Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2002. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 122-137).

La phénylcétonurie (PCU est une maladie métabolique génétique causée par une déficience d'activité phénylalanine hydroxylase (PAH). Une hypomyélinisation du cerveau a été documentée chez les patients non traités, mais sa pathophysiologie reste floue. Nous avons investigué l'influence de la phénylalanine (Phe), phénylpyruvate (PP) et phénylacétate (PA) sur les oligodendrocytes. Nous avons premièrement montré dans un modèle murin de PCU que le nombre d'oligodendrocytes n'était pas différent dans le corps calleux entre animaux PCU et sains. Ensuite, en utilisant la technique des co-cultures myélinisantes nous avons pu déterminer que Phe, PP et PA n'ont pas d'effet direct sur la synthèse des gaines de myéline. Ces données indiquent que ces trois composés n'exercent probablement pas de rôle direct dans l'hypomyélinisation du système nerveux central constatée dans le cadre de la PCU. Ces données suggèrent donc des mécanismes d'action indirects. De plus, nous avons investigué la faisabilité d'un modèle de thérapie génique pour la PCU. Celui-ci implique la transduction ex vivo d'hépatocytes ou cellules souches mésenchymateuses par un vecteur lentiviral puis leur implantation dans le foie de l'organisme receveur. Phenylketonuria (PKU) is a metabolic genetic disease characterized by deficient phenylalanine hydroxylase (PAH) enzymatic activity. Brain hypomyelination has been reported in untreated patients, but its mechanism remains unclear. We therefore investigated the influence of phenylalanine (Phe), phenylpyruvate (PP), and phenylacetate (PA) on oligodendrocytes. We fisrt showed in a mouse model of PKU that the number of oligodendrocytes is not different in corpus callosum sections from adult mutants or from control brains. Then, using enriched oligodendroglial cultures, we detected no cytotoxic effect of high concentrations of Phe, PP, or PA. Finally, we analyzed the impact of Phe, PP, and PA on the myelination process in myelinating cocultures using both an in vitro index of myelination, based on activation of the myelin basic protein (MBP) promoter, and the direct quantification of myelin sheaths by both optical measurement and a bioinformatics method. None of these parameters was affected by the increased levels of Phe or its derivatives. Taken together, our data demonstrate that high levels of Phe, such as in PKU, are unlikely to directly induce brain hypomyelination, suggesting involvement of alternative mechanisms in this myelination defect. Moreover, we investigated the feasibility of a gene therapy for phenylketonuria. This project involved the ex vivo transduction of hepatocytes and mesenchymal stem cells with lentivirus vector and the engraftment of these cells in the liver's recipient.

Στην παρούσα εργασία συνθέσαμε ένα άμινο-άκυλο- και ένα πεπτίδυλο- ανάλογο της χλωραμφαινικόλης. Τα ανάλογα αυτά ήταν η β-αλανίνη-χλωραμφαινικόλη (β-alaCAM) και η φαινυλαλανίνη-φαινυλαλανίνη-χλωραμφαινικόλη (PhePheCAM). Στην συνέχεια μελετήσαμε την βιολογική συμπεριφορά των αναλόγων αυτών μέσα από την μελέτη της κινητικής της αναστολής του σχηματισμού πεπτιδικού δεσμού που επιφέρουν τα εν λόγω ανάλογα. Σε πρωτεϊνοσυνθετικό σύστημα ριβοσωμάτων εκπορευόμενων από Escherichia coli η σύνθεση ακέτυλο-φαινυλαλάνυλο-πουρομυκίνης πραγματοποιείται μέσω μιας αντίδρασης ψευδοπρώτης τάξεως μεταξύ συμπλέγματος C, δηλαδή ακέτυλο-φαινυλαλάνυλο-poly(U)-ριβοσωμάτων, και περίσσειας πουρομυκίνης. Τόσο η β-alaCAM, όσο και η PhePheCAM μελετήθηκαν ως αναστολείς της αντίδρασης σύνθεσης ακέτυλο-φαινυλαλάνυλο-πουρομυκίνης και τα αποτελέσματα της κινητικής της αναστολής που επέφεραν συγκρίθηκαν με γνωστά από την βιβλιογραφία αντίστοιχα αποτελέσματα που αφορούν τόσο την μητρική ένωση, όσο και άλλα άμινο-άκυλο- και πεπτιδικά ανάλογα αυτής. Αρχικά παρατηρήσαμε ότι, απουσία αναστολέα, η αντίδραση ακολουθεί κινητική πρώτης τάξεως καθόλη την χρονική διάρκεια της χημικής αντίδρασης. Ωστόσο, στη συνέχεια παρατηρήσαμε ότι η παρουσία τόσο της β-alaCAM, όσο και της PhePheCAM είχε σαν αποτέλεσμα διφασικές λογαριθμικές συναρτήσεις συγκέντρωσης – χρόνου, όπου υφίστατο μία αρχική ή πρώτη χρονική φάση και μία τελική ή δεύτερη χρονική φάση της χημικής αντίδρασης πουρομυκίνης. Ακολούθησε λεπτομερής κινητική ανάλυση, αρχικά μέσω διαγραμμάτων διπλού αντιστρόφου για τις αρχικές και τις τελικές κλίσεις των λογαριθμικών χρονοκαμπυλών, καθώς και στη συνέχεια μέσω επαναδιαγραμμάτων αρχικών και τελικών κλίσεων έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα. Με τον τρόπο αυτό υπολογίστηκαν οι κινητικές σταθερές αναστολής Κi οι οποίες και συγκρίθηκαν με την κινητική σταθερά αναστολής της μητρικής ένωσης. Τέλος, μέσω υπολογιστικού προγράμματος προσομοίωσης, σχεδιάστηκαν οι συναρτήσεις της φαινομενικής σταθεράς εξισορρόπησης keq έναντι της συγκέντρωσης του αναστολέα και υπολογίστηκαν οι σταθερές k6 και k7. Tόσο η β-alaCAM όσο και η PhePheCAM εμφάνισαν συμπεριφορά βραδέως προσδενομένου συναγωνιστικού αναστολέα ανεξάρτητα από την συγκέντρωσή τους, σε αντίθεση με την μητρική ένωση η οποία εμφανίζει συμπεριφορά συναγωνιστικού αναστολέα σε μικρές συγκεντρώσεις αυτής και συμπεριφορά μικτού μη-συναγωνιστικού αναστολέα σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αυτής. H β-alaCAM ευρέθηκε 4,6 φορές περισσότερο βιολογικά δραστική από την PhePheCAM και 14,3 βιολογικά ασθενέστερη από την μητρική ένωση. Σε αντίθεση με τη μητρική ένωση, η οποία δεν υφίσταται ισομερισμό, τόσο η β-alaCAM όσο και η PhePheCAM δίνουν, στην τελική ή δεύτερη χρονική φάση της αντίδρασης πουρομυκίνης, γένεση στο ισομερισμένο σύμπλοκο C*I. Αξιοσημείωτη είναι η παρατήρηση ότι ο σχηματισμός του ισομερισμένου συμπλόκου C*I λαμβάνει χώρα μέσω δύο κινητικών βημάτων στην περίπτωση της β-alaCAM, αλλά μέσω ενός μόνο κινητικού βήματος στην περίπτωση της PhePheCAM. Προτείνουμε, ως μοντέλο επεξηγηματικό του μηχανισμού βιολογικής δράσης και χημικής κινητικής των μελετηθέντων συνθετικών αναλόγων, ότι τόσο η β-alaCAM όσο και η PhePheCAM παρουσιάζουν αυξημένη στερεοχημική ομοιότητα με το 3΄-άκρο του άμινο-άκυλο-tRNA ή με το 3΄-άκρο του πεπτίδυλο-tRNA συγκριτικά με τη μητρική ένωση. Η αυξημένη αυτή στερεοχημική ομοιότητα πιθανότατα εξηγεί τον εκσεσημασμένο συναγωνιστικό χαρακτήρα της αναστολής που εμφανίζουν τα μελετηθέντα ανάλογα συγκριτικά με τη μητρική ένωση, ασχέτως του γεγονότος ότι η συνολική αναστολή που επιφέρουν δεν αποδεικνύεται σε καμία περίπτωση ισχυρότερη της αναστολής που επιφέρει η μητρική ένωση. Για τον λόγο αυτό τα εν λόγω συνθετικά ανάλογα της χλωραμφαινικόλης θα πρέπει να θεωρηθούν παλίνδρομα-ανάστροφα ανάλογα (retro-inverso analogs). / One aminoacyl and one peptidyl analog of chloramphenicol (Cl2CHCO-CAM) were prepared. These are L-β-alaCAM and L-PhePheCAM. The kinetics of inhibition of peptide bond formation by these analogs were examined in a cell-free system which had been used previously for the study of Cl2CHCO-CAM [Drainas et al, Eur. J. Biochem. 1987, 164, 53-58]. In a model cell-free system, derived from Escherichia coli, acetylphenylalanyl-puromycin is produced in a pseudo-first-order reaction between the preformed acetylphenylalanyl/tRNA/poly(U)/ribosome complex (complex C) and excess puromycin. Both L-β-alaCAM and L-PhePheCAM were tested as inhibitors in this reaction. In the absence of inhibitor, the reaction follows first-order kinetics for the entire course of the reaction. In the presence of the analog the reaction gives biphasic log-time plots. The kinetic informations pertaining to the initial and the terminal slopes of the plot are analyzed (initial-slope and terminal-slope analysis). Μοreover, through a computer simulation non-linear regression fitting program, the plots between the keq values and the concentration of the inhibitor [I] were constructed, and consequently the values of k6 and k7 were estimated. Detailed kinetic analysis suggests that both these analogs (I) behave as slow-binding inhibitors and react competitively with complex C to form the complex C*I which is inactive towards puromycin. In the presence of L-β-alaCAM, C*I is formed via a two-step mechanism in which C*I is the product of a slow conformational change of the initial encounter complex CI according to the equation C + I CI C*I. Our results, concerning the two-step mechanism of L-β-alaCAM are in agreement with the results of previous investigations evaluating the potency and kinetic mechanisms of other aminoacyl and peptidyl analogs of chloramphenicol [Michelinaki et al, Mol. Pharmacol. 1997, 51, 139-146]. However, in the presence of L-PhePheCAM, our results are unique because we found evidences that C*I is formed via a one-step mechanism as a product of a slow conformational change according to the equation C + I C*I. The parent compound gives complex inhibition kinetics; increasing the concentration of the parent compound changes the inhibition from competitive to mixed noncompetitive [Drainas et al, Eur. J. Biochem. 1987, 164, 53-58]. In contrast, the analogs give competitive kinetics even at high concentrations of the inhibitor. The following Ki and Ki* values have been determined: Ki = 45 μΜ for L-β-alaCAM, Ki* = 10 μΜ for L-β-alaCAM and Ki* = 46 μM for L-PhePheCAM. If we were to assume that both L-β-alaCAM and L-PhePheCAM behave as classical competitive inhibitors, we could say that L-β-alaCAM is 4.6 times more potent than L-PhePheCAM. On this assumption we could also compare chloramphenicol with L-β-alaCAM and see that L-β-alaCAM is 14.3 times weaker than chloramphenicol (Ki = 0.7 μΜ). It is suggested that as compared with chloramphenicol, both L-β-alaCAM and L-PhePheCAM have increased structural similarity to the 3΄-terminus of aminoacyl-tRNA or of peptidyl-tRNA and this similarity results in a more pronounced competitive inhibition. The results are compared with previous data and discussed on the basis of a possible retro-inverso relationship between chloramphenicol analogs and puromycin.