Abstract Bone is a highly vascularized tissue which enables a close interaction between blood vessels and osteoid complexes, including osteoblasts and osteoclasts. Iatrogenic bone loss, caused by a surgical intervention or trauma, disrupts circulation in the bone and leads to hypoxia and even necrosis of the adjacent bone. The mechanisms of the bone tissue healing process by regeneration are highly specific. The most common and predictable way to manage a large-sized skull bone defect has traditionally been using the patient’s own bone tissue graft. The problem with the method is damage and pain of the donor site caused by the operation and healing problems. In paediatric patients, there is a limited availability of adequate autologous bone grafts. For this reason, efforts have been made to develop substitute materials in order to avoid the need for large bone grafts. Autologous stem cells have proven to be promising targets for the development of bone substitutes for cranio-maxillofacial bone defects. The main objective of this study was to examine, by using an experimental animal model, differences in the healing of critical-sized calvarial bone defects, similar to cranioplasty, induced with different types of autogenous bone grafts and with adipose tissue- or bone marrow-derived stem cells grown in two commonly used biomaterials, tricalcium phosphate and bioglass. We also investigated the effect of tissue adhesive, fibrin glue, on the healing process of bone defects. The effect of the stimulating growth factor proteins BMP-2, BMP-7 and VEGF on tissue transplants and ossification was also studied. The results of this study support the previously reported findings of accelerated bone graft resorption associated with autologous bone graft use. In particular, the use of fibrin tissue glue in combination with autologous particulated bone grafts reduced the formation of new bone in calvarial lesions. During the initial healing of calvarial bone defects, tricalcium phosphate granules proved to be more effective than solid bioactive glass scaffolds. Furthermore, in combination with adipose-derived stem cells, tricalcium phosphate showed better bone regeneration than the same cells in combination with a bioactive glass scaffold. Combining bone marrow-derived stem cells with biomaterial did not increase bone formation in calvarial critical-sized defects. In this study, there was no evidence of the positive effect of growth factors on cranial bone healing. / Tiivistelmä Luu on runsaasti verisuonitettua kudosta, ja se mahdollistaa tiiviin vuorovaikutuksen verisuonten ja luun rakenteen perusyksikön, osteonin, sekä toiminnallisten solujen osteoblastien ja osteoklastien välillä. Kirurgisen toimenpiteen tai trauman aiheuttama luun vaurio häiritsee luun verenkiertoa ja johtaa hapenpuutteeseen ja jopa nekroosiin vaurioituneessa luun osassa. Luukudoksen paranemisen ja uudistumisen mekanismit ovat pitkälle erilaistuneita ja ne tunnetaan erittäin hyvin. Yleisin ja ennusteeltaan luotettavin tapa korjata laajoja kallon luukudoksen puutoksia on perinteisesti ollut potilaan oman luukudossiirteen käyttö. Menetelmän ongelmana on siirteen luovutuskohdan vaurio ja kipu sekä paranemiseen liittyvät ongelmat. Erityisesti lapsipotilailla on haasteena riittävän siirreluumäärän rajoitettu saatavuus. Tästä syystä on pyritty kehittämään korvaavia materiaaleja, jotta vältettäisiin suuriin luusiirteisiin liittyviä ongelmia. Autologiset kantasolut ovat osoittautuneet lupaaviksi kehitettäessä luuta korvaavia hoitomuotoja kallon luupuutosten hoitoon. Tämän tutkimuksen päätavoitteena oli tutkia kokeellisen eläinmallin avulla laajojen, kallokirurgiassa aiheutuvia luupuutoksia vastaavien vaurioalueiden paranemista. Tutkimuksessa testattiin erityyppisiä autogeenisiä luusiirteitä ja rasvakudos- tai luuydinperäisiä kantasoluja, joita kasvatettiin kahden biomateriaalin, trikalsiumfosfaatin ja bioaktiivisen lasin pinnoilla. Tutkimuksessa selvitettiin myös fibriinikudosliiman vaikutusta omakudosluusiirteen paranemiseen. Kudoskasvutekijäproteiinien BMP-2, BMP-7 ja VEGF stimuloivaa vaikutusta kudossiirteiden toimintaan ja luutumiseen selvitettiin myös. Tämän tutkimuksen tulokset tukevat aiemmin raportoituja havaintoja autologisen luusiirrännäisen käyttöön liittyvästä nopeasta resorptiosta. Erityisesti fibriinikudosliiman käytön yhdessä autologisten pienipartikkelisten luusiirteiden kanssa havaittiin heikentävän uuden luun muodostumista kallon luupuutoksissa. Kallon luupuutosten alkuvaiheen paranemisessa rakeinen trikalsiumfosfaatti osoittautui tehokkaammaksi kuin kiinteä säikeinen bioaktiivinen lasi. Samoin rasvakudosperäisten kantasolujen yhdistäminen trikalsiumfosfaattiin lisäsi merkittävästi luun muodostumista verrattuna samaan yhdistelmään bioaktiivisen lasin kanssa. Luuydinperäisiä kantasoluja yhdistettäessä vastaavaa ei voitu tässä tutkimuksessa todeta. Tutkimuksessa kasvutekijöiden käytöllä ei havaittu olevan positiivista vaikutusta kallonluiden paranemiseen.

Abstract Various bone proteins and growth factors are needed during the bone healing cascade. If the body cannot produce sufficient quantities of these factors, bone trauma healing can be improved with an implant that contains the required growth factors. However, an added bone protein extract needs a suitable delivery system to protect the proteins from degradation and to release them gradually, promoting new bone formation. This study focused on evaluating and optimization of the bone forming capacity of various scaffold systems of reindeer bone protein extract formulations using different experimental models. The tested carrier systems for various reindeer bone protein extract doses were collagen sponge and bioactive glass granules in critical-size defect model of rat femur. Calcium salt compositions (beta-tricalcium phosphate (β-TCP), hydroxyapatite or calcium sulphate) in disc and compressed pellet forms were tested in the thigh muscle pouch model of mouse. Various β-TCP granules combined with polyethylene/glycerol and stearic acid gel were tested in a hole defect model of sheep femur and humerus. Control groups involved carrier materials with no protein extract or untreated defects. In the sheep study, reference materials also included autograft and demineralized bone matrix (DBM). New bone formation, bone healing, and carrier resorption were evaluated based on radiographs, peripheral computerized tomography (pQCT), mechanical tests, histological examination, and micro-CT. New bone formation and bone union were markedly better in groups receiving higher doses of the extract and with follow-ups of six or more weeks, compared to empty defect or carrier without extract. Resorptions of carrier materials in active groups were faster and more active than in the control groups. The greatest bone formation occurred in the groups that had the bone protein extract readily available, which indicated that bone forming factors are required in sufficient concentrations at an early stage. The micro-CT analysis showed that bone formation in the groups with the extract was comparable to autograft, while the least bone formation was observed in the DBM and untreated groups. The present study indicated that the tested reindeer bone protein extract can be used to improve bone formation with various carriers. The study suggests that an inorganic carrier material together with stearic acid is the one of most suitable carrier alternatives for this extract. The developed medical device in paste form can be an alternative for autograft use. / Tiivistelmä Luun paraneminen vaatii erilaisia proteiineja ja kasvutekijöitä. Jos elimistö ei pysty tuottamaan riittävää määrää näitä tekijöitä, luumurtuma ei parane luonnollisesti vaan vaatii hoitoa, jossa murtuma alueelle viedään tarvittavia kasvutekijöitä. Kasvutekijät kiinnitetään tarkoituksenmukaiseen kantaja-aineeseen, jonka avulla kasvutekijöiden vapautumista ja toimintaa voidaan säädellä. Tutkimuksen tavoitteena oli arvioida ja optimoida erilaisissa eläinmalleissa porosta eristetyn luuproteiiniuutteen kantaja-ainesysteemien toimivuutta. Testatut kantaja-ainemateriaalit olivat kollageenihuopa ja bioaktiivinen lasirae. Näitä testattiin useilla luuproteiiniannoksilla, ja mallina oli rotan reisiluun kriittisen koon murtuma. Hiiren reisilihasmallilla testattiin kalsiumsuolayhdistelmiä (beta trikalsiumfosfaatti (β-TCP), hydroksiapatiitti ja kalsiumsulfaatti) tablettina ja pellettinä. Lampaan reisi- ja olkaluiden reikämurtumamallilla testattiin erilaisia β-TCP-rakeita yhdistettynä polyetyleenistä, glyserolista ja steariinihaposta valmistettuun geeliin. Kontrollisryhmistä toinen sisälsi kantaja-aineen ilman luuproteiiniuutetta, toisessa ryhmässä murtuma jätettiin kokonaan hoitamatta. Lammaskokeessa verrattiin lisäksi omaluusiirteen ja demineralisoidun luumateriaalin (DBM) toimivuutta verrattuna poron luuproteiiniuutteeseen. Uudisluun muodostuminen, murtuman paraneminen ja kantaja-aineen hajoaminen arvioitiin natiiviröntgenillä, perifeerisellä tietokonetomografialla (pQCT), mekaanisin testein, histologisesti ja mikro-CT:llä. Luuproteiiniuutetta sisältäneillä ryhmillä oli luun paraneminen ja kantaja-aineen hajoaminen merkittävästi parempaa kuin uutetta sisältämättömillä ryhmillä. Uudisluun muodostuminen oli suurempaa korkeammilla annoksilla ja pitemmillä seuranta-ajoilla. Suurin uudisluun muodostus mitattiin ryhmillä, joissa luuproteiiniuute oli heti käytettävissä implantoinnin jälkeen. Tämä osoittaa, että varsinkin murtuman paranemisen alkuvaiheissa tarvitaan luuta muodostavia kasvutekijöitä riittävinä pitoisuuksina. Mikro-CT-analyysit osoittivat, että luuproteiiniuuttetta sisältäneet ryhmät olivat verrannollisia omaluusiirrehoidolle. Vähiten uudisluuta havaittiin DBM ja tyhjäreikäryhmissä. Tutkimus osoittaa, että poron luuproteiiniuutetta erilaisten kantajamateriaalien kanssa voidaan käyttää parantamaan luun muodostumista. Erityisesti epäorgaaninen kantajamateriaali steariinihapon kanssa on yksi soveltuvimmista vaihtoehdoista luu-uutteelle. Kehitelty pastamutoinen lääkinnällinen laite, joka sisälsi poron luuproteiiniuutteen ja kalsiumsuolakantaja-aineen, osoittautui vaihtoehdoksi omaluusiirrehoidolle.

Abstract Tissue repair and cancer progression involve similar mechanisms, including degradation of extracellular matrix in which matrix metalloproteinases (MMPs) play essential roles. The action of MMPs is important in normal physiological processes but MMPs also contribute to various pathological conditions. MMP-8 belongs to a family of collagenases with a diverse set of substrates. MMP-8 action is involved in skin wound healing and in various human cancers. The function of MMP-8 in cancer appears to be highly complex and varies depending on the cancer type and location. Little is known about the involvement of MMP-8 in oral physiology and pathology. The aim of this study was to clarify the role of MMP-8 in oral tissue repair and oral tongue squamous cell carcinoma (OTSCC). Studies with MMP-8 deficient mice revealed that the function of MMP-8 in tissue repair is highly dependent on the spatial aspects. In alveolar bone, MMP-8 increased inflammation and affected collagen metabolism. In tongue wounds, MMP-8 impaired early healing and reduced transforming growth factor (TGF) -β1 levels. This study also revealed the protective role of MMP-8 in OTSCC patients, in agreement with previous studies indicating positive features of MMP-8 in cancer. Low MMP-8 level and high vascular endothelial growth factor (VEGF) -C levels in tumors correlated with worse prognosis in these patients. In mouse tongue fibroblast cell cultures, MMP-8 reduced TGF-β1 signaling molecule phosphorylated Smad2 levels and impaired the collagen contraction ability. TGF-β1, apoptosis factor Fas-ligand (Fas-L) and estrogen receptors (ERs) were identified as novel MMP-8 substrates. In OTSCC cell cultures, MMP-8 impaired cell migration and invasion. Diminished TGF-β1 levels were involved in the defective migration of MMP-8 overexpressing cells. Moreover, MMP-8 affected the expression of MMP-9, MMP-1, cathepsin-K, VEGF-C and TGF-β1. In mouse models of OTSCC, MMP-8 protected against tumor development but was not able to prevent metastasis formation. The main findings of this study were that 1) MMP-8 action in tissue repair depends on the site of the injury and 2) in OTSCC, MMP-8 has tumor suppressive effects, but in mouse, MMP-8 does not inhibit metastasis formation. In addition, 3) four novel MMP-8 substrates (TGF-β1, Fas-L, ER-α and -β) were identified that may explain the spatial and diverse roles of MMP-8. / Tiivistelmä Kudosvaurioiden paranemiseen ja syövän etenemiseen liittyy useita samankaltaisia mekanismeja. Molemmissa toimivat soluvälitilan muokkaamiseen osallistuvat proteaasit, joista matriksin metalloproteinaaseilla (MMP) on tärkeä merkitys; ne osallistuvat lukuisiin elimistön keskeisiin fysiopatologisiin prosesseihin. Kollagenaasi MMP-8 muokkaa monentyyppisiä molekyylejä. Se on mukana ihohaavan paranemisessa ja useissa syövissä. MMP-8:n toiminta syöpätiloissa on hyvin moninainen riippuen syöpätyypistä ja sijainnista. Väitöstutkimuksessa selvitettiin MMP-8:n merkitystä suun kova- ja pehmytkudosvaurioprosesseissa sekä kielisyövässä, joissa se on ollut tuntematon. MMP-8 poistogeenisillä hiirillä tehdyissä pehmyt- ja kovakudoshaavoissa MMP-8:n vaikutusmekanismit riippuivat kohdekudoksesta. Alveoliluun paranemisen yhteydessä MMP-8 lisäsi tulehdusta ja osallistui kollageenin muokkaamiseen. Akuutin kielihaavan paranemisessa MMP-8 hidasti haavan umpeutumista ja vähensi transformoivan kasvutekijä-β1:n (TGF-β1) määrää. Kuten useissa muissakin syövissä, myös kielisyövässä todettiin MMP-8:lla olevan suojaava vaikutus. Potilaan ennuste huononi, jos kasvainsolukon matala MMP-8-taso yhdistyi korkeaan verisuonten kasvutekijä-C:n (VEGF-C) määrään. Hiiren kielen normaaleissa fibroblastiviljelmissä MMP-8 vähensi TGF-β1:n solunsisäistä signalointia välittävän fosforyloidun Smad2:n määrää sekä solujen kykyä supistaa kollageenikiekkoja. Koeputkessa MMP-8 pilkkoi TGF-β1:tä, estrogeenireseptoreja (ER) ja apoptoositekijä Fas-ligandia (Fas-L). Ihmisen kielikarsinoomasoluviljelmissä korkea MMP-8:n määrä vähensi solujen migraatiota ja invaasiota sekä muutti MMP-1:n, MMP-9:n, katepsiini-K:n, TGF-β1:n ja VEGF-C:n ilmentymistä. Migraation heikentyminen MMP-8:aa tuottavissa soluissa johtui osin vähentyneestä TGF-β1:n määrästä. Hiiren kokeellisissa kielisyövissä MMP-8 hidasti syövän muodostumista mutta ei estänyt etäpesäkkeiden muodostusta. Tässä väitöskirjatutkimuksessa on kolme päälöydöstä: 1) MMP-8:n vaikutus kudoksen paranemisprosessiin riippuu vauriokohdasta, 2) MMP-8 on kielisyövän kehittymisessä puolustuksellinen molekyyli, mutta sen lisääntynyt tuotto ei hiirikokeissa estänyt etäpesäkkeiden muodostusta, 3) MMP-8:lle löydettiin neljä uutta kohdemolekyyliä (TGF-β1, Fas-L, ER-α ja -β), joiden muokkaus saattaa osin selittää MMP-8:n monipuoliset kudos- ja prosessispesifit vaikutukset.