This study was conducted to investigate the requirement for sperm processing in microsurgical subzonal placement of sperm in rabbit oocytes. Fertilization rates with standard in vitro fertilization and microsurgical subzonal sperm placement were found to be similar (56 and 55%) when sperm treated with high-ionic strength Brackett's defined inedium to initiate capacitation were used. Statistically significant reductions in fertilization rates for both standard in vitro fertilization and subzonal placement were noted when twice-washed spermatozoa were used. Initiation of capacitation of spermatozoa results in higher fertilization results even when the zona pellucida is bypassed during fertilization.

The effect of RU 486 at different concentrations (1, 5, 10, and 20 µg/ml) was studied on sperm-egg interaction in vitro in B6D2Ff mice. The in vitro fertilization rate of mouse ova decreased from 77.0% (control) to 50.0%, 28.7%, and 7.5% in the presence of RU 486 concentrations at 5, 10, and 20 µg/ml medium, respectively (p < 0.001). A concentration of 1 µg/ml did not affect the fertilization rate. A progesterone concentration at equal to or double the concentration RU 486 did not reverse the inhibitory effect of RU 486 on in vitro fertilization, which suggests a progesterone-independent mechanism. Exposure of spermatozoa (for 90 minutes) or ova (for 60 minutes) to RU 486 (20 µg/ml) followed by washing with RU 486-free medium before coincubation did not affect the fertilization rate. The presence or absence of cumulus cells did not change the inhibitory effect of RU 466 (20 µg/ml) on in vitro fertilization. RU 486 at 5 to 20 µg/ml medium was associated with perivitelline polyspermy in nonfertilized ova and enhanced perivitelline polyspermy in fertilized oval.

Made available in DSpace on 2016-08-15T20:31:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LiviaBC_DISSERT.pdf: 1623953 bytes, checksum: e19274f0d36484b576e3067f86dd3035 (MD5) Previous issue date: 2015-02-24 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Conventional tests that evaluate sperm quality do not have the ability to measure the potential of a fertilizing sample. This study aimed to determine the ability of the collared peccary of sperm in interacting with swine oocytes recovered from antral follicles, perivitelline membrane binding capacity of the chicken egg, and finally identify relationships between sperm parameters and in vitro interaction tests. Thus study was divided in two experiments with 11 male collared peccaries from the Multiplication Center of Wild Animals (CEMAS/UFERSA). In all experiments, the semen was collected by electroejaculation and evaluated for motility, vigour, viability, normal morphology, membrane integrity, and kinetic motility parameters by CASA. In the first experiment, semen samples were analyzed by an in vitro interaction test with swine oocytes conducted under a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 18 h at 38.5ºC. Thus, it was found that in all oocytes there interactions with the presence of spermatozoa (mean 100.00 ± 0.0), observed the mean of 19.85 ± 5.5 oocytes penetrated by spermatozoa, number bound spermatozoa 39.4 ± 4.6 and penetrated spermatozoa 2.46 ± 0.7. Also, verified a significant association between the number of bound sperm and straightness (STR) (R2=61.7%; P=0.04). In the second experiment, semen samples were frozen in a Tris-based extender plus egg yolk (10%), Aloe vera (10%) and glycerol (6%). After thawing, samples were analyzed by an egg perivitelline membrane biding test conducted under a humidified atmosphere containing 5% CO2 for 20 min at 38.5ºC. As result, we identify 140.6 ± 19.4 sperm bound to the perivitelline membrane to fresh samples (binding range 33.9 308,7), while in frozen-thawed samples, a total of 125.1 ± 5.5 sperm were found (binding range 49.8 250.7) (P>0.05). Significant associations between frozen/thawed sperm bound to perivitelline membrane and various sperm parameters as vigor (54.6%), amplitude lateral head (R=55.1%), beat cross frequency (R=76.8%), straightness (R=61.8%) and linearity (R=62.2%) were found. In conclusion, that the two tests can be used for the functional evaluation of peccaries sperm. The perivitelline membrane binding test is a reliable, practical and relatively simple method that does not require expensive equipment and can be efficiently incorporated into the routine analysis of peccaries semen samples / Os testes convencionais, que avaliam a qualidade seminal, não possuem a capacidade de predizer o potencial fecundante de uma amostra. Com o intuito de superar esse entrave, objetivou-se determinar a capacidade dos espermatozoides de catetos em promover interações com oócitos suínos recuperados de folículos antrais, bem como a capacidade de ligação à membrana perivitelina do ovo de galinha e identificação das relações dos mesmos com os parâmetros espermáticos. Para tanto, o estudo foi dividido em dois experimentos, sendo utilizados 11 catetos machos, oriundos do Centro de Multiplicação de Animais Silvestres (CEMAS/UFERSA). Em todos os experimentos, o sêmen foi colhido por eletroejaculação e avaliado quanto à motilidade espermática, vigor, viabilidade, morfologia, parâmetros cinéticos por análise computadorizada (CASA), integridade e funcionalidade da membrana espermática. No primeiro experimento, as amostras de sêmen fresco foram analisadas pelo teste de interação in vitro com oócitos suínos em 5% CO2 por 18 h a 38,5ºC. Assim, verificou-se que em todos os oócitos avaliados existia a presença de interações com espermatozoides (média de 100 ± 0,0), tendo sido observado uma média de 19,85 ± 5,5 de oócitos com espermatozoides penetrados, 39,4 ± 4,6 espermatozoides ligados/oócito e 2,46 ± 0,7 espermatozoides penetrados/oócito. Ainda, observou-se uma significativa associação entre o número de espermatozoides ligados com índice de progressão (R=61,7%). No segundo experimento, o sêmen foi criopreservado em diluente a base de Tris, suplementado com gema de ovo (10%), Aloe vera (10%) e glicerol (3%). Após a descongelação, as amostras foram analisadas pelo teste de ligação à membrana perivitelina da gema do ovo de galinha, que foi realizado em atmosfera controlada contendo 5% CO2 por 20 min a 38,5ºC. As amostras de sêmen fresco apresentaram 140,6 ± 19,4 espermatozoides ligados a membrana perivitelina (taxa de variação de 33,9 308,7), já no sêmen congelado/descongelado, verificaram-se 125,1 ± 5,5 espermatozoides ligados (taxa de variação de 49,8 250,07) (P>0,05). Em adição, observou-se a existência de relações entre o teste de ligação e os parâmetros espermáticos: vigor (54,6%), deslocamento lateral da cabeça (R=55,1%), frequência de batimento cruzado (R=76,8%), índice de progressão (R=61,8%) e índice de linearidade (R=62,2%). Diante disso, conclui-se que ambos os testes podem ser utilizados para a avaliação funcional dos espermatozoides de catetos. Ainda, o teste de ligação à membrana perivitelina é um método confiável, prático e relativamente simples e que pode ser eficientemente incorporado à análise de rotina de amostras de sêmen catetos

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 769007 bytes, checksum: 123ccd2617d8acc65ce78c0ab0679b66 (MD5) Previous issue date: 2012-05-09 / Several populations of wild carnivores are threatened with extinction, mainly due to fragmentation of habitats and low genetic variability of geographically isolated populations. Ex situ conservation strategies, like assisted reproduction and cryopreservation of gametes intended to assist the maintenance of viable populations. Cryopreservation process of male gametes, however, causes damages to cells, which are measured in order to evaluate methodologies and handling techniques to, therefore, increase the viability of reproduction with endangered species in captivity, using assisted reproduction. The study aimed to assess qualitatively the fresh and thawed semen of oncilla (Leopradus tigrinus) using a combination of fluorescent probes and tests of sperm binding to heterologous oocytes of domestic cats and the perivitelline layer of chicken egg. It was used a single individual of oncilla which was anesthetized by anesthesic of ketamine (10 mg / kg) and xylazine (1.2 mg / kg). The semen was collected by electroejaculation and evaluated to the physical aspects (color, appearance and volume) and were also carried out routine tests as follows: sperm motility, spermatic vigor, concentration of spermatozoa in the ejaculate, morphology and hypoosmotic test. Subsequently, the semen was cryopreserved in French straws at a concentration of 20 x 106 motile sperm / ml in TRIS medium based on citrate, 20% of egg yolk and final concentration of 6% glycerol and 0.5% Equex. To asses the integrity of the plasma and acrosomal membrane it was used a combination of three fluorescent probes, propidium iodide, Hoechst 33342 and agglutinin Pisium sativum isoticionato conjugated (FITC-PSA). For binding tests of sperm it was used oocytes of domestic cat and perivitelline layer of chicken eggs, semen was co-incubated at 0.5 x 106 mobile spermatozoa / ml in maintenance medium TCM 199 modified and incubated at 38 ° C at atmospheric pressure of 5% CO 2 for one hour. The ejaculates obtained presented satisfactory medial values for vigor and motility (4.33% and 80.0%, respectively), however, decreased this values in frozen-thawed semen (p <0.05). The fresh ejaculate was presented with values of sperm pathologies below in relation of values observed in other studies with fresh semen of oncilla (19%), the thawed semen increased values of defective cells (p <0.05), due exclusively to the increase in larger defects. The percentage of cells reactive to the hypoosmotic test was lower (p <0.05) in frozen-thawed semen compared to fresh semen (13.0% and 71.66%, respectively). The probes association of propidium iodide, Hoescht 33342 and FITC-PSA was effective to distinguish different subpopulations of sperm in one ejaculation, but there was a difficulty in identifying the staining by FITC-PSA in combination with H342. The population with the intact plasmatic and acrosomal layers decreased (p <0.05) in frozen-thawed semen compared to fresh semen and increased the population with damaged plasmatic layer and intact acrosome layer, which was inversely proportional to motility between these two treatments. For binding tests of oncilla sperm to heterologous oocyte and periviteline layer, both fresh and thawed semen showed adhesion to the substrates and decrease (p <0.05) in number of sperm adhered to the oocyte membrane of the thawed semen. The qualitative methods of sperm evaluation using fluorescent probes associations and binding assays of sperm with heterologous oocytes and perivitelline layers of chicken´s egg proved useful in the evaluation of fresh and thawed semen of oncilla. / Diversas populações de carnívoros silvestres encontram-se ameaçados de extinção, principalmente devido à descaracterização de habitats e a baixa variabilidade genética de populações geograficamente isoladas. Estratégias de conservação ex situ, dentre as quais se encontram a reprodução assistida e criopreservação de gametas visam auxiliar a manutenção de populações viáveis. O processo de criopreservação de gametas masculinos, porém, gera danos às células, os quais devem ser mensurados a fim de se avaliar metodologias e técnicas de manipulação e consequentemente aumentar a viabilidade de reprodução de espécies ameaçadas mantidas em cativeiro, a partir da utilização de reprodução assistida. O estudo teve por objetivo avaliar de forma qualitativa o ejaculado a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno (Leopardus tigrinus) utilizando-se a combinação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos de gatas domésticas e à membrana perivitelina do ovo de galinha. Foi utilizado um gato-do-mato-pequeno, que foi anestesiado por meio de protocolo anestésico de cloridrato de quetamina (10 mg/kg) e cloridrato de xilazina (1,2 mg/kg). O sêmen foi coletado pelo uso de eletroejaculação e foi avaliado quanto aos aspectos físicos (cor, aspecto e volume) e também foram realizados os testes de rotina a seguir: motilidade espermática, vigor espermático, concentração de espermatozoides no ejaculado, morfologia e teste hiposmótico. Posteriormente o sêmen foi criopreservado em palhetas francesas na concentração de 20 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio à base de TRIS citrato, 20% de gema de ovo e concentração final de 6% de glicerol e 0,5% de Equex. Para a avaliação da integridade das membranas plasmática e acrossomal foi usada a combinação de três sondas fluorescentes, iodeto de propídio (IP), Hoescht 33342 (H342) e a aglutinina Pisium sativum conjugada com isoticionato de fluoresceína (FITC-PSA). Para os testes de ligação de espermatozoides à zona pelúcida de ovócito de gata doméstica e à membrana perivitelina de ovos de galinha, o sêmen foi coincubado na concentração de 0,5 x 106 espermatozoides móveis/mL, em meio de manutenção TCM 199 modificado e mantido em estufa a 38ºC com pressão atmosférica de 5% de CO2 durante uma hora. Os ejaculados obtidos apresentaram valores médios satisfatórios para vigor e motilidade (4,33% e 80,0%, respectivamente), porém, diminuíram no sêmen descongelado (p<0,05). O ejaculado a fresco apresentou-se com valores de patologias espermáticas abaixo do observado em outros estudos com sêmen a fresco de gato-do-mato (19%), no sêmen descongelado houve aumento de espermatozoides defeituosos (p<0,05), devido exclusivamente ao aumento nos defeitos maiores. O percentual de células reativas ao teste hiposmótico foi menor (p<0,05) no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco (13,0% e 71,66%, respectivamente). A associação das sondas IP, H342 e FITC-PSA mostrou-se eficaz para a distinção de diferentes subpopulações de espermatozoides em um mesmo ejaculado, porém houve dificuldade em se identificar a coloração pelo FITC-PSA em associação com o H342. Houve redução (p<0,05) da população com membrana plasmática e acrossomal íntegras no sêmen descongelado em relação ao sêmen a fresco e aumento na população com membrana plasmática lesionada e acrossomal íntegra, que foi inversamente proporcional à motilidade entre estes dois tratamentos. Em relação aos testes de ligação de espermatozoides a ovócitos heterólogos e a membranas perivitelina, tanto o sêmen a fresco quanto o descongelado de gato-do-mato-pequeno apresentaram adesão aos substratos testados e ocorreu redução (p<0,05) na quantidade de espermatozoides aderidos nos ovócitos e nas membranas no sêmen descongelado. As metodologias de avaliação qualitativa de associação de sondas fluorescentes e testes de ligação de espermatozoides a ovócitos e membrana perivitelina de ovo de galinha se mostraram úteis na avaliação de sêmen a fresco e descongelado de gato-do-mato-pequeno.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_carine_dahl_corcini.pdf: 732454 bytes, checksum: 17c0395123a3b5438e40b167f5247599 (MD5) Previous issue date: 2010-06-25 / The knowledge of the reproductive potential of a male has economical and reproductive importance, especially if he is used in artificial insemination programs. The conventional assays for evaluating seminal quality do not have the capacity of measuring the fertilizing potential of a sample, they only indicate if it is within the acceptable parameters for insemination, according to the Brazilian College of Animal Reproduction. Into this context, the in vitro sperm penetration assay presents itself as an alternative laboratorial test to categorize fertile males regarding their fecundation capacity, since they mimic in vitro what happens in vivo. However, this assay has its use limited by the difficulty of execution and by the utilization of high cost equipment. The present work aimed to find a new biological model to study male reproductive aspects and to evaluate alternatives to simplify and to decrease costs of the assay execution: use of the chicken egg inner perivitelline layer (IPVL) penetration assay and its association with in vitro and in vivo parameters; use of BTS as incubation media for the in vitro penetration assay, and female gametes cryopreservation using different methods. It was concluded that: 1) Calomys laucha can be used as a biological model; 2) it is possible to use the inner perivitelline layer as a substrate in assays to predict fertility of Calomys laucha males; 3) the IPVL has receptors that allow swine sperm binding, therefore presents potential for use in male fertility diagnostic tests; 4) it is possible to use BTS as incubation media for the in vitro penetration assay, in oocytes or in IPVL, and in water-bath without CO2, and 5) the cryopreservation of ovaries at -20ºC or the refrigeration of oocytes in PBS at 5ºC before the execution of the in vitro oocyte penetration assay, using mTBM media, is an alternative to the use of fresh oocytes in tests to predict swine semen fertility. / O conhecimento do potencial reprodutivo de um macho é de importância econômica e reprodutiva, principalmente se ele é utilizado em programa de inseminação artificial. Os testes convencionais que avaliam a qualidade seminal não possuem a capacidade de medir o potencial fertilizante de uma amostra e, apenas indicam se a mesma se encontra dentro dos parâmetros aceitáveis para a inseminação segundo o Colégio Brasileiro de Reprodução Animal. O teste de penetração espermática in vitro, aparece neste contexto como um teste laboratorial alternativo para categorizar os machos férteis, quanto a sua capacidade de fecundação, pois mimetizam in vitro o que acontece in vivo. No entanto, este teste tem seu uso limitado por ser de difícil execução e por utilizar equipamentos de alto custo. O presente trabalho objetivou encontrar um novo modelo biológico para estudos sobre aspectos reprodutivos de machos e avaliar alternativas para simplificar e diminuir custos para execução do teste: utilização do teste de penetração na membrana perivitelina interna do ovo da galinha (IPVL) e sua associação com parâmetros in vitro e in vivo; utiilização do BTS como meio de incubação do teste de penetração in vitro e utilização de diferentes maneiras de criopreservação de gametas femininos. Foi concluído que: 1) Calomys laucha pode ser utilizado como modelo biológico; 2) é possível utilizar a membrana perivitelina interna como substrato de teste para predizer a fertilidade de machos Calomys laucha; 3) a IPVL possui receptores que permitiram a ligação do espermatozóide suíno, apresentando potencial para ser utilizada em diagnóstico de fertilidade de machos; 4) é viável utilizar BTS como meio para realização do teste de penetração in vitro em ovócito ou IPVL, em banho-maria sem a presença de CO2 e 5) o congelamento de ovários a -20ºC ou o acondicionamento a 5º C dos ovócitos em PBS para realizar o teste de penetração ovocitária in vitro, utilizando o meio mTBM, é uma alternativa para predizer a fertilidade de sêmen suíno.