O arranjo oligomérico e as mudanças na estrutura polipeptídica podem influenciar fortemente na velocidade de auto-oxidação das hemoproteínas, assim como os diferentes nucleófilos que atuam neste processo em função do pH. No presente trabalho, a velocidade de auto-oxidação da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) em seu estado íntegro e do monômero d isolado é estudada em função do pH e na presença do ligante cianeto. O comportamento da curva cinética é dependente do pH, apresentando-se monofásico ou bifásico dependendo do estado de oligomerização da proteína. Assim, nos valores de pH que geram a dissociação oligomérica, a curva cinética foi bifásica. Na faixa de pH 5,9-7,3, que apresenta a proteína íntegra, foi verificado um comportamento cinético mono-exponencial. Em meio alcalino, a auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença dos ligantes hidroxila e/ou cianeto apresenta comportamento complexo, descrito pela combinação de duas cinéticas de primeira-ordem. O processo lento ocorre devido à auto-oxidação do monômero d e o processo rápido é atribuído ao trímero abc. Em pH 7,0, a cinética é mono-exponencial, indicando uma estrutura oligomérica altamente preservada. Em meio ácido, tanto a hemoglobina íntegra como o monômero d apresentam a auto-oxidação catalisada por próton. É observada, através das constantes de velocidade de auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença de cianeto, uma cooperatividade no processo rápido devido ao trímero da HbGp. Além disso, a influência do surfactante dodecil sulfato de sódio na auto-oxidação da HbGp é avaliada. Uma influência mais efetiva do SDS é constatada em pH 7,0, enquanto que, em pH 9,0, a dissociação oligomérica é a influência predominante. Provavelmente, esta diferença está relacionada ao ponto isoelétrico ácido da HbGp, que favorece a interação entre SDS e HbGp em pH 7,0, quando comparado ao pH 9,0. O mecanismo de auto-oxidação e as correlações entre a cinética e o arranjo oligomérico são discutidos em detalhes no presente trabalho. / The oligomeric assembly and the changes in the polypeptidic structure can to influence in the autoxidation rate of the heme proteins, as well as the different nucleophiles, which act in this process as a function of pH. In the present work, the autoxidation rate of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in integral state and of the isolated d monomer is studied as a function of pH and in the presence of the cyanide ligand. The kinetic decay behavior is dependent of pH, presenting mono-exponential or biexponential character, depending of the oligomeric state of the protein. Thus, in the pH values that originated the oligomeric dissociation, the kinetic decay was i-exponential. In the pH range 5.9 - 7.3, which show the whole protein, a monoexponential kinetic behavior was verified. In alkaline medium, the whole hemoglobin autoxidation in the presence of the hydroxyl and/or cyanide presents complex behavior described by the combination of two first order kinetics. The slow process occurs due to the d monomer autoxidation and the fast process is attributed to abc trimer. At pH 7.0, the kinetic is monoexponential,indicating a highly conserved oligomeric structure. In acid medium, both, the whole hemoglobin and the d monomer presented the proton-catalyzed autoxidation. A cooperativity in the fast process due to trimer of the HbGp can be observed, through the autoxidation rate constants of the whole hemoglobin in the presence of cyanide. Furthermore, the influence of the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) in the HbGp autoxidation was evaluated. At pH 7.0, it was verified a more effective influence for SDS, while at pH 9.0, the oligomeric dissociation was the main influence. Probably, this difference is related to the acid isoelectric point of the HbGp, which favors the interaction between SDS and HbGp at pH 7.0, as compared with the pH 9.0. The autoxidation mechanism and the correlation between the kinetic and the oligomeric arrangement are discussed in details in the present work.

Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituído por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação esta atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma serie de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutenção da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns dos quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma analise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trimeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia Andrei a uma resolução de 4.7Å. / Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a heterotetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites, some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia Andrei at 4.7Å.

Eritrocruorinas são hemoglobinas gigantes compostas por uma bicamada hexagonal de massa molecular total entre 3,0 e 4,0 MDa. A sua estrutura é baseada em unidades básicas chamadas protômeros. Doze destes compõem a partícula inteira, seis em cada camada hexagonal, resultando numa estrutura contendo 180 subunidades. Nas eritrocruorinas do tipo I, o protômero é constituído por quatro tipos de cadeias de globina: a, b, c, e d, e por três tipos de cadeias de linkers, L1, L2 e L3. A compreensão atual do seu mecanismo da ação esta atualmente prejudicada pela resolução limitada das estruturas cristalográficas disponíveis. Para abordar esta questão procuramos cristalizar uma serie de eritrocruorinas de espécies diversas visando a determinação das suas estruturas a mais alta resolução. Na primeira parte deste trabalho a eritrocruorina de Glossoscolex paulistus (HbGp) teve suas subunidades sequenciadas e a estrutura da partícula inteira resolvida a uma resolução de 3,2Å, a mais alta até o momento. Na estrutura da HbGp as quatro cadeias de globina se associam na forma de um heterotetrâmero, que se repete três vezes formando uma estrutura dodecamérica denominada cap. A estrutura do cap associada a um heterotrímero de linkers forma o então mencionado protômero. A estrutura completa permite uma descrição mais detalhada dos contatos entre subunidades que são essenciais para a manutenção da partícula como um todo. Além disto descrevemos sítios de ligação a metais (Zn2+ e Ca2+) e sítios de glicosilação, alguns dos quais são inéditos. Em seguida, a subunidade d isolada da HbGp foi cristalizada e resolvida a 2.1Å. Uma analise dos contatos cristalinos demonstra um arranjo completamente diferente daquilo visto para a subunidade d no complexo inteira. Ao invés de associar-se na formar trimeros, como acontece no complexo, a cadeia d isolada forma dímeros cristalográficos, com interface similar a aquela observada entre as cadeias d e a. Estas observações contribuíram para a compreensão de como são os possíveis mecanismos de associação das globinas para a montagem do cap. Finalmente, as eritrocruorinas de quatro outras espécies foram cristalizadas, que resultou na obtenção de uma estrutura cristalográfica preliminar para a eritrocruorina de Eisenia Andrei a uma resolução de 4.7Å. / Erythrocruorins are giant haemoglobins in the form of a hexagonal bilayer of total molecular mass between 3 and 4 MDa. Their structures are based on a basic unit called the protomer. Twelve of these comprise the entire particle, six in each hexagonal layer, resulting in a structure containing 180 subunits. In the type I erythrocruorins the protomer is composed of four types of globin chains: a, b, c e d, and three types of linker; L1, L2 e L3. Our current understanding of their mechanism of action is limited by the resolution of the crystal structures available. To address this question we have attempted to crystallize a series of erythrocruorins from different species with a view to determining a crystal structure at higher resolution. In the first part of this thesis all chains of the erythrocruorin from Glossoscolex paulistus were completely sequenced and the structure of the full particle solved at 3.2Å, the highest reported to date. In the structure the four globin chains associate to form a heterotetramer, three of which unite to form a dodecameric cap. The latter associates with a heterotrimer of linkers to form the aforementioned protomer. The full structure permits a more detailed description of the contacts between subunits which are essential for particle stability. Furthermore, we describe metal binding sites (Zn2+ e Ca2+) and glycosylation sites, some of which are have not been reported previously. Subsequently the isolated d chain was crystallized and solved to 2.1Å. An analysis of the crystal contacts shows an arrangement which is completely different to that seen in the full particle. Instead of forming trimers, as seen in the complex, the isolated d chain associates to form a dimer across a crystallographic twofold axis making use of the interface normally used to associate with subunit a. These observations contributed to our understanding of the possible mechanisms of association of globin chains during the formation of the cap. Finally, the erythrocruorins from four other species were crystallized, which resulted in the preliminary determination of the structure of that from Eisenia Andrei at 4.7Å.

O arranjo oligomérico e as mudanças na estrutura polipeptídica podem influenciar fortemente na velocidade de auto-oxidação das hemoproteínas, assim como os diferentes nucleófilos que atuam neste processo em função do pH. No presente trabalho, a velocidade de auto-oxidação da hemoglobina extracelular gigante de Glossoscolex paulistus (HbGp) em seu estado íntegro e do monômero d isolado é estudada em função do pH e na presença do ligante cianeto. O comportamento da curva cinética é dependente do pH, apresentando-se monofásico ou bifásico dependendo do estado de oligomerização da proteína. Assim, nos valores de pH que geram a dissociação oligomérica, a curva cinética foi bifásica. Na faixa de pH 5,9-7,3, que apresenta a proteína íntegra, foi verificado um comportamento cinético mono-exponencial. Em meio alcalino, a auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença dos ligantes hidroxila e/ou cianeto apresenta comportamento complexo, descrito pela combinação de duas cinéticas de primeira-ordem. O processo lento ocorre devido à auto-oxidação do monômero d e o processo rápido é atribuído ao trímero abc. Em pH 7,0, a cinética é mono-exponencial, indicando uma estrutura oligomérica altamente preservada. Em meio ácido, tanto a hemoglobina íntegra como o monômero d apresentam a auto-oxidação catalisada por próton. É observada, através das constantes de velocidade de auto-oxidação da hemoglobina íntegra na presença de cianeto, uma cooperatividade no processo rápido devido ao trímero da HbGp. Além disso, a influência do surfactante dodecil sulfato de sódio na auto-oxidação da HbGp é avaliada. Uma influência mais efetiva do SDS é constatada em pH 7,0, enquanto que, em pH 9,0, a dissociação oligomérica é a influência predominante. Provavelmente, esta diferença está relacionada ao ponto isoelétrico ácido da HbGp, que favorece a interação entre SDS e HbGp em pH 7,0, quando comparado ao pH 9,0. O mecanismo de auto-oxidação e as correlações entre a cinética e o arranjo oligomérico são discutidos em detalhes no presente trabalho. / The oligomeric assembly and the changes in the polypeptidic structure can to influence in the autoxidation rate of the heme proteins, as well as the different nucleophiles, which act in this process as a function of pH. In the present work, the autoxidation rate of the giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) in integral state and of the isolated d monomer is studied as a function of pH and in the presence of the cyanide ligand. The kinetic decay behavior is dependent of pH, presenting mono-exponential or biexponential character, depending of the oligomeric state of the protein. Thus, in the pH values that originated the oligomeric dissociation, the kinetic decay was i-exponential. In the pH range 5.9 - 7.3, which show the whole protein, a monoexponential kinetic behavior was verified. In alkaline medium, the whole hemoglobin autoxidation in the presence of the hydroxyl and/or cyanide presents complex behavior described by the combination of two first order kinetics. The slow process occurs due to the d monomer autoxidation and the fast process is attributed to abc trimer. At pH 7.0, the kinetic is monoexponential,indicating a highly conserved oligomeric structure. In acid medium, both, the whole hemoglobin and the d monomer presented the proton-catalyzed autoxidation. A cooperativity in the fast process due to trimer of the HbGp can be observed, through the autoxidation rate constants of the whole hemoglobin in the presence of cyanide. Furthermore, the influence of the anionic surfactant sodium dodecyl sulfate (SDS) in the HbGp autoxidation was evaluated. At pH 7.0, it was verified a more effective influence for SDS, while at pH 9.0, the oligomeric dissociation was the main influence. Probably, this difference is related to the acid isoelectric point of the HbGp, which favors the interaction between SDS and HbGp at pH 7.0, as compared with the pH 9.0. The autoxidation mechanism and the correlation between the kinetic and the oligomeric arrangement are discussed in details in the present work.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3.600 kDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta proteína apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho, foi realizado o estudo da estabilidade da oxi-HbGp frente aos processos de dissociação oligomérica e desnaturação, utilizando duas classes de desnaturantes, ou seja, o surfactante brometo de dodeciltrimetilamônio (DTAB), e os agentes caotrópicos cloridrato de guanidina (GuHCl) e ureia. Convém mencionar ainda, que este estudo foi desenvolvido através do uso de duas sondas fluorescentes, 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS) e fluoresceína isotiocianato (FITC), usando as técnicas de absorção óptica, fluorescência estática, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e fluorescência resolvida no tempo. Os resultados de fluorescência estática mostram que o DTAB induz um aumento na intensidade de emissão de fluorescência da sonda ANS, com o deslocamento do máximo de emissão para o azul de 517 para 493 nm. Duas transições são observadas, em 2,5 e 9,5 mmol/L de DTAB, e estão associadas à interação da sonda ANS com agregados pré-micelares e micelas, respectivamente. Na oxi-HbGp, ANS liga a sítios menos expostos ao solvente, quando comparado às micelas de DTAB, caracterizados pela emissão em 467-472 nm. A adição de DTAB ao sistema oxi-HbGp-ANS, no pH 7,0, induz a agregação da proteína, a dissociação oligomérica e desenovelamento da oxi-HbGp. No pH 5,0, a formação de agregados não foi observada. Além disso, o processo de desenovelamento induzido pelo DTAB apresenta duas transições, a primeira em virtude da dissociação oligomérica, e a segunda, provavelmente, devido à desnaturação das subunidades dissociadas. Por outro lado, GuHCl e ureia com concentrações acima de 1,5 e 4,0 mol/L respectivamente, induzem a desnaturação completa da oxi-HbGp, com redução dos grupos hidrofóbicos na superfície da proteína, e o deslocamento do ANS para o meio aquoso, detectado pela redução de intensidade de fluorescência. A técnica de fluorescência resolvida no tempo permitiu avaliar os valores dos tempos de vida para a sonda 1,8-ANS, bem como, para oxi-HbGp. Por último, a oxi-HbGp foi marcada com a sonda covalente fluoresceína isotiocianato (FITC) em dois valores de pH 7,0 e 9,0, e nas proporções sonda:heme de 1:5 e 2:1. A quantidade de FITC efetivamente ligada a oxi-HbGp por heme foi estimada a partir dos dados de absorção óptica. Supondo que o rendimento quântico de FITC no tampão é 100%, os rendimentos quânticos de FITC ligada a oxi-HbGp também foram encontrados. Além disso, estudos preliminares de dissociação e desnaturação da oxi-HbGp marcada com FITC, na presença do surfactante DTAB, foram realizados. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3,600 kDa, a high oligomeric stability, resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this study, the oxy-HbGp stability, as well as, the oligomeric dissociation and unfolding processes were studied, using two types of denaturants,the surfactant Dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB), and chaotropic agents guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea. Moreover, this study was developed based on 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) and fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence probes, using the techniques of optical absorption, static fluorescence, dynamic light scattering (DLS) and time resolved fluorescence. The results of static fluorescence show that dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB) induces an increase in ANS fluorescence emission intensity, with maximum emission wavelength blue-shifted from 517 to 493 nm. Two transitions are noticed, at 2.50 and 9.50 mmol/L of DTAB, assigned to ANS interaction with pre-micellar aggregates and micelles, respectively. In oxy-HbGp, ANS binds to protein sites less exposed to solvent, as compared to DTAB micelles, characterized by emission at 467 - 472 nm. At pH 7.0, the addition of DTAB to the oxy-HbGp-ANS system induced the protein aggregation, oligomeric dissociation and unfolding of oxy-HbGp. At pH 5.0, no formation of aggregates was observed. Moreover, DTAB-induced unfolding process displays two transitions, one due to oligomeric dissociation and the second one, probably, due to the denaturation of dissociated subunits. On the other hand, guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea, at concentrations above 1.5 and 4.0 mol/L, respectively, induce the full HbGp denaturation, with reduction of ANS-bound oxy-HbGp hydrophobic patches on the surface of the proteins. The shift of ANS to the aqueous medium was detected by the reduction in the fluorescence intensity. Time resolved fluorescence technique allowed to evaluate the lifetimes of ANS, as well as, for oxy-HbGp. Finally, oxy-HbGp was labeled with covalent probe fluorescein isothiocyanate (FITC), at pH values 7.0 and 9.0, and at probe: heme ratios of 1:5 and 2:1. The quantity of FITC effectively bound to oxy-HbGp, on the heme basis was estimated from the optical absorption data. Assuming a 100% quantum yield for FITC in buffer, the quantum yield of FITC bound to oxy-HpGp was also estimated. In addition, preliminary studies of dissociation and denaturation of oxy-HbGp labeled with FITC, in the presence of DTAB surfactant, were accomplished.

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3.600 kDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta proteína apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho, foi realizado o estudo da estabilidade da oxi-HbGp frente aos processos de dissociação oligomérica e desnaturação, utilizando duas classes de desnaturantes, ou seja, o surfactante brometo de dodeciltrimetilamônio (DTAB), e os agentes caotrópicos cloridrato de guanidina (GuHCl) e ureia. Convém mencionar ainda, que este estudo foi desenvolvido através do uso de duas sondas fluorescentes, 1-Anilino-8-naftaleno-sulfonato (1,8-ANS) e fluoresceína isotiocianato (FITC), usando as técnicas de absorção óptica, fluorescência estática, espalhamento de luz dinâmico (DLS) e fluorescência resolvida no tempo. Os resultados de fluorescência estática mostram que o DTAB induz um aumento na intensidade de emissão de fluorescência da sonda ANS, com o deslocamento do máximo de emissão para o azul de 517 para 493 nm. Duas transições são observadas, em 2,5 e 9,5 mmol/L de DTAB, e estão associadas à interação da sonda ANS com agregados pré-micelares e micelas, respectivamente. Na oxi-HbGp, ANS liga a sítios menos expostos ao solvente, quando comparado às micelas de DTAB, caracterizados pela emissão em 467-472 nm. A adição de DTAB ao sistema oxi-HbGp-ANS, no pH 7,0, induz a agregação da proteína, a dissociação oligomérica e desenovelamento da oxi-HbGp. No pH 5,0, a formação de agregados não foi observada. Além disso, o processo de desenovelamento induzido pelo DTAB apresenta duas transições, a primeira em virtude da dissociação oligomérica, e a segunda, provavelmente, devido à desnaturação das subunidades dissociadas. Por outro lado, GuHCl e ureia com concentrações acima de 1,5 e 4,0 mol/L respectivamente, induzem a desnaturação completa da oxi-HbGp, com redução dos grupos hidrofóbicos na superfície da proteína, e o deslocamento do ANS para o meio aquoso, detectado pela redução de intensidade de fluorescência. A técnica de fluorescência resolvida no tempo permitiu avaliar os valores dos tempos de vida para a sonda 1,8-ANS, bem como, para oxi-HbGp. Por último, a oxi-HbGp foi marcada com a sonda covalente fluoresceína isotiocianato (FITC) em dois valores de pH 7,0 e 9,0, e nas proporções sonda:heme de 1:5 e 2:1. A quantidade de FITC efetivamente ligada a oxi-HbGp por heme foi estimada a partir dos dados de absorção óptica. Supondo que o rendimento quântico de FITC no tampão é 100%, os rendimentos quânticos de FITC ligada a oxi-HbGp também foram encontrados. Além disso, estudos preliminares de dissociação e desnaturação da oxi-HbGp marcada com FITC, na presença do surfactante DTAB, foram realizados. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3,600 kDa, a high oligomeric stability, resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this study, the oxy-HbGp stability, as well as, the oligomeric dissociation and unfolding processes were studied, using two types of denaturants,the surfactant Dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB), and chaotropic agents guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea. Moreover, this study was developed based on 8-anilino-1-naphtalene-sulfonic acid (ANS) and fluorescein isothiocyanate (FITC) fluorescence probes, using the techniques of optical absorption, static fluorescence, dynamic light scattering (DLS) and time resolved fluorescence. The results of static fluorescence show that dodecyl-trimethylammonium bromide (DTAB) induces an increase in ANS fluorescence emission intensity, with maximum emission wavelength blue-shifted from 517 to 493 nm. Two transitions are noticed, at 2.50 and 9.50 mmol/L of DTAB, assigned to ANS interaction with pre-micellar aggregates and micelles, respectively. In oxy-HbGp, ANS binds to protein sites less exposed to solvent, as compared to DTAB micelles, characterized by emission at 467 - 472 nm. At pH 7.0, the addition of DTAB to the oxy-HbGp-ANS system induced the protein aggregation, oligomeric dissociation and unfolding of oxy-HbGp. At pH 5.0, no formation of aggregates was observed. Moreover, DTAB-induced unfolding process displays two transitions, one due to oligomeric dissociation and the second one, probably, due to the denaturation of dissociated subunits. On the other hand, guanidine hydrochloride (GuHCl) and urea, at concentrations above 1.5 and 4.0 mol/L, respectively, induce the full HbGp denaturation, with reduction of ANS-bound oxy-HbGp hydrophobic patches on the surface of the proteins. The shift of ANS to the aqueous medium was detected by the reduction in the fluorescence intensity. Time resolved fluorescence technique allowed to evaluate the lifetimes of ANS, as well as, for oxy-HbGp. Finally, oxy-HbGp was labeled with covalent probe fluorescein isothiocyanate (FITC), at pH values 7.0 and 9.0, and at probe: heme ratios of 1:5 and 2:1. The quantity of FITC effectively bound to oxy-HbGp, on the heme basis was estimated from the optical absorption data. Assuming a 100% quantum yield for FITC in buffer, the quantum yield of FITC bound to oxy-HpGp was also estimated. In addition, preliminary studies of dissociation and denaturation of oxy-HbGp labeled with FITC, in the presence of DTAB surfactant, were accomplished.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.

A hemoglobina extracelular gigante do anelídeo Glossoscolex paulistus (HbGp) é homológa à hemoglobina da Lumbricus terrestris (HbLt). Baseado nos estudos de MALDI-TOF-MS foi determinada a massa molecular (MM) das subunidades da HbGp. Entretanto, ainda não era possível propor o valor exato da MM para a HbGp íntegra, pois a estequiometria deste oligômero ainda não era totalmente clara. Este trabalho objetiva avaliar a massa molecular do oligômero em dois estados de oxidação: oxi- e cianometa-HbGp, bem como avaliar a estabilidade desta proteína, ou seja, a dissociação e desnaturação em função do pH em meio ácido. O estudo por ultracentrifugação analítica permitiu uma avaliação independente da massa molecular da HbGp. Valores de MM de 3600 ± 100 e 3700 ± 100 kDa foram obtidos para a oxi- e cianometa-HbGp, respectivamente. Estes valores está de acordo com a massa esperada, assumindo a estequiometria proposta por Vinogradov para a HbLt. Os dados de ultracentrifugação para as amostras do monômero d puro mostraram um coeficiente de sedimentação de 1,95 ± 0,04 S para ambos os valores de pH 7,0 e 10,0. Além disso, as distribuições c (s) do monômero d puro indicaram que uma pequena contribuição (5%) de dímero de monômeros, d2, com valores de s020,w de 3,2 S estava presente em solução. Para a oxi-HbGp íntegra no pH 10,0 nenhuma contribuição em 58 - 59 S foi observada, sugerindo completa dissociação oligomérica. As distribuições c (s) mostraram dois picos adicionais em relação ao monômero puro: um pico em 4,2 - 4,4 S, que está associado ao trímero, abc; e um segundo pico em 5,8 - 6,0 S, que poderia ser associado ao tetrâmero, abcd. A adição de β-mercaptoetanol leva ao desaparecimento do pico em 4,2 S, consistente com a redução das pontes dissulfeto do trímero abc e produção dos monômeros a, b e c. Cerca de 19 % da forma cianometa-HbGp íntegra coexiste em equilíbrio com as subunidades dissociadas. Finalmente, estudos em meio ácido mostravam que na faixa de pH 5,0 - 7,0 as três formas de oxidação de HbGp apresentaram alta estabilidade oligomérica. Abaixo de pH 5,0 os dados de fluorescência mostrava que a estabilidade diminui na sequência cianometa > oxi > meta. Assim a estabilidade das formas oxi-, meta- e cianometa-HbGp foi avaliada, ficando evidenciada a maior estabilidade da forma cianometa-HbGp. / The giant extracellular hemoglobin of Glossoscolex paulistus (HbGp) is homologous to Lumbricus terrestris (HbLt). Based on MALDI-TOF-MS the molecular masses (MM) of HbGp subunits were determined. However, the exact value of the MM for the HbGp oligomer is not known. This study has as a main goal to evaluate the molecular weight of the oligomer in two oxidation states: oxy- and cyanomet-HbGp. Also the stability of the protein dissociation and denaturation as a function of pH was monitored. The present analytical ultracentrifugation study allowed us to assess the molecular mass of the whole oligomer giving valores of MM of 3600 ± 100 and 3700 ± 100 kDa for the oxy- and cyanomet-HbGp, respectively. These values are in agreement with the expected mass based on Vinogradov model for HbLt. Data were obtained of so20, w for the pure monomer d as 1.95 ± 0.04 S for both pH values 7.0 and 10.0. C(s) distributions for pure monomer indicated that a small contribution of dimer of monomers (5%), d2, was also present with so20, w of 3.2 S in solution. For the whole oxy- HbGp at pH 10.0 no contribution at 58 - 59 S was observed, suggesting complete oligomeric dissociation. C(s) distribution showed two additional peaks as compared to pure monomer: a peak at 4.2 - 4.5 S, probably due to the trimer, abc; a second peak at 5.8 - 6.0 S, that could be associated to the tetramer, abcd. Addition of beta-mercaptoethanol leads to the disappearance of the peak at 4.2 S, consistent with the reduction of the trimer abc disulfide bridges and production of monomers a, b and c. It may be noted that about 19% of cyanomet-HbGp, undissociated, coexist in equilibrium with the isolated subunits. Finally, studies in acidic pH values show that in the pH range 5.0-7.0 the oligomeric stability for the three oxidation forms of HbGp is quite high. Below pH 5.0, fluorescence emission data suggest that the stability is reduced in the following order: cyanomet > oxy > met-HbGp. Thus the stability of the oxy-, meta- and cyanomet-HbGp forms was evaluated evidenced making it clear the higher stability of the cyanomet-HbGp.