvolvidos pelo fungo para sobrevivência dentro do hospedeiro. Desta forma o presente trabalho teve como objetivo à determinação da metodologia para obtenção de proteínas de membranas e a consequente descrição dessas proteínas. Para este fim, duas técnicas de separação e identificação de proteínas foram empregadas. A primeira metodologia baseava-se em eletroforese bidimensional e espectrometria de massas onde o extrato proteico de membranas foi obtido após duas etapas de ultracentrifugação e a segunda metodologia utilizava cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas, para esta metodologia três protocolos foram empregados no intuito de obter extratos proteicos de membranas. O primeiro protocolo emprega ultracentrifugação e o segundo e terceiro protocolo empregava ultracentrifugação/sonicação e ultracentrifugação combinado com elevação do pH respectivamente. Após as etapas de padronização do protocolo, o extrato proteico de membranas foi obtido através de ultracentrifugação e solubilização com carbonato de sódio em pH elevado. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) foi realizada para confirmar a qualidade da amostra enriquecida com a fração de membranas de Paracoccidioides sp.. Posteriormente o extrato proteico de membranas proveniente da metodologia padronizada foi submetido à digestão tríptica e analisado por NanoUPLC-MSE. Análises in silico das proteínas identificadas foram realizadas a fim de se determinar a localização destas proteínas e possíveis associações com as membranas. Do total de proteínas identificadas cento e trinta e três proteínas foram classificadas como pertencentes a membranas celulares de Paracoccidioides sp., oitenta e oito proteínas apresentaram ao menos um domínio transmembrana e treze proteínas, além de domínio transmembrana apresentaram um peptídeo sinal na porção N-terminal da proteína. Diferentes formas de associação com as membranas de Paracoccidioides sp. foram identificadas neste trabalho, incluindo domínio transmembrana, âncora de GPI, prenilação, palmitoilação e miristoilação. A maioria das proteínas integrais de membrana identificadas no proteoma já foram anotadas no genoma deste fungo. Juntos estes resultados demonstram o estabelecimento de um protocolo experimental para a extração de proteínas de membranas de Paracoccidioides spp., bem como identificam as proteínas de frações de membranas do fungo.