Une partie de ce travail de thèse a consisté à appliquer les méthodes de FISH pour l’étude de trois bactéries pathogènes intracellulaires. La viabilité de Bartonella henselae a été évaluée à partir de ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat (CSD). Le faible taux d’ARN détecté par biologie moléculaire, la stérilité des cultures, l'absence de détection par analyses histologiques et FISH confirment que B. henselae n'est pas ou rarement viable dans les ganglions de patients atteints de CSD. Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple, a été identifié et localisé par FISH, dans les macrophages d’un ganglion et d’une biopsie pulmonaire, confirmant le diagnostic infectieux. Deux méthodes de FISH ont été testées pour détecter Coxiella burnetii dans des cas d’endocardites et d’infections vasculaires en utilisant des sondes oligonucléotidiques et des sondes PNA. Les résultats ont confirmé une meilleure efficacité des sondes PNA et démontré que les techniques de FISH sont plus sensibles que l’immunohistochimie pour le diagnostic des endocardites et des infections vasculaires à C. burnetii. Nous avons également évalué les stratégies moléculaires mises en place pour le diagnostic syndromique. Bien que la PCR conventionnelle à large spectre permette l'identification de micro-organismes fastidieux et anaérobies, la PCR spécifique en temps réel révèle une supériorité significative dans le diagnostic syndromique. En conclusion, ce travail a permis de démontrer l’efficacité et l’applicabilité de la FISH pour la détection bactérienne. Cette méthode peut être utilisée comme un outil complémentaire afin d'améliorer le diagnostic de microbiologie clinique. / We applied FISH methods to the study of three intracellular pathogenic bacteria. The viability of Bartonella henselae was evaluated in a large series of lymph nodes from patients with cat scratch disease (CSD). The results obtained, associated with sterile cultures and negative histological analyzes and FISH, as well as the low level of RNA detected by molecular biology, provide evidence that B. henselae are not or are rarely viable in the lymph nodes of patients with CSD. Tropheryma whipplei has been identified by FISH in macrophages from one lymph node and for the first time in a pulmonary biopsy, confirming the diagnosis of infection. Two methods of FISH have been tested to detect Coxiella burnetii in cases of endocarditis and vascular infections using oligonucleotide and PNA probes. The results attested to the greater efficiency of PNA probes, and demonstrated that FISH were applicable for the diagnosis of C. burnetii endocarditis. We also evaluated the molecular strategies used for syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Although conventional broad-spectrum PCR allows for the identification of fastidious and anaerobic microorganisms, real-time specific PCR reveals a significant superiority in syndrome-driven diagnosis. The addition of specific PCRs in real time PCR would improve our molecular strategies, for example, in the case of the detection of Staphylococcus aureus for the diagnosis of lymphadenopathy. In conclusion, this work demonstrates the effectiveness and applicability of FISH for the identification of intracellular bacteria. This method can be used as an important complementary tool to the improvement of clinical microbiological diagnosis.

AU COURS DE LA THESE, L'ETUDE DU TRANSCRIPTOME DE SOUCHES GARDEL ET SENEGAL VIRULENTES ET ATTENUEES D'E. RUMINANTIUMA ETE REALISEE. UNE ANALYSE DU TRANSCRIPTOME A DIFFERENTS STADES DE DEVELOPPEMENT, A D'ABORD ETE EFFECTUEE POUR LA SOUCHE GARDEL VIRULENTE. AU STADE CORPS RETICULE (FORME INTRACELLULAIRE NON INFECTIEUSE), UNE SUREXPRESSION DES GENES CODANT POUR DES PROTEINES IMPLIQUEES DANS LE METABOLISME, LE TRANSPORT ET L'ECHANGE DE NUTRIMENTS ET DANS LA RESISTANCE AU STRESS OXYDATIF ETAIT OBSERVEE. IL SEMBLERAIT QUEE. RUMINANTIUMMETTE EN PLACE UN PANEL DE MECANISMES POUR SA SURVIE ET SON DEVELOPPEMENT A L'INTERIEUR DE LA CELLULE HOTE. AU STADE CORPS ELEMENTAIRE (FORME EXTRACELLULAlRE INFECTIEUSE), LE GENE DKSA CODANT POUR UN FACTEUR DE TRANSCRIPTION ETAIT SUREXPRIME. CE GENE A ETE MONTRE COMME ETANT IMPLIQUE DANS LA REGULATION DE FACTEURS DE VIRULENCE. IL SEMBLERAIT . DONC, QU'AU STADE CORPS ELEMENTAIRE, IL Y AIT UNE INDUCTION DE MECANISMES DE VIRULENCE. LA COMPARAISON DE L'EXPRESSION DES GENES AU STADE CORPS ELEMENTAIRE ENTRE SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES A AUSSI ETE EFFECTUEE. NOS RESULTATS ONT MONTRE UNE MODIFICATION IMPORTANTE DE LA MEMBRANE POUR LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. POUR LES SOUCHES ATTENUEES, IL A ETE MONTRE UNE SUREXPRESSION DES GENES IMPLIQUES DANS LA BIOGENESE MEMBRANAlRE ET UNE SOUS-EXPRESSION·DES PROTEINES DE LA FAMILLE MULTIGENIQUE MAP. CES RESULTATS SUGGERENT QUE LES PROTEINES MAP JOUENT UN ROLE DE LEURRE VIS-A-VIS DE LA REPONSE IMMUNITAIRE PROTECTRICE. DES PROTEINES MEMBRANAlRES HYPOTHETIQUES SONT SUREXPRIMEES A LA FOIS CHEZ LES SOUCHES VIRULENTES ET ATTENUEES. CERTAINES D'ENTRE ELLES SUREXPRIMEES CHEZ LES SOUCHES ATTENUEES SEMBLENT ETRE DE BONS CANDIDATS VACCINAUX ET DEVRAIENT ETRE ETUDIEES / Transcriptomic study of gardel and senegal both virulent and attenuated e. ruminantium strains was conducted during my phd. an analysis of transcriptome at different stages of development has been first conducted for virulent gardel strain. at reticulate body stage (intracellular form non-infectious), over-expression of genes coding for proteins involved in metabolism, transport and exchange of nutrients and resistance to oxidative stress was observed. at this stage of development, e. ruminantium seems to activate mechanisms for its survival and development within the host cell. at elementary body stage, dksa the gene encoding for a transcription factor was over-expressed. this gene has been shown to be involved in the regulation of virulence factors. it seems, therefore, at the elementary body stage, e. ruminantium induces its virulence factors. secondly, we compare the transcriptome of elementary body between virulent and attenuated strains. our results showed an important membrane modification of attenuated and virulent strains. for attenuated strains, we observed an over-expression of genes involved in membrane biogenesis and a diminution of expression of map multigenic family. it seems that map proteins subvert the protective immune response. hypothetical membrane proteins are over-expressed in both virulent and attenuated strains. some over-expressed proteins in attenuated strains seem to be good vaccine candidates and willstudied.

Les bactéries appartenant au complexe Burkholderia cepacia (Bcc) sont des pathogènes opportunistes intracellulaires qui causent des infections pulmonaires chez les patients atteints de mucoviscidose, aggravant leur pronostic clinique. Ces infections pulmonaires sont caractérisées par des périodes chroniques avec des exacerbations intermittentes détériorant la fonction pulmonaire, et pouvant causer des nécroses broncho-pulmonaires et septicémies fatales reconnues sous le nom du “Syndrome Cepacia”. Ces bactéries intrinsèquement multi-résistantes aux antibiotiques sont aussi responsables de sérieuses infections émergentes dans des contextes hors mucoviscidose, à la fois dans des conditions intra et extra-hospitalières. Burkholderia cenocepacia, l’une des espèces les plus répandues et isolées chez les patients, est capable d’échapper à la dégradation par les macrophages de l’hôte en bloquant la maturation des (auto)phagosomes. Nous avons récemment démontré que les macrophages servent de niche essentielle pour la réplication intracellulaire de B. cenocepacia K56-2, et sont nécessaires pour le développement d’une réponse pro-inflammatoire aiguë et fatale dans des larves de poisson zèbre. Cette étude exploite d’autant plus le modèle du poisson zèbre pour mieux comprendre quels sont les facteurs bactériens et de l’hôte qui sont impliqués dans la différence entre infection aiguë et persistante, et dans la transition entre ces deux phases infectieuses.ShvR est un régulateur transcriptionnel appartenant aux LTTRs (“LysR-Type Transcriptional Regulators”) chez B. cenocepacia K56-2. Il a été démontré dans le modèle d’infection pulmonaire chez le rat, que ShvR a un rôle important dans l’induction de la réponse pro-inflammatoire, mais pas dans les infections persistantes. Pour cette étude nous utilisons une approche bioinformatique, le modèle du poisson zèbre et des études transcriptomiques afin d’obtenir plus d’informations sur le rôle de ShvR dans la virulence et dans la transition entre infection persistante et réponses pro-inflammatoires. Nos données bioinformatiques suggèrent que le gène shvR s’est adapté par évolution divergente, et a été perdu dans une sous-classe du Bcc. Grâce au modèle du poisson zèbre, nous avons démontré que ShvR n’est pas essentiel pour les stades intra-macrophagiques, mais qu’il est requis pour la dissémination de B. cenocepacia K56-2 des macrophages et pour le développement d’une réponse pro-inflammatoire fatale. Le profile persistant de l’infection a été confirmé par l’analyse du transcriptome de l’hôte, donnant plus d’informations sur les différentes réponses de l’hôte envers les infections par des mutants comparées à la souche sauvage. Le travail de cette thèse a contribué non seulement à une meilleure compréhension du rôle de ShvR et aux gènes cibles régulés par ce dernier qui joue un rôle important dans les infections aiguës, mais également à établir de nouvelles pistes pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques luttant contre les infections par les bactéries appartenant au complexe Bcc. / Bacteria belonging to the Burkholderia cepacia complex (Bcc) are opportunistic pathogens with an intracellular life style. Pulmonary infections with these bacteria significantly worsen clinical outcome for cystic fibrosis (CF) patients. Chronic infections with recurrent acute exacerbations deteriorate lung function with sometimes fatal necrotizing pneumonia and septicaemia (Cepacia Syndrome). These intrinsically multi resistant bacteria are also emerging as the culprit of serious infections in non-CF settings, both in- and outside the hospital. B. cenocepacia, one of the more prevalent species in the complex, is able to avoid degradation by host macrophages by arresting (auto)phagosome maturation. We have recently shown that macrophages provide a critical site for intracellular replication of B. cenocepacia K56-2 and development of acute fatal pro-inflammatory infection in zebrafish larvae. This study further explores the zebrafish infection model to better understand bacterial and host factors involved in the difference between persistent and acute infection, and the transition between these stages.ShvR, a LysR-type transcriptional regulator of B. cenocepacia K56-2, has been shown to play an important role in the induction of pro-inflammatory responses in a rat lung infection model, but not in persistent infection. We used bioinformatics, the zebrafish infection model, and host transcriptome profiling to gain more insight into the role of ShvR in virulence, and in transition between persistent and pro-inflammatory responses. Our bioinformatics study suggests that shvR has adapted by divergent evolution, and has been lost in a subclade of the Bcc. Using the zebrafish embryo model, we demonstrate that ShvR is not important for intramacrophage stages, but is required for dissemination of B. cenocepacia K56-2 from infected macrophages and the development of pro-inflammatory fatal disease. The persistent character of the infection was confirmed by host transcriptomic analysis, giving insight into the differential host response towards the mutant compared to wildtype infection. This thesis contributes to a better understanding of the role of ShvR and its possible target genes that play an important role in acute infection and to future perspectives of development of new targets for the treatment of Bcc infections.

La première partie de ma thèse est une revue donnant un aperçu du répertoire génomique des bactéries intracellulaires et de leurs symbiotes. L'objectif de cette étude est d'explorer le processus permettant aux bactéries intracellulaires d'acquérir leur mode de vie spécifique. Nous avons commencé par examiner les données à propos de l'existence ancienne de bactéries intracellulaires, leur adaptation à leur hôte et les différences entre sympatrie et allopatrie. Une comparaison du contenu génomique de plusieurs bactéries avec différents modes de vie a révélé la capacité des bactéries à échanger des gènes à des degrés différents, en fonction de l'écosystème. La deuxième partie de ma thèse porte sur la séquence du génome de la souche Diplorickettsia massiliensis 20B qui est une bactérie intracellulaire obligatoire à Gram négatif isolée à partir des tiques de Slovaquie Ixodes ricinus. Dans ma troisième et dernière partie, nous exploré le répertoire du génome de Diplorickettsia massiliensis en le comparant aux génomes de bactéries phylogénétiquement très proches de Diplorickettsia massiliensis, issues de différentes niches. Ceci a permis de révélé son mode de vie allopatrique. Dans cette étude, nous avons comparé les caractéristiques du génome de Diplorickettsia massiliensis avec vingt-neuf espèces séquencées de Gammaproteobacteria (Legionella, Coxiella burnetii, Francisella tularensis et Rickettsiella grylli) en utilisant l'approche pangénomique multi-genre. Ce travail de thèse fournit des données originales et permet d’apporter plus de lumière sur la diversité des bactéries intracellulaires. / The initial purpose of my thesis is to understand with the help of comparative genomics, genomic variations based on coexistence, by examining data on the ancient existence of intracellular bacteria, their host adaptation and the differences between sympatry and allopatry. The first part of my thesis is a review giving insight into intracellular bacterial genome repertoire and symbionts. The goal of this review is to explore how intracellular microbes acquire their specific lifestyle. Due to their different evolutionary trajectories, these bacteria have different genomic compositions. We reviewed data on the ancient existence of intracellular bacteria, their host adaptation and the differences between sympatry and allopatry. A comparison of the genomic contents of bacteria with certain lifestyles revealed the bacterial capacity to exchange genes to different extents, depending on the ecosystem. The second part of my thesis present about the genome sequence of Diplorickettsia massiliensis strain 20B which is an obligate intracellular, gram negative bacterium isolated from Ixodes ricinus ticks collected from Slovak. In the third part, we investigated the genome repertoire of Diplorickettsia massiliensis compared to closely related bacteria according to its niche, revealing its allopatric lifestyle. In this study, we compared the genomic features of Diplorickettsia massiliensis with twenty-nine sequenced Gammaproteobacteria species (Legionella strains, Coxiella burnetii strains, Francisella tularensis strains and Rickettsiella grylli) using multi-genus pangenomic approach. This thesis work provides original data and sheds light on intracellular bacterial diversity.

Le traitement des infections intracellulaires est compliqué par la capacité des bactéries à «se cacher» à l’intérieur des cellules de l’hôte, en particulier celles du système immunitaire, entravant ainsi l’action de nombreux agents antimicrobiens. La diffusion croissante de souches résistantes est très inquiétante. Dans ce cadre, les nanoparticules (NPs) constituent une stratégie prometteuse pour administrer de manière optimisée des agents antimicrobiens.Ce travail de thèse, réalisé dans le cadre du projet européen ITN Cyclon Hit, visait à développer et caractériser des NPs biodégradables et biocompatibles chargées en antibiotiques, composés d’acide polylactique (PLA), d’acide poly (lactique-co-glycolique) (PLGA) et de polycaprolactone (PCL) ou de cyclodextrines polymérisées (pCD).Les deux premiers chapitres sont consacrés aux verrous technologiques liés à l'encapsulation de certains médicaments puissants dans les NPs polymériques. Tout d'abord, ces vecteurs ont été utilisés pour la délivrance simultanée d'une combinaison de molécules actives récemment découverte, l'éthionamide (ETH) et son Booster, pour le traitement de la tuberculose. Deuxièmement, ils ont été employés pour relever les défis liés à l'incorporation d'une quinolone de première génération, l'acide pipémidique (PIP), dans le but d'optimiser sa distribution intracellulaire dans des infections telles que la salmonellose.La co-incorporation efficace de l'ETH et du booster a dû surmonter de nombreuses difficultés liées à des problèmes de solubilité, de cristallisation et de biodisponibilité. Nos NPs en PLA et en pCD ont montré leur capacité de co-encapsuler efficacement les deux molécules et tout particulièrement celles en pCD. Elles incorporent les médicaments à la fois dans les cavités des CD et dans des microdomaines hydrophobes. Les NPs en pCD, non toxiques après administration pulmonaire répétée de fortes doses, ont été administrés in vivo par voie endotrachéale directement au site d'infection. Elles ont permis une diminution de 3-log de la charge bactérienne pulmonaire des animaux infectés après seulement 6 administrations. De même, l'incorporation de PIP a été confrontée à des défis liés à la cristallisation de PIP et à sa libération incontrôlée. Malheureusement, le PIP présentait une faible affinité pour tous les matériaux polymériques étudiés et son encapsulation physique était infructueuse. Ainsi, une approche alternative a été développée en couplant le PIP au PCL via une réaction sans catalyseur initiée par le médicament. Le conjugué PCL-PIP se auto-assemble en forme de NPs avec une charge en PIP de 27%. Cependant, le PCL-PIP n'a pas pu être dégradé in vitro, mais l’approche de synthèse de conjugués est séduisante pour obtenir de particules stables et avec un contenu important en PIP.La compréhension approfondie de la structure et de la composition du noyau et de la couronne des nanostructures contenant une ou deux molécules actives est cruciale pour leur optimisation. Les deux derniers chapitres sont donc consacrés à l'application innovante de l'AFM-IR, une méthode nanospectroscopique originale combinant la microscopie à force atomique (AFM) avec la spectroscopie infrarouge (IR), à l'analyse chimique des NPs en PLGA ou à leur détection sans marquage après internalisation dans les cellules.L’AFM-IR est capable de fournir une caractérisation chimique à l'échelle nanométrique (résolution ~10 nm). Une avancée majeure du travail est l'application du mode tapping permettant l'investigation individuelle de chaque NP. Le signal IR spécifique des composants des NPs a été utilisé pour appréhender la composition chimique de leur cœur et couronne ainsi que pour localiser précisément le médicament. De plus, l'AFM-IR en mode contact a permis pour la première fois la localisation sans marquage et l'identification chimique des NP à l'intérieur des cellules. Ce travail ouvre la voie à d'innombrables applications de cette technique dans le domaine de la nanomedecine. / The treatment of intracellular infections is very challenging given the ability of bacteria to “hide” inside the cells of the host, especially the ones of the immune system, thus hampering the action of many antimicrobial agents. The battle against these bacteria has been further exacerbated by the increasing diffusion of antimicrobial resistant strains. In this frame, nanoparticles (NPs) are a very promising strategy to overcome the limitations of free antimicrobial agents by administering them in an optimized manner.This PhD work, performed as part of the European Project ITN Cyclon Hit, aimed at the development and advanced characterisation of antibiotic-loaded biodegradable and biocompatible NPs made of poly (lactic acid) (PLA), poly (lactic-co-glycolic) (PLGA) and polycaprolactone (PCL) or of polymerised cyclodextrins (pCDs).The first two chapters are dedicated to the encapsulation of powerful but challenging drugs in polymeric NPs. Firstly, these carriers were employed for the simultaneous delivery of a potent drug combination recently discovered, ethionamide (ETH) and its booster, for tuberculosis therapy. Secondly, they were used to address the challenges related to the incorporation of a first-generation quinolone, pipemidic acid (PIP), with the aim of optimising its intracellular delivery in infections such as salmonellosis.The efficient co-incorporation of ETH and booster had to overcome several technological barriers. These drugs presented solubility, crystallisation and bioavailability-related problems which were overcome thanks to the developed NPs. Our engineered PLA and pCD NPs were both able to efficiently co-encapsulate the two molecules. Among the in depth-characterised formulations, pCDs NPs displayed the best physico-chemical properties and were shown to host the drugs both in the CD cavities and in confined spaces inside NPs crosslinked polymer. The pCD NPs were administered in vivo by endotracheal route directly to the infection site. Empty NPs were shown non-toxic after repeated pulmonary administration of high doses. Moreover, loaded pCD NPs led to a 3-log decrease in the pulmonary bacterial load of infected animals after only 6 administrations. Similarly, the incorporation of PIP faced challenges mainly related to PIP crystallization and burst release. Unfortunately, PIP displayed poor affinity for all the studied polymeric materials and its physical encapsulation was unsuccessful. Thus, an alternative approach was developed by coupling PIP to PCL by using an original catalyst-free drug-initiated reaction. The PCL-PIP conjugate self-assembled in NPs with up to 27 wt% PIP which were thoroughly characterised. However, the conjugate couldn’t be enzymatically degraded. With the design of novel PCL-PIP conjugates, this self-assembly approach could represent a promising strategy.The deep understanding of the structure and composition of complex core-corona nanocarriers containing one or two active molecules is crucial for their optimisation. The last two chapters are devoted to the innovative application of AFM-IR, an original nanospectroscopic method combining atomic force microscopy (AFM) with infrared (IR) spectroscopy, to the chemical analysis of PLGA NPs or to their label-free detection after cell internalisation.AFM-IR is able to provide chemical characterisation at the nanometer scale (resolution ~10nm). One main breakthrough here is the application of the recently developed tapping mode allowing the investigation of single polymeric NPs. The specific IR signal of NPs constituents was used to unravel the chemical composition of their core and corona as well as to precisely locate the drug. Moreover, the AFM-IR in contact mode enabled for the first time the label-free localisation and unambiguous chemical identification of NPs inside cells using the polymer IR specific response as a fingerprint. This work paves the way for countless application of this technique in the field of drug delivery.