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Caractérisation d’une phase de persistance intracellulaire du pathogène Listeria monocytogenes / Characterization of an intracellular persistence stage on the pathogen Listeria monocytogenesKortebi, Mounia 21 November 2018 (has links)
Listeria monocytogenes est une bactérie pathogène intracellulaire facultative responsable d’une pathologie grave, la listériose. Si de très nombreux travaux ont permis de caractériser les mécanismes de virulence de cette bactérie, il existe peu de données sur les mécanismes conduisant au portage asymptomatique de L. monocytogenes dans les hôtes mammifères. L’un de ces mécanismes pourrait être une phase de persistance intracellulaire. Lors d’infections prolongées de cellules épithéliales humaines en culture, comme des hépatocytes et des cellules de trophoblastes, L. monocytogenes change de mode de vie intracellulaire. Après la phase active de dissémination de cellule en cellule, les bactéries arrêtent de polymériser l’actine et se retrouvent piégées dans des vacuoles à simple membrane marquées par la protéine endosomale LAMP1. L’objectif de ma thèse était de caractériser ces « Listeria-Containing Vacuoles » (LisCVs). Nous avons montré que les LisCVs sont des compartiments acides, partiellement-dégradatifs, marquées par la protéase lysosomale cathépsine D. Leur formation coïncide avec la disparition du facteur de polymérisation d’actine ActA de la surface bactérienne et la capture des bactéries cytosoliques dépourvues d’actine par des membranes cellulaires. Dans ces compartiments, les bactéries entrent en croissance ralentie ; une sous-population résiste aux stress et peut survivre au-delà de trois jours d’infection. L’utilisation de la gentamicine lors du protocole d’infection n’est pas responsable de la formation des LisCVs. Cependant, cet antibiotique permet la sélection des bactéries vacuolaires, en inhibant spécifiquement la croissance des bactéries cytosoliques. La formation des LisCVs n’est pas spécifique des souches de laboratoire. Toutefois l’efficacité du phénomène pourrait diverger selon les séquençotypes des souches de L. monocytogenes. Les bactéries vacuolaires ont la capacité de sortir des vacuoles et de retourner vers un état motile et réplicatif, après le passage des cellules infectées. Lorsque l’expression du gène actA reste inactive, comme dans les mutants ∆actA, des formes de Listeria vacuolaires persistent dans les cellules hôtes dans un état viable mais non cultivable (VBNC). Ces formes VBNC peuvent être transmises au cours des divisions des cellules hôtes. L’ensemble de ces résultats révèle une nouvelle phase de persistance dans le processus infectieux intracellulaire de L. monocytogenes lors des infections prolongées de certaines cellules épithéliales. Cette propriété pourrait contribuer au portage asymptomatique de ce pathogène dans les tissus épithéliaux, allonger la période d'incubation de la listériose, et rendre les bactéries tolérantes à l’antibiothérapie. / Listeria monocytogenes is a facultative intracellular pathogenic bacterium responsible for a serious disease, listeriosis. Although much work has been done to characterize the virulence mechanisms of this bacterium, there is little data on the mechanisms leading to the asymptomatic carriage of L. monocytogenes in mammalian hosts. One of these mechanisms could be a phase of intracellular persistence. During prolonged infections of human epithelial cells in culture, such as hepatocytes and trophoblast cells, L. monocytogenes changes its intracellular lifestyle. After the active phase of cell-to-cell spread, the bacteria stop polymerizing actin and become trapped in single-membrane vacuoles labeled with the endosomal protein LAMP1.The aim of my thesis was to characterize these "Listeria-Containing Vacuoles" (LisCVs). We have shown that LisCVs are acidic, partially degradative compartments, labeled by the lysosomal protease cathepsin D. Their formation coincides with the disappearance of actin polymerization factor ActA from the bacterial surface and the capture of actin-free cytosolic bacteria by cell membranes. In these compartments, bacterial growth is slowed; a subpopulation is resistant to stress and can survive beyond three days of infection. The use of gentamicin during the infection protocol is not responsible for the formation of LisCVs. However, this antibiotic allows selection of vacuolar bacteria, by specifically inhibiting the growth of cytosolic bacteria. The formation of LisCVs is not specific to laboratory strains. However, the efficacy of the phenomenon could diverge according to the sequence types of L. monocytogenes strains. Vacuolar bacteria have the ability to exit the vacuoles and return to a motile and replicative state during the subculture of infected cells. When expression of the actA gene remains inactive, as in ΔactA mutants, vacuolar Listeria forms persist in host cells in a viable but non-culturable (VBNC) state. These VBNC forms can be transmitted during host cell divisions. All these results reveal a new phase of persistence in the intracellular infectious process of L. monocytogenes during prolonged infections of a subset of epithelial cells. This property could contribute to asymptomatic carriage of this pathogen in epithelial tissues, extend the incubation period of listeriosis, and make bacteria tolerant to antibiotic therapy.
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The intracellular pathogen Chlamydia trachomatis targets proteins of the ESCRT machinery / Le pathogène intracellulaire Chlamydia trachomatis cible des protéines de la machinerie ESCRTVromman, Francois 10 June 2014 (has links)
Chlamydia trachomatis est une bactérie intracellulaire obligatoire. Ce pathogène de l’Homme est la première cause infectieuse de cécité ainsi que de maladies sexuellement transmissible d’origine bacterienne.Utilisant une souche de C. trachomatis L2 exprimant une protéine fluorescente, nous avons développé des méthodes de microscopie et de cytométrie en flux permettant de suivre les différentes étapes du développement de la bactérie. Ces méthodes faciliteront les futures études de l’infection par Chlamydia.Chlamydia interagit avec différents processus cellulaires, et plus particulièrement via la sécrétion d’effecteurs par le système de sécrétion de type 3 (ST3). Nous avons identifié une famille de protéines possédant un signal de ST3 qui partagent un domaine, le DUF582, présent uniquement chez les Chlamydia pathogènes.Nous avons montré que les 5 protéines DUF582 de C. trachomatis sont exprimées à partir du milieu du cycle infectieux. Nous avons démontré que la protéine Hrs interagit avec le DUF582 et que la protéine DUF582 CT619 interagit avec Tsg101. Hrs et Tsg101 sont d’importants composants de la machinerie ESCRT impliquée dans de nombreux processus de fission membranaire.Utilisant l’interférence ARN, nous avons montré que Hrs et Tsg101 ne sont requis ni pour l’entrée, ni pour le développement de la bactérie. Ceci suggère que les protéines DUF582 bloquent des processus dépendant de Hrs/Tsg101. A l’inverse, la bactérie pourrait utiliser la machinerie ESCRT mais l’existence de mécanismes redondants expliquerait l’absence de phénotype dans les expériences d’interférence. Nous discutons trois hypothèses concernant le rôle des protéines DUF582 dans l’infection. / Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular human pathogen. It is the first infectious cause of blindness and the most common cause of sexually transmitted diseases of bacterial origin. Using a strain of C. trachomatis serovar L2 expressing a fluorescent protein we developed microscopy and flow cytometry based methods to quantify several steps of its developmental cycle. These methods will facilitate future studies aimed at testing anti-bacterial compounds or various culture conditions. Chlamydiae interfere with many cellular processes, in particular via the secretion of bacterial proteins through a type 3 secretion (T3S) system. We identified a family of proteins that possess T3S signals. They share a domain designated as DUF582, which is only found in pathogenic chlamydiae. We showed that the five DUF582 proteins of C. trachomatis are expressed from the mid phase of infection. We demonstrated that the protein Hrs is a common interactor for the DUF582. In addition the N-terminal part of the DUF582 protein CT619 interacts with Tsg101. Hrs and Tsg101 are both important components of the ESCRT machinery, which is an ancient machinery required for several processes involving membrane fission.Using RNA interference we showed that Hrs and Tsg101 are dispensable for bacterial entry and growth. This last result suggest that DUF582 proteins actually prevent Hrs and/or Tsg101 driven processes. Alternatively, the bacteria might highjack the ESCRT machinery but redundant mechanisms would explain the absence of phenotype on bacterial development observed in the silencing experiments. We discuss three hypotheses as to the possible role of the DUF582 proteins in infection.
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