Orientador: Maria Alice da Cruz Hofling / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-22T15:24:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mendonca_MoniqueCulturatoPadilha_M.pdf: 7402848 bytes, checksum: 64244a22fab0eb94170d857f28da8e50 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), o principal regulador da angiogênese e da permeabilidade vascular, foi recentemente reconhecido como neurotrófico, neurogênico e neuroprotetor, sendo, portanto, regulado positivamente em muitos processos neuropatológicos. Neste modelo experimental de quebra da barreira hematoencefálica (BHE) pelo veneno da aranha Phoneutria nigriventer (PNV), a expressão do VEGF e seus receptores tirosina-quinase, Flt-1 e Flk-1 e de seus RNAs mensageiros foi investigada no hipocampo e cerebelo de ratos Wistar (Rattus norvegicus) por imunohistoquímica (IHQ), western blotting (WB) e reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR). Paralelamente, a integridade da BHE foi avaliada através da expressão das proteínas da via paracelular, Ocludina e ?-catenina, e da principal proteína da membrana basal, a Laminina, que estão presentes no endotélio na interface sangue-cérebro. O estudo foi realizado em ratos de 14 dias (neonatos) e de 8-10 semanas (adultos jovens) para avaliar diferenças em função da idade na funcionalidade da BHE e na possível mediação dos efeitos neurotóxicos do PNV pelo VEGF. A via escolhida para administração de PNV (1,7 mg/kg em 0,5ml de salina 0,9%) foi intraperitoneal, devido sua administração mais favorável nos animais neonatos. Os tempos de 2, 5 e 24 horas após a administração de PNV visaram investigar a expressão das proteínas, RNAs mensageiros e uma possível mediação pelo VEGF na fase aguda do envenenamento. A administração do PNV provocou sinais imediatos de intoxicação nos animais, os quais foram mais severos e imediatos nos neonatos do que nos adultos. No hipocampo, os dados do WB mostraram aumento da expressão de VEGF, Flt-1 e Flk-1 e respectivos RNAs mensageiros, que foram concomitantes com o desenvolvimento de edema perivascular e diminuição da expressão da Ocludina, ?-catenina e Laminina. Os dados da IHQ mostraram que a imunorreatividade de VEGF ocorreu nos corpos dos neurônios piramidais e dendritos nos subcampos CA1, CA2, CA3 e giro denteado do hipocampo, em contraste com a marcação nuclear de Flt-1 e Flk-1. O PNV aumentou visivelmente a imunomarcação das três proteínas. No cerebelo, os dados do WB e IHQ mostraram que o PNV induziu aumento na expressão dos componentes do sistema VEGF/Flt-1/Flk-1. Células presentes na camada granular e molecular que não mostraram marcação nos animais controles passaram a ser positivas nos animais xviii envenenados, principalmente as células de Purkinje. Os animais adultos apresentaram aumentos mais proeminentes no sistema VEGF/Flt-1/Flk-1 do cerebelo do que os recémnascidos; nestes, o PNV induziu diminuição na expressão da Ocludina, ?-catenina e Laminina, enquanto nos adultos a diminuição ocorreu apenas na Ocludina e ?-catenina. O veneno da aranha P. nigriventer contem peptídeos neurotóxicos que causam excitabilidade na neurotransmissão nervosa por modificarem a fisiologia dos canais de sódio, potássio e cálcio. Uma vez que a dinâmica das alterações descritas diferiu entre regiões cerebrais e entre animais neonatos e adultos jovens, sugerimos particularidades regionais e de funcionalidade, tanto da BHE, como dos neurônios imunorreativos em resposta ao PNV. Estes resultados são os primeiros a demonstrar alterações do sistema VEGF/Flt-1/Flk-1 no hipocampo e cerebelo que cursam com sinais neuroexcitotóxicos dos animais que foram tratados com o veneno / Abstract: Vascular endothelial growth factor (VEGF), a major regulator of developmental angiogenesis and vascular permeability, was recently recognized as neurotrophic, neurogenic and neuroprotector, hence being upregulated in many neuropathological processes. In this experimental model of blood brain barrier (BBB) breakdown by the Phoneutria nigriventer spider venom (PNV), the expression of VEGF and its receptor tyrosine kinases, Flt-1 and Flk-1 and their mRNAs was investigated in the hippocampus and cerebellum of Wistar rats (Rattus norvegicus) by immunohistochemistry (IHC), western blotting (WB) and real time polymerase chain reaction (qPCR). Simultaneously, the BBB integrity was assessed through expression of paracellular pathway proteins, ?- catenin and Occludin, and the main basement membrane protein, Laminin, which are present in the endothelium blood-brain interface. The study was performed in rats by 14 days (neonates) and 8-10 weeks (young adults) to assess differences related to age in the BBB functionality and the possible mediation of the PNV neurotoxic effects by VEGF. The via chosen for PNV administration (1.7 mg/kg in 0.5 ml of 0.9% saline) was intraperitoneally, due to more favorable application in neonate animals. The times of 2, 5 and 24 hours after PNV administration aimed to investigate the expression of proteins, mRNAs, and possible mediation by VEGF in acute envenomation. The PNV administration provoked immediate signs of intoxication in animals, which were more severe and immediate in neonates than in adults. In hippocampus, the WB data showed increased expression of VEGF, Flt-1 and Flk-1 and their mRNAs, which were concomitant with the development of perivascular edema, and decreased expression of Occludin, ?-catenin and Laminin. IHC data show that VEGF immunoreactivity occurred in the bodies and dendrites of pyramidal neurons in the subfield CA1, CA2, CA3 and dentate gyrus of the hippocampus, in contrast with nuclear staining of Flt-1 and Flk-1. The PNV visibly increased immunostaining of the three proteins. In cerebellum, the WB data and IHC showed that the PNV induced an increase in the expression of VEGF/Flt-1/Flk-1 system components. Cells in the granular and molecular layer showed no marking in the control animals became positive in animals envenomed, especially Purkinje cells. Adult animals showed increases more prominent in the VEGF/Flt-1/Flk-1 system of the cerebellum than xx neonates; in these animals, the PNV induced decrease in expression of Occludin, ?-catenin and Laminin, while in adults the decrease occurred only in Occludin and ?-catenin. The venom of the spider P. nigriventer contains peptides that cause excitability in the nervous neurotransmission by modifying the physiology of sodium, potassium and calcium channels. Since the dynamics of the changes described differed between brain regions and among neonates and young adult animals, we suggest regional specificities and functionality of BHE and immunoreactive neurons in response to PNV. These results are the first to demonstrate changes in the hippocampus and cerebellum VEGF/Flt-1/Flk-1 system that courses with neuroexcitotoxic signs of animals that were treated with venom / Mestrado / Farmacologia / Mestra em Farmacologia

Made available in DSpace on 2015-04-22T22:12:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Erika Portela de Lima Silva.pdf: 770664 bytes, checksum: b6b83b117ec0ee88c1214d68278a1c6f (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The study of the interaction between pairs of species is the basis for understanding the coexistence in biological communities. The ability to select habitats may be important in the coexistence of competing species and in the interactions between predators and prey. This selection is often associated with the capacity of perception of chemical cues of prey and structural components of the habitat. The perception and response to chemical cues have been demonstrated for wandering spiders, but only for the family Lycosidae in temperate regions. The soil is among the structural factors that affect habitat selections in spiders, but this has been demonstrated only for burrowing spiders. In tropical forests, high biological diversity and the rapid degradation may hinder the recognition of cues from multiple species of predators and prey. Habitat selection based on different soil types may be important in this ecosystem where drastic soil alternations are common between nearby sites, especially if the soil type is related to some important resource. We assessed the response of two species of wandering spiders in a forest in central Amazonia, Ctenus amphora Melo-Leitão 1930 and Ctenus crulsi Melo-Leitão 1930 (Araneae, Ctenidae) (1) to chemical cues from potential prey, crickets Gryllus assimilis (Fabricius, 1775) (Orthoptera, Gryllidae) and termites Syntermes Holmgren, 1910 (Isoptera, Termitidae), (2) to chemical cues from predators, spiders Phoneutria Perty, 1833 (Araneae, Ctenidae) and army ants Labidus praedator (Fr. Smith, 1858 ) (Formicidae, Ecitonini), (3) and two soil types, sandy and clay soils on which the distribution and abundance of these species diverge. For the first two evaluations we compared the proportion of time on filter paper with and without the chemical cues, to the third evaluation we compared the proportion of time on the two types of soil. These observations were performed over 09 hours with 54 observations per spider at intervals of 10 minutes. A total of 65 spiders were observed in the experiment with prey (termites cues, crickets cues and control), 36 in the experiment with predators Phoneutria (Phoneutria cues and control), 15 in the experiment with army ants (army ants cues and control) and 67 spiders in the soil experiment. The two species spent significantly longer time on the filter paper with chemical cues from the 9 prey, which indicates that the perception of cues can be important for the foraging of the two species. Although C. crulsi consumes far more Syntermes termites in natural conditions, the two species did not differ in the proportion of time on the cues from termites in comparison to the time on cues from crickets, sugesting that they do not differ in the ability to detect the chemical from these prey. No antipredator response was detected for the two species of Ctenus. Therefore, there is no evidence that the coexistence of these species is facilitated by differences in the perception of chemical cues. Only C. crulsi presented preference to a type of soil, the clay soil, which coincides with the type of soil where it is found in abundance in nature. This response of C. crulsi can influence the distribution of C. amphora, due to interactions of these species. Therefore, the perception of soil type is probably an important proximal factor in determining the distribution patterns and dynamics of coexistence of these species. / O estudo da interação entre pares de espécies é uma das bases para a compreensão da coexistência em comunidades biológicas. A capacidade de selecionar habitats pode ser importante tanto na coexistência de espécies que competem entre si como nas interações entre predadores e presas. Esta seleção está muitas vezes associada à capacidade de percepção de pistas químicas de presas e de componentes estruturais do habitat. A percepção e resposta a pistas químicas já foram demonstradas para aranhas errantes, mas somente para a família Lycosidae em regiões temperadas. O solo está entre os fatores estruturais que influem na seleção de habitat em aranhas, mas isto apenas foi demonstrado para aranhas construtoras de toca. Em florestas tropicais, a alta diversidade biológica e a rápida degradação podem dificultar o reconhecimento de pistas das múltiplas espécies de predadores e de presas. A seleção de habitat com base nos diferentes tipos de solo pode ser importante neste ecossistema em que são comuns alternâncias drásticas de solos entre locais próximos, especialmente se o tipo de solo estiver relacionado com algum recurso importante. Avaliamos a resposta de duas espécies de aranhas errantes de uma floresta na Amazônia central, Ctenus amphora Melo-Leitão 1930 e Ctenus crulsi Melo-Leitão 1930 (Araneae, Ctenidae) (1) às pistas químicas de potenciais presas, grilos Gryllus assimilis (Fabricius, 1775) (Orthoptera, Gryllidae) e cupins Syntermes Holmgren, 1910 (Isoptera, Termitidae); (2) às pistas químicas de predadores, aranhas Phoneutria Perty, 1833 (Araneae, Ctenidae) e formigas de correição Labidus praedator (Fr. Smith, 1858) (Formicidae, Ecitonini); (3) e dois tipos de solo, solo arenoso e argiloso, sobre os quais a distribuição e abundância destas espécies diverge. Para as duas primeiras avaliações, comparamos a proporção de tempo sobre recortes de papel filtro com e sem as pistas químicas, para a terceira avaliação comparamos a proporção de tempo sobre os dois tipos de solo. Estas observações foram realizadas ao longo de 09 horas com 54 observações por aranha realizadas em intervalos de 10 minutos. Foram observadas 65 aranhas no experimento com as presas (pistas de cupins, grilos e controle), 36 aranhas no experimento com Phoneutria (pistas de Phoneutria e controle), 15 no experimento com formigas de correição (pistas de 7 formiga e controle), e 67 aranhas no experimento de solos. As duas espécies permaneceram significativamente mais tempo sobre as pistas de presas, indicando que a percepção de pistas pode ser importante para o forrageio das duas espécies. Apesar de C. crulsi consumir muito mais cupins Syntermes em condições naturais, as duas espécies não diferiram na proporção do tempo sobre as pistas de cupins em comparação ao tempo sobre pistas de grilos, indicando que não diferem na capacidade de detectar quimicamente estas presas. Não foi detectada resposta antipredatória pelas duas espécies de Ctenus. Portanto, não encontramos evidências que a coexistência destas duas espécies seja facilitada por diferenças na percepção de pistas químicas. Apenas para C. crulsi foi encontrada resposta de preferência a um dos tipos de solo, o argiloso, que coincide com o tipo de solo onde ela é encontrada em maior abundância na natureza. A resposta de C. crulsi pode influir na distribuição de C. amphora, em função das interações destas duas espécies. Portanto, a percepção do tipo de solo provavelmente é um fator proximal importante a determinar os padrões de distribuição e a dinâmica da coexistência destas espécies.