L'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques constitue un problème majeur de santé publique responsable d'un nombre croissant de décès, surtout dans les hôpitaux. La résistance aux aminoglycosides est principalement due à l'expression d'enzymes capables de les modifier, comme les aminoglycosides phosphotransférases (APH).Le premier volet de ce travail de thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires des interactions protéine-ligands et de la catalyse enzymatique d'une de ces enzymes, l'APH(2”)-IVa. La spécificité de substrats a été caractérisée en détails pour différents aminoglycosides par des méthodes thermodynamiques, de mesures cinétiques à l'état stationnaire et transitoire, par amarrage moléculaire et cristallographie aux rayons X. La seconde partie de cette étude consiste à développer et optimiser des inhibiteurs allostériques de ces enzymes capables de restaurer l'efficacité des aminoglycosides. Pour cela, une cavité, potentiellement impliquée dans la dynamique de l'APH(2”)-IVa, a été identifiée à partir de simulations de dynamique moléculaire. Celle-ci a servi de cible pour cribler, in silico, 12 000 composés issus de la banque de données Zinc. Ainsi, 14 composés ont été testés in vitro pour leur capacité à diminuer l'activité enzymatique d'APH. Parmi ces derniers, une molécule s'est révélée être un inhibiteur non-compétitif de l'APH(2”)-IVa. Une étude des relations structure-fonction a permis de déterminer les groupements les plus favorables à l'inhibition et d'identifier un composé plus efficace. L'utilisation de ces deux molécules permet de restaurer, par exemple, la sensibilité à la sisomicine d'une souche d'E. faecium exprimant cette enzyme. Cette étude fournit des bases au développement de thérapies combinant un aminoglycoside et un inhibiteur des enzymes d'inactivation constituant une stratégie pour lutter contre la résistance aux antibiotiques dans un contexte thérapeutique. / Emergence of multi-drug resistant bacteria leads to increasing fatal issues especially in hospitals. Resistance to aminoglycoside antibiotics is mainly due to the expression of modifying enzymes, such as aminoglycoside phosphotransferases (APH). The first aim of this project was to elucidate the molecular basis of protein-ligand interactions and catalysis of one of these enzymes, the APH(2”)-IVa. Promiscuity of aminoglycoside substrates has thus been characterized in details using thermodynamics, transient and steady state kinetics, molecular docking and X-ray crystallography techniques.The second part aimed to develop and optimize allosteric inhibitors of these enzymes able to counterbalance aminoglycoside resistance. For this purpose, a small cavity, potentially involved in APH dynamics, was identified from molecular dynamic simulations. This cavity was used as a target to virtually screen 12 000 compounds of the Zinc database. The efficiency of the 14 high-ranked molecules to inhibit APH was evaluated in vitro and lead to the identification of a non-competitive inhibitor of APH(2”)-IVa. Structure-activity relationships highlighted the most favourable substituents for APH inhibition and permitted to obtain a more potent compound. The two molecules were able to restore, for example, sisomicin susceptibility of an E. faecium strain, expressing this enzyme.This study provides a basis for the development of combined chemotherapies (antibiotic with enzyme inhibitor) which may overcome antibiotic resistance in a clinical context.

Neisseria meningitidis (Nm) est un germe commensal du rhinopharynx ayant pour seul hôte l’homme. Malgré un portage asymptomatique largement répandu, et pour des raisons encore inconnues, elle peut échapper au système immunitaire de l’hôte et devenir pathogène provoquant ainsi méningite et septicémie pouvant être mortelles principalement chez les enfants. Au cours du processus infectieux, Nm alterne entre des phases de colonisation et de dissémination, et se retrouve alors confrontée à différents environnements. L’adaptation rapide à ces variations, par modulation de l’expression des gènes de virulence, représente un facteur important dans sa pathogénie. Les facteurs qui contribuent à la virulence de Nm sont essentiellement des structures présentes à la surface de la bactérie parmi lesquelles les pili et la capsule. Les gènes codant ces facteurs sont sous le contrôle de la protéine CrgA, régulateur transcriptionnel de la famille LysR qui intervient lors de l’adhésion de Nm aux cellules humaines. La protéine CrgA régule négativement sa propre expression ainsi de celle des gènes impliqués dans la synthèse de la capsule (sia) et des pili (pilE et pilC1). Par ailleurs, le PTS est un système de transduction du signal qui intervient, par phosphorylation ou via des interactions protéine/protéine, dans le transport des sucres et dans la régulation du métabolisme du carbone. Chez Nm, ce système est incomplet (constitué des protéines EI, HPr, et deux EIIA), il n’est donc pas fonctionnel pour le transport des sucres mais aurait pu conserver ses fonctions régulatrices. Nous avons montré que les protéines du PTS de Nm étaient actives in vitro et in vivo et que la cascade de phosphorylation du PTS était fonctionnelle. Nous avons également montré que l’inactivation du gène ptsH, codant la protéine HPr, entrainait une diminution significative de la synthèse de la capsule, une augmentation de l’adhésion du mutant aux cellules épithéliales humaines et une augmentation de l’expression de crgA. De ce fait, l’absence de l’HPr semble empêcher la répression de crgA et par conséquent celle des gènes sia. Par ailleurs, des expériences de co-immunoprécipitation, nous ont permis de mettre en évidence que l’HPr interagissait directement avec la protéine CrgA in vitro et in vivo. Ces résultats suggèrent que la protéine HPr interviendrait dans la régulation de l’expression des gènes de virulence de Nm via la régulation de l’expression de crgA. Ainsi, un lien entre métabolisme du carbone et virulence a été mis en évidence chez Nm. / Neisseria meningitidis (Nm) is a commensal bacterium of the nasopharynx, which only colonizes humans. Despite a large number of asymptomatic carriers, and for reasons so far unknown, Nm occasionally becomes virulent, escaping the host’s immune system and causing septicaemia and meningitis, the latter being potentially lethal, mostly in children.During the infectious process, Nm alternates between phases of colonization and dissemination, each time facing different environments. This rapid adaptation to the changing environment occurs via the modulation of the expression of virulence genes and represents an important factor of pathogenicity. The structures involved in virulence in Nm are mainly present at the surface of the bacterium, including the pili and the capsule. The genes coding for these structures are controlled by the CrgA protein, a transcriptional regulator of the LysR family, which is induced during the adhesion of Nm to human cells. CrgA negatively regulates its own expression as well as the expression of those genes implicated in the synthesis of the capsule (sia) and pili (pilE and pilC1).Moreover, the PTS is a signal transduction system, which is involved, via phosphorylation or protein/protein interactions, in the transport of sugars and the regulation of the carbon metabolism. In Nm, the PTS is incomplete (only composed of the proteins EI, HPr and two EIIA), thus not functioning in the transport of sugars but it may have conserved regulatory functions.In this work, we demonstrate that the PTS proteins in Nm are active in vitro and in vivo and that the phosphorylation cascade of the PTS is functional. We further show that the inactivation of the ptsH gene, coding for the HPr protein, significantly reduces the synthesis of the capsule, enhances the adhesion of the mutants to human epithelial cells and increases the expression of crgA. Thus, the absence of HPr seems to inhibit the repression of crgA and as a consequence also the repression of the sia genes. Furthermore, from co-immunoprecipitation experiments we provide evidence that HPr directly interacts with the CrgA protein in vitro and in vivo. These results suggest that the HPr protein in Nm regulates the expression of the virulence genes via the regulation of crgA expression. Thus, we provide evidence of a link between carbon metabolism and virulence in Nm.