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Analyse du transcriptome d'Ehrlichia ruminantium agent causal de la cowdriose : mise en évidence des gènes impliqués dans la virulence et les mécanismes d'atténuation et application à l'élaboration d'un vaccin recombinant / Transcriptomic analisis of Ehrlichia ruminantium the causal agent of heartwater : identification of genes involved in virulence and attenuation mechanisms and application to the development of a recombinant vaccinePruneau, Ludovic 30 November 2012 (has links)
AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES / Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied.
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Description des écotypes du phylotype II dans le complexe d'espèces Ralstonia solanacearum : diversité et évolution / Description of phylotype II ecotypes within Ralstonia solanacearum species complex : diversity and evolutionCellier, Gilles 13 December 2010 (has links)
Le modèle étudié est l’agent phytopathogène vasculaire Ralstonia solanacearum, en portant une attention particulière aux souches de phylotype II. Cette bactérie d’origine tellurique est très diversifiée, tant au plan génétique que phénotypique. Sa classification en constante évolution témoigne d’une volonté de clarifier cette biodiversité inhabituellement forte, tout en cherchant à reconnaître les écotypes structurant ce complexe d’espèces, i.e., des groupes de souches partageant à la fois des traits génotypiques et biologiques spécifiques. Dans le cadre de ce pathosystème modèle, nous nous sommes attachés dans un premier temps à revisiter de façon précise les pathotypes au sein d’écotypes bien décrits dans la littérature, ou à en faire la description (phylotype III africain). Nous avons observé une forte convergence phénotypique entre les souches de phylotype III des hauts plateaux africains et les souches Brown rot de phylotype IIB-1, capables de flétrir la pomme de terre et d’autres Solanacées à température froide. L’adaptation de souches aussi diverses pour la tolérance au froid nous a conduits à dresser un bilan de la situation R. solanacearum en Europe et in extenso dans le bassin méditerranéen. Cette approche a permis d’apprécier les degrés de divergence significative dans le pouvoir pathogène (virulence et agressivité) sur Solanaceae au sein de souches quasi clonales unifiant l’écotype Brown rot, qui s’établissent aussi sous forme d’infections latentes dans les tissus vasculaires de bananiers (Musacées). Dans le même temps, le phénotype de souches pathogènes du bananier, unifiant l’écotype Moko, a aussi été revisité sur Solanaceae qu’elles parviennent à flétrir, y compris des ressources génétiques résistantes au flétrissement bactérien. L’ensemble de ces données expérimentales a permis de dégager les critères de sélection pour le choix de trois nouvelles souches du complexe d’espèces R. solanacearum, dont nous avons obtenu les séquences génomiques. Notre approche en génomique comparative a permis de décrire le premier pangénome chez cet agent pathogène : l’ensemble les gènes repérés de l’espèce. Ces données ont été exploitées par différentes approches bio-informatiques et permettent de concevoir une refonte pertinente du complexe d’espèces R. solanacearum en trois nouvelles espèces génomiques, regroupant les souches de phylotypes I (Asie) et III (Afrique) d’une part, puis les souches de phylotype II (Amérique), et enfin les souches de phylotype IV (Indonésie) d’autre part. Ce pangénome a ensuite été exploité en concevant et développant une puce à ADN, un outil permettant l’exploration à haut débit d’une grande quantité de souches. La densité des données expérimentales accumulées permet une démarche vers l’écologie moléculaire et de reconstituer certains pans du passé évolutif des souches de phylotype II chez R. solanacearum. Par ailleurs, l’analyse approfondie de ces données de génomique, associant phylogéographie et structuration des populations de l’écotype Brown rot, montre une double situation épidémiologique en Europe, recoupant des influences andines et africaines. De la même façon, l’écotype Moko présente trois structures génétiques distinctes. Ces données ont été analysées de manière à retracer les principaux flux de gènes dans les états ancestraux des phylotypes et de dégager la forte contribution de la partie mobile du génome, des gènes relatifs à l’adaptation environnementale et à la pathogénie, comme moteurs dans l’évolution de cet important organisme phytopathogène. / The studied model is the vascular plant pathogen Ralstonia solanacearum, with a particular focus on phylotype II strains. This telluric bacterium has a wide diversity, both on genotypic and phenotypic levels. Its evolving classification reflects the need to clarify its unusual biodiversity and seek to identify ecotype structure in this species complex, i.e., groups of strains with both genotypic and specific biological traits. Within the framework of this model pathosystem, we initially focused on deeply revisiting pathotypes among ecotypes, although well described in the literature, or describing new ecotypes (African phylotype III). We observed high phenotypic convergence between strains from phylotype III from the African highlands and Brown rot strains from phylotype IIB-1, both able to trigger wilt symptoms on potato and other Solanaceae at cold temperatures. Adaptation of diverse strains for cold tolerance led us to investigate the R. solanacearum situation in Europe and more specifically in the Mediterranean regions. This strategy allowed us to appreciate the significant divergence towards pathogenicity (virulence and aggressiveness) on Solanaceae within clonal-like structure of strains in the Brown rot ecotype, which also established latent interactions in the banana vascular system. In the mean time, phenotypes of banana pathogenic strains unifying the Moko ecotype, was also revisited on Solanaceae, and was able to trigger symptoms on both susceptible and resistant genetic resources to bacterial wilt. All these experimental data yielded selection criteria for choosing three new candidate strains in the R. solanacearum species complex for complete genome sequencing. Our genomic comparative approach allowed us to describe the first pangenome of this pathogen: all targeted identified genes of this species complex. These data were analyzed by various bioinformatic approaches and allowed us to design a complete reshaping of R. solanacearum species complex into three distinct genomic species, firstly clustering strains from phylotype I (Asia) with strains from phylotype III (Africa); strains from phylotype II (America); and lastly, strains from phylotype IV (Indonesia). This pangenome was then used for designing a DNA microarray, a high resolution tool that allowed us to explore a wide set of genomes. The density of accumulated data allowed for a molecular ecological approach to retrieve a certain amount of the evolutionary past of R. solanacearum phylotype II strains. Furthermore, a deeper analysis of these genomic data, combining phylogeography with population structure analysis of the Brown rot ecotype, revealed a dual epidemic situation in Europe, both across Andean and African influences. Similarly, the Moko ecotype presents three distinct genetic structures. These data were analyzed within the purpose of tracking the main gene flows in the ancestral states of phylotypes and to unravel the strong contribution of the mobile elements, genes related to environmental adaptation, and pathogenicity as a major driving force into the evolution of this successful plant pathogen.
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Description des écotypes du phylotype II dans le complexe d'espèces Ralstonia solanacearum : diversité et évolutionCellier, Gilles 13 December 2010 (has links) (PDF)
Le modèle étudié est l'agent phytopathogène vasculaire Ralstonia solanacearum, en portant une attention particulière aux souches de phylotype II. Cette bactérie d'origine tellurique est très diversifiée, tant au plan génétique que phénotypique. Sa classification en constante évolution témoigne d'une volonté de clarifier cette biodiversité inhabituellement forte, tout en cherchant à reconnaître les écotypes structurant ce complexe d'espèces, i.e., des groupes de souches partageant à la fois des traits génotypiques et biologiques spécifiques. Dans le cadre de ce pathosystème modèle, nous nous sommes attachés dans un premier temps à revisiter de façon précise les pathotypes au sein d'écotypes bien décrits dans la littérature, ou à en faire la description (phylotype III africain). Nous avons observé une forte convergence phénotypique entre les souches de phylotype III des hauts plateaux africains et les souches Brown rot de phylotype IIB-1, capables de flétrir la pomme de terre et d'autres Solanacées à température froide. L'adaptation de souches aussi diverses pour la tolérance au froid nous a conduits à dresser un bilan de la situation R. solanacearum en Europe et in extenso dans le bassin méditerranéen. Cette approche a permis d'apprécier les degrés de divergence significative dans le pouvoir pathogène (virulence et agressivité) sur Solanaceae au sein de souches quasi clonales unifiant l'écotype Brown rot, qui s'établissent aussi sous forme d'infections latentes dans les tissus vasculaires de bananiers (Musacées). Dans le même temps, le phénotype de souches pathogènes du bananier, unifiant l'écotype Moko, a aussi été revisité sur Solanaceae qu'elles parviennent à flétrir, y compris des ressources génétiques résistantes au flétrissement bactérien. L'ensemble de ces données expérimentales a permis de dégager les critères de sélection pour le choix de trois nouvelles souches du complexe d'espèces R. solanacearum, dont nous avons obtenu les séquences génomiques. Notre approche en génomique comparative a permis de décrire le premier pangénome chez cet agent pathogène : l'ensemble les gènes repérés de l'espèce. Ces données ont été exploitées par différentes approches bio-informatiques et permettent de concevoir une refonte pertinente du complexe d'espèces R. solanacearum en trois nouvelles espèces génomiques, regroupant les souches de phylotypes I (Asie) et III (Afrique) d'une part, puis les souches de phylotype II (Amérique), et enfin les souches de phylotype IV (Indonésie) d'autre part. Ce pangénome a ensuite été exploité en concevant et développant une puce à ADN, un outil permettant l'exploration à haut débit d'une grande quantité de souches. La densité des données expérimentales accumulées permet une démarche vers l'écologie moléculaire et de reconstituer certains pans du passé évolutif des souches de phylotype II chez R. solanacearum. Par ailleurs, l'analyse approfondie de ces données de génomique, associant phylogéographie et structuration des populations de l'écotype Brown rot, montre une double situation épidémiologique en Europe, recoupant des influences andines et africaines. De la même façon, l'écotype Moko présente trois structures génétiques distinctes. Ces données ont été analysées de manière à retracer les principaux flux de gènes dans les états ancestraux des phylotypes et de dégager la forte contribution de la partie mobile du génome, des gènes relatifs à l'adaptation environnementale et à la pathogénie, comme moteurs dans l'évolution de cet important organisme phytopathogène.
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La méthionine et son rôle dans la physiologie du champignon phytopathogene Magnaporthe Grisea / The role of methionine in the physiology of the rice blast fungus Magnaporthe GriseaFrelin, Océane 05 June 2009 (has links)
En agriculture, les ravages causés par les champignons pathogènes sont les plus répandus et les plus dommageables. Au cours du développement parasite, ils présentent un besoin en méthionine et cystéine. Notre étude vise à mieux comprendre le rôle clé de la méthionine dans la physiologie du champignon phytopathogène Magnaporthe grisea. Nous sous sommes focalisés sur deux mutants de délétion obtenus par remplacement de gène : le mutant du gène codant pour la méthionine synthase (mutant ΔMS) et celui du facteur de transcription MgMetR (mutant ΔMgMetR). Une étude globale a été entreprise pour chacun des mutants en utilisant les techniques de transcriptome et de métabolome. Les signatures métaboliques des mutants ont été déterminées par HPLC. Le mutant ΔMS est caractérisé par une accumulation d’homocystéine et de SAM et le mutant ΔMgMetR présente une réduction drastique de son taux de glutathion. L’analyse en transcriptome du mutant ΔMS montre un nombre important de gènes différentiellement exprimés. Plusieurs voies métaboliques se sont vues affectées dans le mutant ΔMS : le métabolisme des folates, la biosynthèse des acides aminés et l’homéostasie du fer ont fait l’objet d’une étude particulière. Les premières analyses bioinformatiques du transcriptome du mutant ΔMgMetR ont confirmé le rôle de MgMetR dans le contrôle de l’expression des gènes de la voie d’assimilation du sulfate. L’ensemble de ces résultats a permis de mettre en évidence de nouvelles connections métaboliques et ainsi, facilite la compréhension du métabolisme du champignon phytopathogène M. grisea afin de trouver de nouvelles voies d’étude pour la protection des cultures. / Filamentous fungi cause devastating diseases in agricultural crops. Recent studies highlighted a need for methionine and cysteine during the infectious process. Our goal is to understand the role of methionine biosynthesis in the plant pathogenic model Magnaporthe grisea. To this end, we focused our study on two null mutants for the genes encoding methionine synthase which catalyzes the last step for methionine biosynthesis (ΔMS), and the sulphur regulator MgMetR which controls sulphate assimilation pathway (ΔMgMetR). A global analysis was carried out for each mutant by using transcriptomic and targeted metabolomic approaches. Metabolic signatures were determined by HPLC. ΔMS mutant was characterized by an increase in homocysteine and S-adenosylmethionine levels whereas ΔMgMetR mutant displayed a drastic reduction in glutathione content. Microarray analyses of ΔMS mutant highlighted an important molecular perturbation since 507 to 1565 genes were differentially expressed in ΔMS mutant compared to the wild type strain depending on our experimental conditions (from starvation to excess of methionine). Our analyses focused on different metabolic pathways: folate metabolism, amino acid biosynthesis and iron homeostasis which were subject to molecular and biochemical validations. Microarray analyses of ΔMgMetR mutant confirmed the transcriptional control of the expression of the genes involved in sulphate acquisition and assimilation. The set of results obtained during this work gets insight into new metabolic interplays between methionine biosynthesis and M. grisea general metabolism and reveals new research areas for antifungal molecules with the aim of crop protection.
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Rôle physiopathologique de l’internalisation de Staphylococcus aureus par les ostéoblastes au cours de l’infection osseuse / Role of osteoblast invasion by Staphylococcus aureus in the pathogenesis of OsteomyelitisRasigade, Jean-Philippe 11 January 2013 (has links)
L’invasion des ostéoblastes par Staphylococcus aureus (SA) est considérée comme responsable, au moins partiellement, de l’évolution chronique ou récurrente des infections osseuses (IO). Nous avons émis l’hypothèse que des différences d’interactions SA-ostéoblastes pouvaient être associées aux différences de présentation clinique des IO. Nous avons d’abord développé un modèle ex vivo d’infection intracellulaire d’ostéoblastes humains permettant de quantifier l’adhésion, l’invasion, la survie intracellulaire de SA et les dommages subis par les cellules infectées. Grâce ce modèle, nous avons montré que les SA communautaires résistants à la méticilline (CA-MRSA), un groupe polyphylétique de souches hypervirulentes associées à des formes aiguës et sévères d’IO, induisent une cytotoxicité supérieure à celle des MRSA hospitaliers (HA-MRSA) associés à des IO plus souvent chroniques. A l’aide de mutants isogéniques, nous avons pu démontrer que cette cytotoxicité était indépendante de la toxine de Panton-Valentine et l’alphahémolysine mais associée à la surexpression des phenol-soluble modulins (PSM) par les CA-MRSA. Ces résultats ont permis d’identifier un nouveau mécanisme de virulence des CA-MRSA basé sur l’invasion des ostéoblastes et l’activité intracellulaire des PSM. Parallèlement, nous avons montré que certains antibiotiques modifient le niveau de transcription et d’expression des protéines staphylococciques impliquées dans l’invasion des ostéoblastes, sans que nous ne puissions montrer une modification de la capacité d’invasion de S. aureus dans ce même modèle ex vivo. Nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension et la prise en charge des IO due à SA / Osteoblast invasion by Staphylococcus aureus (SA) is currently considered a putative explanatory mechanism for the chronic or recurrent nature of osteomyelitis. We raised the hypothesis that inter-strain differences in the interactions between S. aureus and osteoblasts at the cellular level could correlate with differences in the clinical presentation of osteomyelitis. We first developed an ex vivo model of intracellular bacterial challenge of human osteoblasts to quantify SA adhesion, invasion and intracellular survival as well as SA-induced damage to infected cells. By means of this model, we have demonstrated that community-acquired methicillinresistant SA (CA-MRSA) strains, which belong to a polyphyletic group endowed with high virulence and are associated with severe and acute forms of osteomyelitis, induce more cytotoxicity in osteoblasts as compared to hospital MRSA strains, which in turn are more frequently involved in chronic forms of osteomyelitis. Using isogenic CA-MRSA mutants, we determined that SA-induced osteoblast damage was independent of the production of Panton-Valentin leukocidin and alpha-toxin, but was associated with the overexpression of phenol-soluble modulins (PSMs) by CAMRSA. These findings elucidate a novel virulence strategy of CA-MRSA based on the invasion and PSM-related killing of osteoblasts. In parallel to this research, we demonstrated that several antibiotics alter the transcription and expression levels of SA adhesins involved in osteoblast invasion. However, antibiotics did not induce changes in SA invasiveness in our ex vivo infection model. Collectively, our findings provide new insights into the pathogenesis of SA osteomyelitis
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