Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le développement et l’évolution des maladies inflammatoires de l’intestin. Le corps humain est doté d’une panoplie d’enzymes antioxydantes ayant pour fonction de protéger l’intégrité cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont récemment été identifiées tout au long du tube digestif, mais leurs rôles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées dans le présent travail pour étudier la régulation des PON. Les cellules ont été traitées avec différents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidinédiones) et l’expression des leurs gènes et protéines a été évaluée. Les résultats ont mis en lumière la modulation distincte de l’expression des PON par le stress oxydant et l’inflammation. Ceci suggère que chaque PON peut jouer un rôle différent au niveau intestinal et être impliquée dans le maintien de l’homéostasie. La régulation de l’expression des PON a également été largement explorée dans un article de revue. Pour définir le rôle de PON2, celle-ci étant potentiellement la plus importante pour l’homéostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont été infectées à l’aide de lentivirus contenant des ARN d’interférence, ce qui a fortement réduit l’expression de PON2. En l’absence de PON2, les cellules Caco-2/15 étaient plus susceptibles face à un stress oxydant, la réponse inflammatoire était exacerbée et la perméabilité cellulaire paraissait altérée. Toutes ces composantes sont majeures dans le développement des maladies inflammatoires de l’intestin chez l’humain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforcé la force de la défense antioxydante cellulaire. Les résultats suggèrent que les PON jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie intestinale et pourraient être impliquées dans l’étiologie et la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin. / Oxidative stress is a major part of the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). The endogenous antioxidative defence is formed of multiple enzymes that have to protect cellular integrity. Paraoxonases (PON1, 2 and 3) are antioxidant enzymes that have recently been identified throughout the digestive tract, but their roles remain unclear in the intestine. Intestinal Caco-2/15 cells, which have the capacity to differentiate and exhibit the functionality of the small intestine, were used to study PON’s regulation. Cells were treated with various physiological effectors (cytokines, lipopolysaccharides, oxidative stress) and pharmacological molecules (fibrates, thiazolidinediones) and gene and protein expression were determined. Results obtained showed that PONs are distinctly modulated especially by inflammation and oxidative stress and suggests that they could play different roles in the maintenance of intestinal homeostasis. PONs regulation has also been the main topic of a review article. Our results and the literature pointed to PON2 as the most important PON for intestinal health. To better define PON2 functions in the intestine, PON2 expression was knocked-down using lentiviral infection and plasmids containing anti-PON2 shRNA. In the relative absence of PON2, Caco-2/15 cells were more susceptible towards induction of oxidative stress, the inflammatory response was exacerbated and cell permeability seemed altered. All of these components are major players involved in the development of human IBD. Moreover, Caco-2/15 cells were treated with purified PON2, which increased their antioxidative defence. All of these results suggest that PONs are implicated in the antioxidative and anti-inflammatory response in intestinal epithelial cells and makes them potentially important players for the aetiology and pathogenesis of IBD.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Le stress oxydant joue un rôle majeur dans le développement et l’évolution des maladies inflammatoires de l’intestin. Le corps humain est doté d’une panoplie d’enzymes antioxydantes ayant pour fonction de protéger l’intégrité cellulaire. De nouvelles enzymes au fort potentiel antioxydant, les paraoxonases (PON) 1, 2 et 3, ont récemment été identifiées tout au long du tube digestif, mais leurs rôles y restent inconnus. Les cellules intestinales Caco-2/15, qui ont la capacité de se différencier et d’acquérir les caractéristiques physiologiques de l'intestin grêle, ont été utilisées dans le présent travail pour étudier la régulation des PON. Les cellules ont été traitées avec différents effecteurs physiologiques (cytokines, LPS, stress oxydant) et pharmacologiques (fibrates, thiazolidinédiones) et l’expression des leurs gènes et protéines a été évaluée. Les résultats ont mis en lumière la modulation distincte de l’expression des PON par le stress oxydant et l’inflammation. Ceci suggère que chaque PON peut jouer un rôle différent au niveau intestinal et être impliquée dans le maintien de l’homéostasie. La régulation de l’expression des PON a également été largement explorée dans un article de revue. Pour définir le rôle de PON2, celle-ci étant potentiellement la plus importante pour l’homéostasie intestinale, les cellules Caco-2/15 ont été infectées à l’aide de lentivirus contenant des ARN d’interférence, ce qui a fortement réduit l’expression de PON2. En l’absence de PON2, les cellules Caco-2/15 étaient plus susceptibles face à un stress oxydant, la réponse inflammatoire était exacerbée et la perméabilité cellulaire paraissait altérée. Toutes ces composantes sont majeures dans le développement des maladies inflammatoires de l’intestin chez l’humain. De plus, des cellules Caco-2/15 de la PON2, ce qui a renforcé la force de la défense antioxydante cellulaire. Les résultats suggèrent que les PON jouent un rôle dans le maintien de l’homéostasie intestinale et pourraient être impliquées dans l’étiologie et la pathogenèse des maladies inflammatoires de l’intestin. / Oxidative stress is a major part of the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). The endogenous antioxidative defence is formed of multiple enzymes that have to protect cellular integrity. Paraoxonases (PON1, 2 and 3) are antioxidant enzymes that have recently been identified throughout the digestive tract, but their roles remain unclear in the intestine. Intestinal Caco-2/15 cells, which have the capacity to differentiate and exhibit the functionality of the small intestine, were used to study PON’s regulation. Cells were treated with various physiological effectors (cytokines, lipopolysaccharides, oxidative stress) and pharmacological molecules (fibrates, thiazolidinediones) and gene and protein expression were determined. Results obtained showed that PONs are distinctly modulated especially by inflammation and oxidative stress and suggests that they could play different roles in the maintenance of intestinal homeostasis. PONs regulation has also been the main topic of a review article. Our results and the literature pointed to PON2 as the most important PON for intestinal health. To better define PON2 functions in the intestine, PON2 expression was knocked-down using lentiviral infection and plasmids containing anti-PON2 shRNA. In the relative absence of PON2, Caco-2/15 cells were more susceptible towards induction of oxidative stress, the inflammatory response was exacerbated and cell permeability seemed altered. All of these components are major players involved in the development of human IBD. Moreover, Caco-2/15 cells were treated with purified PON2, which increased their antioxidative defence. All of these results suggest that PONs are implicated in the antioxidative and anti-inflammatory response in intestinal epithelial cells and makes them potentially important players for the aetiology and pathogenesis of IBD.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le fer ajouté dans des systèmes complexes tels que les aliments induit divers problèmes comme l'oxydation des lipides ou la précipitation d'autres composés présents dans la matrice. Il s'en suit une diminution de sa biodisponibilité et des défauts de goût. L'utilisation de chélates de fer, comme le bisglycinate de fer ou l'EDTA de fer, constitue une voie intéressante : le fer ainsi protégé n'interagirait pas avec la matrice alimentaire. La stabilité des chélates de fer (bisglycinate de fer et NaFe EDTA), supposés peu réactif pour l'initiation de peroxydation, a été attestée sur des modèles d'émulsions huile dans eau stabilisées par du caséinate de sodium ou de la β lactoglobuline. Dans un second temps, le travail a consisté à vérifier la faible influence de ces complexes sur la nature de l'interface huile/eau (étude de la tension et de la rhéologie interfaciales). La stabilité du bisglycinate de fer en solution aqueuse et en présence de β lactoglobuline a également été évaluée en fonction du pH (pH 2, 3,5 et 6,5) par rayons X. Il a ainsi été montré que la nature des protéines formant l'interface huile/eau et le type de sels de fer jouent un rôle crucial sur la stabilité oxydative des émulsions enrichies en fer. L'affinité des protéines de lait pour les ions fer libres est le premier facteur qui contrôle la peroxydation des matières grasses par l'absence de transfert à l'interface huile/eau. La capacité du complexe bisglycinate à retenir les ions fer et donc à limiter la présence d'ions fer libres (ferriques ou ferreux) apparaît comme le second facteur principal à contrôler. La compétition pour les ions fer entre les groupes fonctionnels des protéines et les contre ions de chélates (glycinate ou EDTA) gouverne ainsi l'état d'oxydation du système dans des conditions acide/base proche de la neutralité. En milieu acide, l'oxydation est principalement gouvernée par l'instabilité du complexe bisglycinate de fer et par conséquent la lente libération fer ionique dans la phase aqueuse. Pour résumer, si le complexe de fer n'est pas déstabilisé et que la protéine à l'interface huile/eau ne présente pas de groupe fonctionnel ayant une forte affinité pour le fer, alors la peroxydation des lipides en émulsion est faible. Dans notre démonstration, si une protéine n'est pas phosphorylée et pour des pH proches de 7, alors l'émulsion ne sera pas peroxydée car le fer ne migre pas à l'interface huile/eau.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La mise au point de nouvelles stratégies de synthèse, toujours plus efficaces, générales et si possible respectueuses de l’environnement, ainsi que l’obtention de nouvelles briques moléculaires, permettant in fine la construction de molécules complexes sont d’une importance cruciale en synthèse organique. Dans ce contexte, l’étude de méthodes permettant d’une part la fonctionnalisation directe de liaisons C-H et, d’autre part, le développement de nouvelles transformations chimiques, sont des approches particulièrement attrayantes donnant soit accès à des routes synthétiques bien plus efficaces que celles correspondant à des déconnections plus classiques, soit accès à de nouvelles plateformes moléculaires. C’est dans ce cadre général que ce sont inscrits les travaux réalisés au cours de cette thèse qui nous ont permis de développer de nouveaux procédés de fonctionnalisation directe d’hétérocycles azotés et de mettre au point de nouvelles transformations à partir d’alcynes hétérosubstitués, composés qui se sont avérés être d’excellents précurseurs pour la formation de diverses molécules structurellement plus complexes. Ces différentes réactions permettent d’accéder à des composés d’importance en synthèse organique ou en chimie médicinale et également à des composés inédits dont l’étude de la réactivité semble prometteuse. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

OBJECTIF: Récemment, nous avons démontré que la modification du collagène type II (Col II) par le 4-hydroxynonénal (HNE), un produit de la peroxydation lipidique, est augmentée dans le cartilage arthrosique sans qu’on sache la signification de cette augmentation dans la pathogenèse de l’arthrose. L’objectif de cette étude vise à démontrer que cette modification affecte l’interaction chondrocytes/matrice extracellulaire (MEC) et en conséquence induit des changements phénotypiques et fonctionnels de ces cellules. METHODES: Des plaques de culture ont été préalablement cotées avec du Col II puis traitées avec du HNE (0.1-2 mM) excepté le puits contrôle. Les chondrocytes ont été ensuite ensemencés puis incubés pendant 48 heures. La viabilité des cellules est évaluée par le test MTT. Le Western blot est utilisé pour mesurer l’expression des molécules d’adhésion (l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1), de la cyclooxygenase-2 (COX-2), du Col II ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. La RT-PCR en temps réel est utilisée pour mesurer l’expression de l’ARNm de l’ICAM-1, des intégrines α1β1, de la COX-2 et de la métalloprotéinases-13 (MMP-13). La détermination de l’expression de l’ICAM-1 à la surface des cellules est réalisée par cytométrie de flux. Des kits commerciaux ont servi pour mesurer le niveau de la MMP-13, de la prostaglandine E2 (PGE2), de l’activité de la caspase-8 et de la phosphorylation de la p38 MAPK, ERK1/2 et NF-κB-p65. RESULTATS: La modification du Col II par 0.2 mM HNE induit significativement l’expression des molécules d’adhésion telles que l’ICAM-1 et l’intégrine α1β1, de la MMP-13 sans avoir un effet sur la morphologie, la survie et le phénotype cellulaires. Nos résultats montrent aussi une forte augmentation de la phosphorylation de la p38 MAPK, d’ERK1/2 et de NF-κB-p65. Cependant, la modification du Col II par 2 mM HNE affecte la morphologie et la viabilité cellulaires et induit l’activité de la caspase-8. Elle inhibe fortement l’expression des integrines α1β1 et du Col II ainsi que la phosphorylation de l’ERK1/2 et de NF-κB-p65, mais par contre, induit significativement la production de la COX-2 et son produit la PGE2 ainsi que la phosphorylation de la p38 MAPK. Fait intéressant, le prétraitement des complexes HNE/Col II par 0.1 mM de carnosine empêche les changements phénotypiques et fonctionnels des chondrocytes. CONCLUSION : Ces nouveaux résultats suggèrent le rôle important de la modification du Col II par le HNE dans l’arthrose, en affectant le phénotype et le fonctionnement cellulaires des chondrocytes. La carnosine, par sa capacité de neutraliser le HNE, a révélé d’être un agent promoteur dans le traitement de l’arthrose. / OBJECTIVE: The regulation of cell phenotype and function by the surrounding environment is deeply altered by the oxidative modifications of extracellular matrix (ECM) components that modify their structural and functional properties. This modification may be one cause involved in cartilage degradation in osteoarthritis (OA). Type II collagen (Col II) was reported to be targeted for 4-hydroxynonenal (HNE) binding, a very reactive product of lipid peroxydation. In the present study, we investigated whether HNE-binding to Col II affects OA chondrocytes phenotype and function and then, we determined the protective role of carnosine treatment in preventing these changes. METHODS: Isolated human OA chondrocytes were seeded in control wells and in HNE/Col II adducts-coated plates and incubated afterwards for 48 hours. Adhesion molecules at protein and mRNA levels were determined by Western blotting, flow cytometry and real-time RT-PCR. Commercial kits were used to evaluate cell death, caspase-8 activity and levels of prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinase-13 (MMP-13), MAPK and NF-κB-p65. Col II, cyclooxygenase-2 (COX-2), MAPK and NF-κB-p65 levels were assessed by Western blotting. RESULTS: After 48 hours of incubation, the modification of Col II by 0.2 mM HNE induced strongly the expression of ICAM-1, integrin α1β1, MMP-13 and slightly COX-2 as well as PGE2 release without affecting cell morphology and viability as well as Col II expression. However, the modification of Col II with 2 mM HNE induced shape changes of cells from typical chondrocyte-like polygon shape to round semi-detached, affecting cells viability and inducing caspase-8 activity. It inhibited the expression of ICAM-1, integrin α1β1 and Col II, but in contrast, induced strongly PGE2 release and COX-2 expression. All these effects were prevented by 0.1 mM carnosine treatment, an HNE trapping drug. Carnosine was added to HNE-modified, Col II-coated plates 1h before cell seeding. Upon examination of different signalling pathways involved in these responses, we found that modified Col II with 2 mM HNE inhibited strongly the phosphorylation of ERK1/2 and NF-κB-p65 but induced strongly p38 MAPK. In contrast, the results indicated that MAPK and NF-κB-p65 were activated when cells were incubated with modified Col II by 0.2 mM HNE. CONCLUSION: The interaction between chondrocytes and collagen-bound HNE modulates different signalling pathways via adhesion molecules regulation and consequently leads to the expression of catabolic and inflammatory factors. Carnosine was shown to be an efficient HNE trapping agent able to counteract these effects.