A ce jour, l’Organisation Mondiale de la Santé estime qu’un tiers de la population mondiale est infectée par Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l’agent étiologique de la tuberculose. De par un taux de mortalité et de morbidité élevé, cette maladie infectieuse constitue un véritable fléau sanitaire au niveau mondial. <p>Mtb est un pathogène intracellulaire qui infecte son hôte par voie aérienne. In vivo, il doit faire face à une série d’environnements (phagosome, granulome) stressants de par leurs activités antimicrobiennes et par leur composition en nutriments relativement pauvre. Pour pouvoir survivre et se multiplier dans ces conditions, Mtb possède un panel de transporteurs spécifiques ainsi que toute une série de mécanismes pour contrer, voire détourner les défenses immunitaires de l’hôte. Malgré cette oppostion, les mycobactéries finissent séquestrées à l’intérieur de granulomes, structure caractéristique de la tuberculose, dans un état de dormance. La mise au point de nouveaux traitements prophylactiques et thérapeutiques nécessite la compréhension des mécanismes mis en œuvre par Mtb pour survivre et se multiplier au sein de son hôte.<p><p>Le présent travail a consisté en l’étude de mécanismes favorisant la dispersion et la survie intracellulaire de Mtb chez son hôte via: <p>1)\ / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I. Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à fluorescence. La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur. La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787, exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à la souche de laboratoire exprimant AIDA-I. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin associated with some Escherichia coli strains that might, when associated with toxin Stx2e or STb, contribute to the development of edema disease or post-weaning diarrhea in piglets. AIDA-I is an autotransporter that mediates various phenotypes such as adhesion, autoaggregation and biofilm formation. The main aim of our project was to find potential receptor(s) for AIDA-I. Pathogens can either bind cell directly by targeting exposed cell surface molecules or use an intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their target cell. Serum is known to contain a wide range of molecules so it has been used as raw material for the isolation of a putative receptor for AIDA-I. We isolated a putative receptor for AIDA-I: the apolipoprotein A-I. The interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I was confirmed by ELISA and fluorescent microscopy. The capacity to invade epithelial cell enables pathogens to create an intracellular niche that protects them against attacks from the extracellular environment. The present report has shown that the presence of AIDA-I as the sole virulence factor in a laboratory strain, enable bacteria to invade cultured cells but does not promote intracellular survival. Studies conducted on wild-type strain 2787, which express AIDA-I in association with other virulence factors, has shown a significant difference in invasion and intracellular survival phenotypes compared to the laboratory strain expressing AIDA-I.

L’invasion des ostéoblastes par Staphylococcus aureus (SA) est considérée comme responsable, au moins partiellement, de l’évolution chronique ou récurrente des infections osseuses (IO). Nous avons émis l’hypothèse que des différences d’interactions SA-ostéoblastes pouvaient être associées aux différences de présentation clinique des IO. Nous avons d’abord développé un modèle ex vivo d’infection intracellulaire d’ostéoblastes humains permettant de quantifier l’adhésion, l’invasion, la survie intracellulaire de SA et les dommages subis par les cellules infectées. Grâce ce modèle, nous avons montré que les SA communautaires résistants à la méticilline (CA-MRSA), un groupe polyphylétique de souches hypervirulentes associées à des formes aiguës et sévères d’IO, induisent une cytotoxicité supérieure à celle des MRSA hospitaliers (HA-MRSA) associés à des IO plus souvent chroniques. A l’aide de mutants isogéniques, nous avons pu démontrer que cette cytotoxicité était indépendante de la toxine de Panton-Valentine et l’alphahémolysine mais associée à la surexpression des phenol-soluble modulins (PSM) par les CA-MRSA. Ces résultats ont permis d’identifier un nouveau mécanisme de virulence des CA-MRSA basé sur l’invasion des ostéoblastes et l’activité intracellulaire des PSM. Parallèlement, nous avons montré que certains antibiotiques modifient le niveau de transcription et d’expression des protéines staphylococciques impliquées dans l’invasion des ostéoblastes, sans que nous ne puissions montrer une modification de la capacité d’invasion de S. aureus dans ce même modèle ex vivo. Nos travaux ouvrent de nouvelles perspectives dans la compréhension et la prise en charge des IO due à SA / Osteoblast invasion by Staphylococcus aureus (SA) is currently considered a putative explanatory mechanism for the chronic or recurrent nature of osteomyelitis. We raised the hypothesis that inter-strain differences in the interactions between S. aureus and osteoblasts at the cellular level could correlate with differences in the clinical presentation of osteomyelitis. We first developed an ex vivo model of intracellular bacterial challenge of human osteoblasts to quantify SA adhesion, invasion and intracellular survival as well as SA-induced damage to infected cells. By means of this model, we have demonstrated that community-acquired methicillinresistant SA (CA-MRSA) strains, which belong to a polyphyletic group endowed with high virulence and are associated with severe and acute forms of osteomyelitis, induce more cytotoxicity in osteoblasts as compared to hospital MRSA strains, which in turn are more frequently involved in chronic forms of osteomyelitis. Using isogenic CA-MRSA mutants, we determined that SA-induced osteoblast damage was independent of the production of Panton-Valentin leukocidin and alpha-toxin, but was associated with the overexpression of phenol-soluble modulins (PSMs) by CAMRSA. These findings elucidate a novel virulence strategy of CA-MRSA based on the invasion and PSM-related killing of osteoblasts. In parallel to this research, we demonstrated that several antibiotics alter the transcription and expression levels of SA adhesins involved in osteoblast invasion. However, antibiotics did not induce changes in SA invasiveness in our ex vivo infection model. Collectively, our findings provide new insights into the pathogenesis of SA osteomyelitis

L’adhésine impliquée dans l’adhérence diffuse (AIDA-I) est une adhésine bactérienne présente chez certaines souches d’Escherichia coli qui, associée aux toxines Stx2e ou STb, contribue à l’apparition de la maladie de l’œdème ou de la diarrhée post-sevrage chez les porcelets. AIDA-I est un autotransporteur qui confère des capacités d’autoaggrégation, de formation de biofilms et d’adhésion. L’objectif principal du projet de recherche consistait en la recherche de récepteur(s) potentiel(s) d’AIDA-I. Les bactéries pathogènes adhèrent aux cellules-cibles soit en liant directement des molécules à la surface cellulaire ou en utilisant des molécules intermédiaires qui permettent de diminuer la distance séparant la bactérie de la cellule-cible. Puisque le sérum est un fluide qui contient de nombreuses molécules, celui-ci a été utilisé comme matériel de départ pour l’isolement de récepteur(s) potentiels. Nous avons isolé un récepteur potentiel à partir du sérum porcin : l’apolipoprotéine A-I. L’interaction entre l’apolipoprotéine A-I et AIDA-I a été confirmée par ELISA et microscopie à fluorescence. La capacité à envahir les cellules épithéliales offre aux pathogènes la possibilité d’établir une niche intracellulaire qui les protègent contre les attaques du milieu extérieur. La présente étude a démontré que la présence d’AIDA-I en tant que seul facteur de virulence chez une souche de laboratoire permet de conférer la capacité d’envahir les cellules sans promouvoir la survie intracellulaire. L’étude de la souche sauvage 2787, exprimant AIDA-I en association avec d’autres facteurs de virulence, a démontré une différence significative pour les phénotypes d’invasion et de survie intracellulaire face à la souche de laboratoire exprimant AIDA-I. / The adhesin involved in diffuse adherence (AIDA-I) is a bacterial adhesin associated with some Escherichia coli strains that might, when associated with toxin Stx2e or STb, contribute to the development of edema disease or post-weaning diarrhea in piglets. AIDA-I is an autotransporter that mediates various phenotypes such as adhesion, autoaggregation and biofilm formation. The main aim of our project was to find potential receptor(s) for AIDA-I. Pathogens can either bind cell directly by targeting exposed cell surface molecules or use an intermediate molecule as a bridge to lessen the space separating them from their target cell. Serum is known to contain a wide range of molecules so it has been used as raw material for the isolation of a putative receptor for AIDA-I. We isolated a putative receptor for AIDA-I: the apolipoprotein A-I. The interaction between the apolipoprotein A-I and AIDA-I was confirmed by ELISA and fluorescent microscopy. The capacity to invade epithelial cell enables pathogens to create an intracellular niche that protects them against attacks from the extracellular environment. The present report has shown that the presence of AIDA-I as the sole virulence factor in a laboratory strain, enable bacteria to invade cultured cells but does not promote intracellular survival. Studies conducted on wild-type strain 2787, which express AIDA-I in association with other virulence factors, has shown a significant difference in invasion and intracellular survival phenotypes compared to the laboratory strain expressing AIDA-I.

Le genre bactérien Salmonella regroupe plus de 2500 sérovars, mais peu sont responsables de pathologies humaines. Salmonella enterica sérovar Typhi (S. Typhi) est reconnu pour son importance médicale à travers le globe. S. Typhi cause la fièvre typhoïde chez l’Homme, une maladie infectieuse létale caractérisée par la dissémination systémique de la bactérie vers des organes du système réticulo-endothélial. La fièvre typhoïde représente un fardeau pour la santé mondiale, notamment auprès des pays en développement où les conditions sanitaires sont désuètes. La situation se complique davantage par l’apparition de souches résistantes aux antibiotiques. De plus, les deux vaccins licenciés sont d’efficacité modérée, présentent certaines contraintes techniques et ne sont pas appropriés pour les jeunes enfants et nourrissons. La phase systémique de l’infection par Salmonella repose sur sa survie dans les macrophages du système immunitaire. Dans ce compartiment intracellulaire, la bactérie module les défenses antimicrobiennes grâce à de multiples facteurs de virulence encodés dans son génome. Les mécanismes moléculaires sollicités sont complexes et finement régulés. Malgré les progrès scientifiques réalisés précédemment, plusieurs incompréhensions persistent au sujet de l’adaptation de ce pathogène dans les macrophages de l’hôte. Pour mieux concevoir les déterminants génétiques de S. Typhi impliqués dans l’interaction avec ces cellules, une stratégie de sélection négative a été appliquée afin de vérifier systématiquement l’effet direct des gènes pendant l’infection. En premier temps, une librairie de mutants par transposon chez S. Typhi a été créée pour l’infection de macrophages humains en culture. Après 24 heures d’infection, la présence des mutants fut évaluée simultanément par analyse sur des biopuces de Salmonella. Au total, 130 gènes ont été sélectionnés pour leur contribution potentielle auprès des macrophages infectés. Ces gènes comptaient des composantes d’enveloppe bactérienne, des éléments fimbriaires, des portions du flagelle, des régulateurs, des facteurs de pathogenèse et plusieurs protéines sans fonction connue. En deuxième temps, cette collection de gènes a dirigé la création de 28 mutants de délétion définie chez S. Typhi. Les capacités d’entrée et de réplication intracellulaire de ces mutants au sein des macrophages humains ont été caractérisées. D’abord, les macrophages ont été co-infectés avec les mutants en présence de la souche sauvage, pour vérifier la compétitivité de chacun d’eux envers cette dernière. Ensuite, les mutants ont été inoculés individuellement chez les macrophages et leur infectivité fut mesurée comparativement à celle de la souche sauvage. Sommairement, 26 mutants ont présenté des défauts lorsqu’en compétition, tandis que 14 mutants se sont montrés défectueux lorsque testés seuls. Par ailleurs, 12 mutants ont exposé une déficience lors de l’infection mixte et individuelle, incluant les mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346 et SPI-4. Notamment, 35 nouveaux phénotypes défectueux d’entrée ou de survie intracellulaire chez Salmonella ont été révélés par cette étude. Les données générées ici offrent plusieurs nouvelles pistes pour élucider comment S. Typhi manipule sa niche intracellulaire, menant à l’infection systémique. Les gènes décrits représentent des cibles potentielles pour atténuer la bactérie chez l’humain et pourraient contribuer au développement de meilleures souches vaccinales pour immuniser contre la fièvre typhoïde. / The bacterial genus Salmonella holds over 2500 serovars, but few are responsible for human pathologies. Salmonella enterica serovar Typhi (S. Typhi) is recognized across the globe for its medical importance. S. Typhi causes typhoid fever in humans, a lethal infectious disease characterized by systemic dissemination of the bacteria to organs of the reticulo-endothelial system. Typhoid fever represents a burden for public health, notably in developing countries where sanitary conditions are obsolete. The situation is further complicated by the appearance of strains resistant to antibiotics. Moreover, both of the licensed vaccines are of moderate efficiency, present certain technical constraints and are not appropriate for young children and newborns. The systemic phase of infection by Salmonella relies on its survival within macrophages of the immune system. In this intracellular compartment, the bacterium modulates antimicrobial defenses thanks to multiple virulence factors encoded within its genome. Molecular mechanisms taking place are complex and finely regulated. Despite scientific advances made previously, many misunderstandings persist concerning the adaptation of this pathogen within host macrophages. To better conceive the genetic determinants of S. Typhi involved in interaction with these cells, a negative selection strategy was applied to systematically verify the direct effect of genes during infection. Firstly, a library of transposon insertion mutants in S. Typhi was created for infection of cultured human macrophages. After 24 hours of infection, the presence of mutants was evaluated simultaneously by analysis on Salmonella microarrays. In total, 130 genes were selected for their potential contribution within infected macrophages. These genes included bacterial envelope components, fimbrial elements, portions of the flagellum, regulators, pathogenesis factors, and many proteins of unknown function. Secondly, this collection of genes led to the creation of 28 defined deletion mutants in S. Typhi. The ability of entry and intracellular replication of these mutants within human macrophages were characterized. To start, macrophages were coinfected with mutants in the presence of the wild-type strain, in order to verify the competitiveness of each of them against the latter. Then, mutants were inoculated individually into macrophages and their infectiveness was measured in comparison with the wild-type strain. In summary, 26 mutants presented defects when in competition, whereas 14 mutants were shown defective when tested alone. Furthermore, 12 mutants exposed a deficiency during mixed and individual infection experiments, including mutants acrA, exbDB, flhCD, fliC, gppA, mlc, pgtE, typA, waaQGP, STY1867-68, STY2346, and SPI-4. In particular, 35 new defective phenotypes of Salmonella entry or intracellular survival were revealed in this study. Data generated here provides significant novel insight for elucidating how S. Typhi manipulates its intracellular niche, leading to systemic infection. Genes described represent potential targets for attenuating the bacteria in the human host and could contribute to the development of better vaccine strains to immunize against typhoid fever.

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