Ulm, Univ. Diss., 2006.

HINTERGRUND: Im Zustand der Herzinsuffizienz sind die Plasmaspiegel des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) erhöht. ANP wird durch Herzmuskelzellen bei atrialer (und dadurch kardiomyozytärer) Dehnung freigesetzt. Eine Reihe von Plasmafaktoren, welche bei der Herzinsuffizienz aktiviert sind, bewirken ebenfalls eine ANP-Freisetzung durch die Interaktion mit G(alpha-q)-gekoppelten Rezeptoren und der daraus resultierenden Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Ziel der vorliegenden Studie war es, im Vergleich von normalen und insuffizienten Rattenherzen die dehnungsinduzierte ANP-Sekretion sowie die Rolle der PKC bei der basalen ANP-Freisetzung zu analysieren. METHODIK: Durch Anlegen eines infrarenalen aortokavalen Shunts (4 Wochen) wurde eine volumeninduzierte Herzinsuffizienz in Wistar Ratten erzeugt. Die ANP-Freisetzung wurde am isoliert, retrograd perfundierten Herzmodell analysiert. Durch Umstellen auf anterograde Perfusion (Perfusionsdruck: 10mmHg) wurde eine atriale De! hnung induziert. Die Aktivierung der PKC fand durch Zugabe von PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat) zum Perfusat im Vergleich zu Vehikel statt. Alle Versuchsreihen wurden mit Herzen von shunt- sowie scheinoperierten Tieren durchgeführt. ERGEBNISSE UND DISKUSSION: Nach Shuntoperation war die ANP-Basalfreisetzung deutlich gesteigert und könnte die erhöhten ANP-Plasmaspiegel bei Patienten mit Herzinsuffizienz erklären. Dagegen wurde durch atriale Dehnung (als adäquaten Freisetzungsreiz am gesunden Herzen) keine weitere Steigerung der ANP-Freisetzung in der Shuntgruppe bewirkt. Die ANP-Freisetzung am insuffizienten Herzen ist im Vergleich zur normalen Herzfunktion somit verändert. Unter PKC-Stimulation sank die Freisetzung von ANP in der Shuntgruppe erheblich ab, wogegen es in der Kontrollgruppe zu keiner signifikanten Änderung der ANP-Sekretion kam. Damit wurde der Verdacht erhärtet, dass die Proteinkinase C in die abweichende Regulation der ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizie! nz involviert ist. / BJECTIVE: Plasma levels of atrial natriuretic peptide (ANP) are markedly increased in congestive heart failure. ANP has been shown to be released by cardiomyocytes during atrial (and thereby cardiomyocytical) stretch. Several factors that are activated in heart failure as well enhance ANP release through the interaction with G(alpha-q)-coupled receptors and the consequent activation of proteinkinase C (PKC). The goal of this study was to analyse stretch induced ANP secretion and to investigate the involvement of PKC in the regulation of ANP release in heart failure compared to normal hearts. METHODS: Volume overload induced heart failure was produced by an infrarenal aortocaval shunt (4 weeks) in Wistar rats. ANP release was analysed in an isolated retrogradly perfused heart preparation. Atrial stretch was induced by switching to anterograd perfusion (perfusion pressure: 10mmHg). For PKC activation PMA (phorbol 12 myristate 13 acetate) was added to the perfusate and compar! ed to vehicle treatment. All experiments were performed with shunt and sham operated rats. RESULTS AND CONCLUSIONS: After shunt operation ANP baseline release was considerably augmented and could thus explain elevated ANP plasma levels in heart failure patients. In contrast, atrial stretch as an adequate secretion stimulus in control hearts did not further enhance ANP release in hearts of shunt operated animals. The ANP secretion in heart failure therefore seems to differ from the ANP secretion in the healthy state. Stimulation of PKC markedly decreased ANP release in the shunt group, whereas it did not have any significant effect on ANP release in the control group. In conclusion, the role of the proteinkinase C in ANP release differs between normal and failing hearts and seems to be involved in the deviating regulation of ANP release in states of heart failure.

Das Ziel dieser Studie war es, die Beteiligung der nichtmuskulären schweren Myosinketten an der Kontraktion der glatten Muskeln unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Als Versuchsmodell wurde die Harnblase von neugeborenen Wildtyp und transgenen Mäusen verwendet, bei denen das Gen für die glattmuskelspezifischen schweren Myosinketten durch "Gene Targeting" funktionell eliminiert wurde (Knock-Out). Das Fehlen der Expression der glattmuskelspezifischen schweren Myosinketten wurde durch Elektrophorese und Immunfärbung bestätigt. Im Gegensatz dazu blieb die Expression der nichtmuskulären schweren Myosinketten unverändert. Die mechanische Analyse des glatten Muskels wurde mit intakten Muskelpräparaten aus der Harnblase durchgeführt. Das Muskelpräparat wurde in KCl-Lösung oder mit Phorbolester stimuliert. Die Aktivierung mittels depolarisierender KCl-Lösung führte bei neugeborenen Wildtyp Mäusen zuerst zu einer transienten Kontraktion (Phase 1) mit hoher Kraftentwicklung und maximaler Verkürzungsgeschwindigkeit, und danach zu einer tonischen Kontraktion (Phase 2) mit niedrigerer Kraftentwicklung und maximaler Verkürzungsgeschwindigkeit. Blasenpräparate neugeborener Knock-Out Mäuse dagegen zeigten keine Phase 1, sondern nur eine tonische Kontraktion, die mit Wildtyp Mäusen vergleichbar war. Daher scheint nichtmuskuläres Myosin an der tonischen Kontraktion des glatten Muskels beteiligt zu sein. Durch Stimulierung mit Phorbolester waren ähnliche tonische Muskelkontraktionen der Blasenpräparate sowohl bei Wildtyp als auch bei Knock-Out Mäusen zu beobachten. Vermutlich wird also das nichtmuskuläre Myosin durch Stimulierung mit Phorbolester aktiviert. Intrazelluläre Filamente wurden durch Immunfluoreszenz mit einem spezifischen Antikörper gegen nichtmuskuläre schwere Myosinketten in kultivierten primären glatten Muskelzellen untersucht. Dabei zeigten die Muskelzellen sowohl von Wildtyp als auch von Knock-Out Mäusen intrazelluläre dicke Myosinfilamente, was für die Beteiligung des nichtmuskulären Myosins an der glatten Muskelkontraktion spricht. Entsprechend wurden intrazelluläre Filamente mit einem Antikörper gegen glattmuskelspezifische schwere Myosinketten in kultivierten primären glatten Muskelzellen untersucht. Wie erwartet, konnten nur in glatten Muskelzellen von Wildtyp Mäusen intrazelluläre Filamente nachgewiesen werden, nicht aber in denen von Knock-Out Mäusen. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass nichtmuskuläres Myosin zumindest an der tonischen Kontraktion glatter Muskelzellen beteiligt sein kann. / The aim of the present study was to investigate the involvement of non-muscle myosin heavy chain in smooth muscle contraction under physiological conditions. As an experimental model urinary bladder from neonatal wild-type mice as well as from neonatal mice with disrupted smooth muscle myosin heavy chain expression was used. This animal model was established through gene targeting technology, resulting in complete elimination of the expression of smooth muscle myosin heavy chains. The lack of expression of smooth muscle myosin heavy chains was confirmed by electrophoresis and immunoblotting. On the other hand, non-muscle myosin heavy chain expression remained normal, as verified by Western blot analysis. The mechanical analysis of smooth muscle was performed with intact urinary bladder preparations, stimulated using prolonged KCl depolarization or with phorbol ester. Prolonged activation by KCl depolarization of intact bladder preparations from wild-type neonatal mice produced an initial transient state (phase 1) of high force generation and maximal shortening velocity, followed by a sustained state (phase 2) with lower force generation and maximal shortening velocity. In contrast, bladder preparations from homozygous knockout neonatal mice did not exhibit phase 1, but phase 2 could be observed, i.e. a similar isometric force and maximal shortening velocity, compared to wild-type phase 2. Thus, non-muscle myosin appears to be recruited in the sustained phase of smooth muscle contraction during prolonged KCl depolarization in the animal model used. Upon stimulation with phorbol ester a similar sustained contraction was observed in both wild-type and knockout smooth muscle preparations. Therefore, non-muscle myosin may also be recruited during phorbol ester stimulation in both wild-type and knockout muscle preparations. The participation of non-muscle myosin in smooth muscle contraction was further supported by the finding of longitudinally arranged intracellular filaments in cultivated smooth muscle cells from both wild-type and knockout mice by immunofluorescence microscopy, using a specific antibody raised against non-muscle myosin heavy chain. In a similar way, smooth muscle myosin heavy chain structures were investigated in cultivated smooth muscle cells. As expected, longitudinally arranged intracellular filamentous structures of smooth muscle myosin were observed in wild-type smooth muscle cells, but not in smooth muscle cells from knockout mice. In conclusion, in neonatal smooth muscle the initial phase of contraction elicited by KCl depolarization is generated by smooth muscle myosin heavy chain recruitment. Upon prolonged KCl depolarization non-muscle myosin is recruited in the sustained phase of contraction, as well as upon stimulation with phorbol ester. Thus, it was possible, for the first time, to verify the involvement of the non-muscle myosin in smooth muscle contraction in vivo. The results of the present study contribute to the understanding of the regulatory mechanisms of smooth muscle contraction.