Les mitochondries sont des organites présents dans la plupart des cellules eucaryotes et spécialisés dans la production d’énergie, via la chaîne respiratoire localisée dans leur membrane interne. les mitochondries possèdent leur propre génome et leur propre système d’expression participant à la biogenèse des complexes respiratoires. En particulier la machinerie de traduction mitochondriale, comme les complexes respiratoires, est d’origine génétique double, nucléaire et mitochondriale. de nombreuses maladies humaines résultent de défauts de l’expression des gènes mitochondriaux et en particulier de mutations de facteurs impliqués dans la traduction mitochondriale. la levure schizosaccharomyces pombe est un modèle de choix pour identifier ces facteurs et comprendre leur fonctionnement car c’est un micro-organisme simple et physiologiquement plus proche des eucaryotes supérieurs que ne l’est saccharomyces cerevisiae. Lors de ma thèse j’ai tout d’abord participé à la mise en place de nouveaux outils permettant de mieux comprendre le fonctionnement de la traduction mitochondriale, en étiquetant le mitoribosome de s. pombe au niveau de la petite et de la grande sous-unité. Par la suite j’ai mis au point des expériences de fractionnement sur gradient de saccharose pour analyser la sédimentation du ribosome associé ou dissocié et tester si des facteurs donnés sont liés au mitoribosome. Dans un second temps je me suis intéressé à des facteurs qui pouvaient être impliqués dans la terminaison de la traduction. En fait le seul facteur de reconnaissance des codons stop connu chez s. pombe, Mrf1, n’est pas essentiel, et j’ai cherché à comprendre pourquoi. Deux enzymes, des peptidyl ARNt hydrolase (PPR) nommées PPR3 et PPR4 possédant toutes deux un motif GGQ comme Mrf1, semblaient être de bons candidats pour expliquer que s. pombe puisse se passer de Mrf1. J’ai montré que ces facteurs jouent un rôle dans la biogenèse mitochondriale et plus précisément que PPR4 est à la fois un suppresseur multicopie et un gène létal synthétique de l’absence de Mrf1. Pour finir j’ai travaillé sur une famille de protéines de s. pombe prédites comme impliquées dans le métabolisme des ARN mitochondriaux : les protéines à pentatrico peptide repeat (PPR). Ainsi il existe au moins 9 protéines PPR chez s. pombe nommée de PPR1 à PPR8 ainsi que l’ARN polymérase mitochondriale, Rpo41. L’étude de ces protéines PPR a permis de mettre en évidence qu’elles interviennent toutes dans le métabolisme des ARN à différentes étapes, majoritairement stabilité et traduction, et qu’elles ont souvent des cibles spécifiques. Par exemple la protéine PPR3 est impliquée dans la stabilité du petit ARNr rns alors que PPR4 est un activateur spécifique de la traduction de cox1 et que PPR2 est un activateur général de la traduction mitochondriale dont la cible reste à définir. Globalement, ces travaux montrent que s. pombe est un excellent modèle des fonctions mitochondriales, aussi bien pour les études fondamentales que comme outil pour appréhender les organismes plus complexes comme l’homme. / Mitochondria are organelles present in most eukaryotic cells and specialized in the production of energy via the respiratory chain located in their inner membrane. Mitochondria have their own genome and their own system of gene expression, which is involved in the biogenesis of the respiratory complexes. The mitochondrial translation machinery, like the respiratory complexes, has a dual genetic origin, both nuclear and mitochondrial. Numerous human diseases result from defects in the expression of mitochondrial genes and especially mutations of factors involved in mitochondrial translation. The yeast Schizosaccharomyces pombe is a useful model for the identification and functional analysis of these factors because it is a simple organism that is physiologically closer to higher eukaryotes than Saccharomyces cerevisiae. During my PhD I first participated in the development of new tools to further our understanding of mitochondrial translation, by tagging the small and large subunits of S. pombe mitoribosome. In addition I set up fractionation experiments on sucrose gradients to analyze the sedimentation of associated or dissociated mitochondrial ribosomes and test whether given factors are bound to mitoribosome. I also became interested in factors that could act in the termination mitochondrial translation. Surprisingly, the only factor known to recognize stop codons in S. pombe, Mrf1, is not essential, thus I tried to determine which other proteins might also be involved in translation termination. S. pombe contains four predicted peptidyl tRNA hydrolases (Pth), two of which, Pth3 and Pth4, have a GGQ motif like Mrf1, which is thought to contribute directly to the hydrolysis of the peptidyl-tRNA bond. Thus they seemed to be good candidates to explain how S. pombe can survive without Mrf1. I have shown that Pth3 and Pth4 play a role in mitochondrial biogenesis and that Pth4 is both a high copy suppressor and a synthetic lethal of the ∆mrf1 mutant. Finally I worked on the Pentatrico Peptide Repeat family of proteins (PPR), predicted to be involved in the metabolism of mitochondrial RNA. There are at least nine PPR proteins in S. pombe named Ppr1 to Ppr8 and the mitochondrial RNA polymerase, Rpo41. The study of these PPR proteins has shown that all of them are involved in the metabolism of RNA at different stages, mainly stability and translation, and that they often have specific targets. For example Ppr3 is involved in the stability of the small rRNA rns while Ppr4 is a specific activator of the translation of cox1 and Ppr2 is a general activator of mitochondrial translation whose target remains to be identified. Overall, these studies show that S. pombe is an excellent model for mitochondrial functions, both for fundamental studies and as a tool for understanding more complex organisms such as man.

Le mécanisme d’épissage dans les organites est décrit comme étant l’ancêtre du spliceosome nucléaire. Cependant même si les protéines composant ce dernier sont bien connues, seulement quelques facteurs d’épissage ont été identifiés et caractérisés dans les chloroplastes et les mitochondries. Beaucoup de protéines ayant la faculté de se lier à l’ARN ont acquis des fonctions dans l’épissage, en effet un certain nombre de protéines sans véritable lien ont un rôle essentiel, avec différents degrés de spécificité dans l’épissage de la plupart des introns chloroplastiques chez les plantes. La plus grande famille de protéines se liant à l’ARN est la famille des protéines à domaines « pentatricopetide repeat » (PPR). Ces protéines sont impliquées dans la plupart des processus post-transcriptionnels dans les organites. En 2006, parmi les centaines de protéines PPR décrites chez les plantes, seulement une PPR avait été décrite comme nécessaire à l’épissage d’un intron. Ainsi, PPR4 est absolument et spécifiquement nécessaire pour l’épissage en trans de l’intron 1 de rps12 dans les plastes (Schmitz-Linneweber et al., 2006), suggérant que d’autres protéines PPR pourraient être impliquées dans l’épissage des ARN des organites. Le sujet de cette thèse porte sur la caractérisation d’autres protéines PPR impliquées dans ce processus. En utilisant des approches de génétique inverse et des outils mis en place dans le cadre de la thèse afin de détecter des défauts d’épissage par PCR quantitative, sept nouvelles PPRs impliquées dans l’épissage d’un certain nombre d’introns dans les plastes et les mitochondries ont pu être caractérisées. Dans l’optique de rechercher si des protéines PPR, impliquées dans l’épissage mais aussi dans l’édition des ARN, interagissent avec d’autres protéines, des approches de TAP-TAG ont été réalisées et sont également présentées dans ce manuscrit. L’identification de partenaires protéiques pour 3 PPRs impliquées, nous a ainsi permis de redessiner nos modèles et d’émettre de nouvelles hypothèses. Enfin, une dernière partie est consacrée à la découverte d’isoformes d’épissage pour des gènes PPR sans introns. Phénomène qui permettrait de réguler l’expression des gènes PPR, et/ou d’augmenter la diversité des protéines PPR. / The RNA splicing mechanism in organelles is described to be ancestral to that of the nuclear spliceosome. However, whereas this last complex is well known, only very few splicing factors have been identified and characterized in chloroplasts and mitochondria. Many RNA binding proteins have acquired roles in RNA splicing, and indeed a variety of often unrelated RNA binding proteins have essential functions in splicing of many plastid introns in plants, with varying degrees of specificity. The largest family of RNA binding proteins in plant organelles is the pentatricopeptide repeat (PPR) family. PPR proteins are involved in diverse post-transcriptional processes in organelles. In 2006, among hundreds of higher plant proteins of this family, only one was described as being required for a splicing event - PPR4 was shown to be absolutely and specifically required for the trans-splicing of the rps12 intron 1 in plastids (Schmitz-Linneweber et al., 2006). The main purpose of this PhD thesis was to characterize other PPR proteins involved in this process. By using a reverse genetics approach and by developing tools for the detection of splicing defects, seven new PPR proteins involved in RNA splicing of a subset of chloroplast or mitochondria introns have been characterized. In parallel, in order to characterize proteins involved in PPR-containing complexes, a TAP-TAG approach has been carried out on a few PPR proteins involved in splicing or editing of organellar RNA. The identification of partner proteins of 3 PPR proteins allows us to draw new mechanistic models and new hypotheses. Finally, the final part of the manuscript describes the discovery of splicing isoforms of PPR-encoding mRNAs. Alternative splicing may be involved in regulation of PPR gene expression and/or in increasing the diversity of the PPR protein family.

三十五肽重複蛋白是線粒體和葉綠體中與RNA轉錄后加工相關的一個家族蛋白。PPR蛋白特異性的和RNA結合，在RNA編輯，剪接，形成成熟的5’端以及蛋白質翻譯等方面起著重要作用。由於PPR蛋白家族很龐大，目前很多PPR蛋白的功能還未知。在這個論文里，我們對兩個三十五肽重複蛋白 PPR1703和 PPR87進行了分子水平上的功能分析。 / PPR1703基因編碼一個含有17個重複結構的P型PPR蛋白。GFP螢光定位的結果顯示，這個蛋白定位於線粒體。爲了研究這個蛋白的功能，我們從UniformMu突變群中分離了ppr1703-1突變體。在ppr1703-1突變體中，PPR1703基因的表達完全喪失。這個基因的突變抑制了胚和胚乳的發育，導致空果皮（emp）表型。這個基因的突變導致部份花粉的發育不良，從而破壞了3:1的分離比。通過比較野生型和突變體線粒體基因的表達發現，nad7第二個內含子的剪接功能在突變體中幾乎喪失。隨後的研究發現，PPR1703基因缺失突變體無法組裝線粒體複合物一，喪失線粒體複合物一活性進而誘導了與交替氧化途徑相關的基因的表達。我們的實驗結果證明，PPR1703基因負責線粒體基因nad7第二個內含子的剪接，並且影響了玉米胚和胚乳的發育。 / PPR87基因編碼一個定位於線粒體的E型PPR蛋白。在PPR87基因缺失型突變體中，有3個線粒體編輯位點的功能消失，他們分別是：NADH脫氫酶1的740編輯位點，NADH脫氫酶7的739編輯位點和膜定位和轉運蛋白的139位點。還有3個編輯位點的功能減低，他們分別是：NADH脫氫酶4L的110位點，膜定位和轉運蛋白的138位點和细胞色素C成熟蛋白亚基的1492位點。在PPR1703突變體中，胚和胚乳的發育受到抑制。我們的工作證明PPR87基因負責多個線粒體RNA位點的編輯，這個基因的突變破壞了線粒體的正常功能，進而影響了種子發育。 / Pentatricopeptide repeat proteins (PPR) are a large family of proteins in land plants with functions implicated in RNA processing in mitochondria and chloroplasts. Each PPR protein is believed to recognize and bind specifically its target sequence in the transcript, performing the function of RNA editing, splicing, 5’ and 3’ end maturation and protein translation regulation. Because of the family size, functions of many PPRs are unknown. In this thesis, we demonstrate the molecular characterization of PPR1703 and PPR87 in maize. / PPR1703 is a P subclass PPR protein, containing 17 PPR repeats. PPR1703-GFP analysis indicated that PPR1703 is targeted to the mitochondrion, which is consistent with bioinformatics prediction. To reveal its function, we isolated a Mutator (Mu) insertional mutant from the UniformMu population in maize, named ppr1703-1. The insertion abolishes the expression of PPR1703, constituting a null allele. The mutant shows severely arrested embryo and endosperm development, causing an empty pericarp phenotype. Its pollen development is partially affected, causing a distortion from 3:1 segregation. Comparative study of the entire mitochondrial transcripts between the WT and the mutant revealed that the nad7 intron 2 splicing is dramatically reduced in the mutant. This deficiency is accompanied by reduced mitochondrial complex I assembly and its activity. These results indicate that PPR1703 is required for mitochondrial nad7 intron 2 splicing and embryogenesis and endosperm development in maize. / PPR87 is an E subclass of the PLS subfamily PPR protein, which was showed to be targeted to mitochondria as well. The Mu-insertional mutant showed embryo and endosperm development arrest at coleoptilar stage. Analysis of the mitochondrial transcripts revealed that loss function of the PPR87 abolishes the C-to-U editing of multiple sites including nad1-740, nad7-739 and mttB(orfX)-139; and also significantly decreases the editing in nad4L-110, mttB(orfX)-138 and ccmFn-1492. These results indicate that PPR87 functions in the C-to-U editing of multiple sites in several transcripts and such editing is essential to the mitochondrial function, thus the embryogenesis and endosperm development in maize. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Detailed summary in vernacular field only. / Yang, Yanzhuo. / Thesis (Ph.D.) Chinese University of Hong Kong, 2014. / Includes bibliographical references (leaves 79-98). / Abstracts also in Chinese. / Yang, Yanzhuo.

Dans les organites des plantes, l’édition de l’ARN consiste majoritairement en une désamination de cytidines à des sites spécifiques de l’ARNm. Trente-quatre sites d’édition ont été découverts dans les transcrits chloroplastiques d’Arabidopsis thaliana et plus de 500 dans les transcrits mitochondriaux. Depuis 2005, beaucoup de facteurs d’édition ont été trouvés. La majorité de ces protéines appartiennent à la famille des «PentatricoPeptide Repeat» (PPR). Parmi ces PPR, certaines contiennent un domaine DYW possédant de faibles similarités avec les cytidines désaminases (CDA), alors que d’autres en sont dénuées, générant un doute sur le fait qu’il ait une activité CDA. Le gène At1g47580 (DYW1) code une protéine unique chez Arabidopsis thaliana contenant «seulement» un domaine DYW. Il a été proposé que DYW1 puisse interagir avec les PPR ne contenant pas de domaine DYW, pour former un hétérodimère, capable d’éditer spécifiquement un site. En accord avec cette hypothèse, nous avons montré que DYW1 agissait sur le même site d’édition que CRR4, une PPR sans domaine DYW, et que ces protéines interagissaient in vivo. De plus, nous avons montré que DYW1 remplaçait les parties manquantes de CRR4 pour l’édition. Pour obtenir plus d’informations sur la fonction du domaine DYW, des mutations ont été introduites dans DYW1. Nous avons montré que la signature CDA dans les protéines DYW était essentielle à l’édition de l’ARN ainsi qu’à l’interaction avec les ions zinc. Les données sont en accord avec l’hypothèse d’une activité CDA dans le domaine DYW. Cependant, aucune activité CDA n’a pu être mise à jour in vitro. Il est vraisemblable qu’au moins un cofacteur doive encore être identifié. / In plant organelles, RNA editing mostly takes the form of conversions of cytidines to uridines at specific sites in mRNAs. Thirty-four editing sites have been found in Arabidopsis thaliana chloroplast transcripts and more than 500 sites in mitochondrial transcripts. Since 2005, lots of proteins have been found to act as RNA editing factors. Most of these proteins belong to the PentatricoPeptide Repeat (PPR) family. Amongst these PPR, some contain a DYW domain with weak similarity to cytidine deaminases (CDA), whilst others lack such a domain, creating doubts about whether this domain is required for editing. The gene At1g47580 (named DYW1) encodes a protein in Arabidopsis thaliana that contains “only” a DYW domain. Our initial hypothesis was that DYW1 might interact with PPR proteins that lack a DYW domain, in order to form a heterodimer, able to perform site-specific editing. In accordance with this hypothesis, we discovered that DYW1 is involved in editing the same site as CRR4, a PPR lacking a DYW domain, and that these two proteins interact together in vivo. Moreover, we showed that DYW1 replaces all the missing parts of CRR4 for editing. So, other partners need to be hypothesized for other DYW-lacking editing factors if this hypothesis is to be generalized. The highly conserved residues making up the CDA signature in DYW proteins were found to be essential for RNA editing and are also required for zinc binding, which is a known characteristic of CDAs. All the data so far are consistent with the DYW domain being (part of) a CDA activity; nevertheless, no CDA activity could be detected in vitro. It is likely that at least one required cofactor remains to be identified.

The Pentatricopeptide Repeat (PPR) gene family produces RNA-binding proteins that target organellar transcripts. The PPR family is expanded in land plants, with nearly 450 genes identified in Arabidopsis thaliana. In plants with a Cytoplasmic Male Sterility (CMS) phenotype, members of the PPR family can act as a RESTORER OF FERTILITY (Rf) and are part of a subset of genes called RESTORER OF FERTILITY-LIKE (RFL). Unlike other PPR transcripts, RFL transcripts are targets of both microRNA (miRNA) and trans-acting siRNA (tasiRNA) and produce secondary siRNA after initial miRNA- or tasiRNA-guided cleavage. We utilized the A. lyrata genome assembly and high-throughput sequencing of small RNA to examine the evolutionary dynamics of the PPR gene family and the pattern of small RNA targeting of RFL transcripts. We found an expanded set of 539 PPR genes in A. lyrata, 51 of which were in the RFL group, often in multiple collinear copies when compared to their A. thaliana orthologs. In-species RFL paralogs appear to be more related to one another than to their collinear orthologs, which is possible evidence of gene conversion or ectopic recombination. miRNA targeting of RFL transcripts is largely conserved with nearly two-thirds of all target sites maintained. TasiRNA targeting was less conserved with roughly one-third of comparable validated tasiRNA targets maintained in both species. However, when clusters of potential tasiRNA targets were considered, roughly two-thirds of target sites are conserved. Production of secondary siRNA from A. lyrata PPR transcripts is less well defined than in A. thaliana, with strong signals coming from phases that are not concordant with the miRNA- or tasiRNA-guided cleavage sites. / Graduation date: 2013

La RNase P est impliquée dans la maturation des ARNt en libérant l’extrémité 5’ leader des précurseurs d’ARNt. Jusqu’à récemment, il était admis que cette enzyme soit universellement conservée en tant que complexe ribonucléoprotéique. La rupture avec le modèle établi est venue avec l’identification d’une RNase P uniquement protéique dans les mitochondries humaines et chez les plantes. Ces protéines, nommées PRORP (PROteinaceous RNase P), présentent trois paralogues chez Arabidopsis, qui sont localisés soit dans les organelles (PRORP1), soit dans le noyau (PRORP2 et 3). Des tests d’activité in vitro montrent que les protéines PRORP possèdent seules une activité RNase P. L’étude de lignées ADN-T indique que la fonction des protéines PRORP est essentielle et la fonction de PRORP2 et 3 est redondante. L’analyse des lignées de dérégulation montre que les protéines PRORP possèdent une diversité de substrat et que la RNase MRP, une autre ribonucléoprotéine, n’est pas impliquée dans la maturation des ARNt. Ainsi les protéines PRORP seraient bien les seules enzymes impliquées dans la maturation de l’extrémité 5’ des ARNt chez Arabidopsis. / RNase P is involved in the maturation of tRNA precursors by cleaving their 5’ leader sequences. Until recently this enzyme was considered to be universally occurring as a ribonucleoprotein complex. The breakthrough from the existing model came with the identification of protein-only RNase P in human mitochondria as well as in plants. These proteins that we called PRORP (PROteinaceous RNase P) have three paralogs in Arabidopsis, which are localised in organelles (PRORP1) and nuclei (PRORP2 and 3). We have shown that PRORP proteins have RNase P activity in vitro as single proteins. In vivo the functions of PRORP proteins are essential and the function of PROPR2 and 3 are redundant. PRORP down-regulation mutants, show that PRORP proteins have a variety of other substrates and RNase MRP, another ribonucleoprotein, is not involved in the tRNA maturation. Results show that PRORP proteins would be the only enzymes responsible for RNase P activity in Arabidopsis.

Les protéines PentatricoPeptide-Repeats (PPR) représentent la plus grande famille de protéines de liaison à l’ARN connue. Elles sont caractérisées par la présence de motifs répétés en tandem d’environ 35 résidus ayant une structure hélice-tour-hélice. Depuis les premières études sur l’organisme modèle Arabidopsis thaliana, les protéines PPR ont aussi été découvertes chez d’autres espèces non-plantes, incluant les levures et l’humain. Cependant, la détection des protéines PPR en dehors des plantes est compliquée par le fait que les outils de recherche sont tous conçus pour les protéines de plantes. Récemment, une étude réalisée chez les levures a rapporté une méthode itérative semi-automatisée d’identification de PPR utilisant des profils Hidden Markov Models (HMM). Inspirés par cette approche, nous visons ici à développer une méthode complètement automatisée plus généralisable et sensible qui ne dépend pas du protéome de départ. Comme preuve de concept, nous avons choisi une espèce non reliée aux plantes possédant le plus grand nombre de protéines PPR en-dehors des plantes – le protiste marin unicellulaire Diplonema papillatum. Il s’agit d’un modèle émergent ayant reçu beaucoup d’intérêt pour l’excentricité de l’expression de son génome mitochondrial, pour lequel il a été suggéré que les protéines PPR jouent un rôle clé. Nous avons ici développé une approche itérative pour identifier et cataloguer les protéines PPR chez D. papillatum. Les fonctionnalités particulières de notre algorithme incluent l’inspection des intervalles de 30 à 40 résidus entre les motifs classiques déjà identifiés et l’utilisation des structures secondaires caractéristiques des motifs PPR pour valider les motifs candidats nouvellement identifiés. Au final, nous avons identifié près de 800 motifs PPR chez D.papillatum, dont plusieurs motifs « déviants » identifiés dans les espaces entre les motifs. La validation expérimentale des motifs candidats les plus prometteurs est en attente. / PentatricoPeptide-Repeat (PPR) proteins represent the largest family of RNA-binding proteins known. They are defined by containing tandemly arranged, ~35-residue long motifs assuming a helix-turn-helix structure, which are referred to as PPR motifs. Since the seminal studies undertaken in the model organism Arabidopsis, a few PPR proteins have been also discovered outside plants, including yeast and human. However, the detection of PPR proteins in non-plant eukaryotes is complicated by the fact that current search tools are tailored toward plants. Recently, a semi-automated method has been reported for identifying PPR motifs in yeast using iterative searches with profile Hidden Markov models (HMMs). Inspired by this work, we aimed to develop a fully automated, sensitive approach that can be used for detecting PPR proteins in any species, when using the corresponding proteome as input. For a proof of concept, we used a species that contains the largest number of PPR genes outside the plant kingdom –the unicellular protist Diplonema papillatum. This emerging model system has garnered much interest for the eccentricities of its mitochondrial gene expression, in which PPR proteins are posited to play a key role. Here, we have developed an iterative HMM-search method that comprehensively catalogues and classifies PPR motifs in D. papillatum. Particular features of our algorithm are that it inspects closely 30 to 40 residue-long intervals between readily identified (classical) motifs, makes use of the characteristic secondary structure of PPR motifs to validate newly detected candidate motifs. In total, we have identified around 800 PPR motifs in D. papillatum. Including several deviant candidates detected in ”gaps”. High ranking representatives of both classical and deviant motifs await experimental validation.

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.

La forme canadienne-française du syndrome de Leigh (LSFC) est une maladie métabolique associée à une déficience en cytochrome oxydase (COX) et caractérisée par des crises d’acidose lactique, menant à une mort prématurée. Les mécanismes qui sous-tendent l’induction des crises restent inconnus et il n’existe aucune thérapie efficace pour les prévenir. Cette étude vise à caractériser l'effet de facteurs métaboliques périphériques potentiellement altérés chez les patients LSFC sur la mort de lignées cellulaires issues de ces patients et de témoins puis, à identifier des agents thérapeutiques pouvant la prévenir. Nous postulons que (i) ces facteurs métaboliques induiront une mort prématurée des cellules de patients et que (ii) les interventions susceptibles de la prévenir pallieront les conséquences de la déficience en COX, soit la diminution des taux d’adénosine triphosphate (ATP) et l’augmentation du stress oxydant, du nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) et des lipides toxiques. Un criblage de 8 facteurs sanguins et 10 agents thérapeutiques a été réalisé. Les paramètres mesurés incluent la nécrose, l’apoptose, l’ATP et l’activité de la COX. Les fibroblastes LSFC sont plus susceptibles à la mort par nécrose (39±6%) induite par du palmitate plus lactate, un effet associé à des niveaux d’ATP diminués (53±8%). La mort cellulaire est réduite de moitié par l’ajout combiné d’agents ciblant le NADH, l’ATP et les lipides toxiques, alors que l’ajout d’antioxydants l’augmente. Ainsi, un excès de nutriments pourrait induire la mort prématurée des cellules LSFC et, pour atténuer cette mort, il serait important de combiner plusieurs interventions ciblant différents mécanismes. / Leigh syndrome French-Canadian variant (LSFC) is a metabolic disease associated with cytochrome c oxidase (COX) deficiency and characterized by episodes of lactic acidosis, referred to as “crisis”, leading to death at an early age. The mechanisms underlying a crisis and its cellular consequences remain elusive, and there is no effective therapy. The aim of this study was to characterize the effect of peripheral metabolic factors that are potentially altered in patients with LSFC on their cells death and to identify therapeutic agents able to prevent them using cell-lineage from LSFC patients and controls. The hypothesis are that (i) these metabolic factors can induce premature death in patient cells, and (ii) interventions that could rescue these cells may target potential consequences of COX deficiency, namely low adenosine triphosphate (ATP), high nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and toxic lipids, as well as oxidative stress. A screening of 8 blood factors and 10 therapeutic agents was conducted in fibroblasts. Parameter measured included cell death by necrosis and apoptosis, as well as ATP level and COX activity. LSFC fibroblasts were more susceptible to necrosis (39±6%) induced by high palmitate plus lactate and this was associated with a lower ATP (53±8%). Cell death decreased 2-fold with combined interventions, which presumably act on NADH, ATP, and the accumulation of toxic lipids, but increased with antioxidants. Collectively, our results emphasize the importance of nutrient overload as a factor eliciting premature cell death in LSFC cells and of combining interventions acting through various mechanisms for cell death rescue.