Le récepteur nucléaire HNF4α est un facteur de transcription qui contrôle l’expression des gènes au niveau de l’épithélium de l’intestin et du côlon. Récemment associé au cancer colorectal, HNF4α pourrait réguler des processus importants pour la survie des cellules cancéreuses. Son rôle dans le cancer colorectal est toutefois controversé, ce qui compromet son utilisation en tant que cible thérapeutique. Par contre, les fonctions de HNF4α au côlon sont accomplies par deux différentes classes d’isoformes (P1 et P2) qui ont été très peu caractérisées jusqu’à présent. Pour clarifier le rôle de HNF4α, nous avons donc évalué les fonctions spécifiques de ses isoformes P1 et P2 dans le cancer colorectal. Nous avons observé que l’expression des isoformes P1 de HNF4α est localisée dans la région supérieure différenciée des cryptes du côlon alors que celle des isoformes P2 dans la région inférieure proliférative. Au cours du cancer colorectal, l’expression des isoformes P1 est inhibée au niveau de leur ARNm par l’activation de la β-caténine alors que l’expression des isoformes P2 est maintenue. Pour vérifier si ces isoformes ont des fonctions spécifiques dans le cancer colorectal, nous avons déterminé par ChIP-seq et RNA-seq leur gènes cibles spécifiques chez les Caco2/15. Les résultats suggèrent que les isoformes de HNF4α régulent des réseaux de gènes distincts permettant aux isoformes P1 d’influencer le métabolisme énergétique et aux isoformes P2 les mécanismes moléculaires associés au développement du cancer colorectal. De plus, plusieurs des partenaires protéiques des isoformes P2 identifiés par GFP-Trap et BioID chez les cellules cancéreuses sont associés aux mécanismes de réparation des dommages à l’ADN suggérant un nouveau rôle pour HNF4α. Notre étude suggère donc que les isoformes P1 et P2 de HNF4α régulent des réseaux de gènes différents dans le cancer colorectal. L’inhibition des isoformes P1 par la β-caténine pourrait permettre d’adapter le métabolisme aux besoins des cellules cancéreuses alors que le maintien de l’expression des isoformes P2, favoriser l’activité des voies oncogéniques et contribuer à la réponse aux dommages à l’ADN.

Apicomplexan parasites are leading causes of human and livestock diseases such as toxoplasmosis and malaria caused by Toxoplasma gondii and Plasmodium falciparum respectively. These organisms are varied in their morphologies and astoundingly complex on their life cycles that include infections of more than one host organism, differentiation through several morphologically distinct forms, and both sexual and asexual replication. What we and others have initially proposed was that the control of gene expression and cellular differentiation are particularly interesting in these organisms, as the apparent lack of large families of recognizable transcription factors typically found in other eukaryotic organisms suggests that they may be unusually reliant on epigenetic mechanisms. The initial hypothesis had to be re-assessed in light of the discovery in Apicomplexa of an expanded family of plant-like transcription factors (TFs) harbouring APETALA2 (AP2)-like domains. Yet, a growing body of evidence tends to favor epigenetic as one of the main contributor to parasite developmental programs and adjustments to fluctuant environment. One way to examine dynamic changes in post-translations modifications (PTMs) patterns is to alter the histone code writing. We therefore took advantage of HDAC inhibitors and showed that specific inhibition of TgHDAC3 by the cyclopeptide FR235222 disrupts the genome wide steady-state level of histone H4 acetylation inducing derepression of stage-specific genes. Yet, many questions about TgHDAC3 modus operandi remain unanswered. During my thesis, I uncovered the TgHDAC3-regulated proteome-wide acetylome typified by the presence of non-histone proteins including AP2 TFs and novel PTMs, e.g. the acetylation at Lys31 within the globular domain of histone H4. H4K31ac promotes a relaxed chromatin state at the promoter of active genes through nucleosome disassembly in both parasites. We identified TgGCN5B and TgHDAC3 as two antagonist enzymes regulating H4K31 acetylation in T. gondii. In contrast, H4K31monomethylation is enriched throughout the gene body of T. gondii active genes and contributes to transcription, whereas it is enriched at transcriptionally inactive pericentromeric heterochromatin regions in P. falciparum, a region that is lacking H3K9me3 and heterochromatin protein 1 in this parasite. We also showed that treating T. gondii cystogenic strains with a low dose of FR235222 induces the levels of proteins known to be expressed exclusively in cat (sporozoite and merozoite) or in murine chronic stage (bradyzoite). Lastly, we determined the specific interactome of TgHDAC3 and found as partners a MORC protein (CR230), several AP2 TFs, and ELM2 domain-containing scaffolding proteins. Collectively, these data established TgHDAC3 family as a central regulator of gene expression and stage conversion in T. gondii and, likely, other Apicomplexa. / Apicomplexan genome architecture is typified by a binary chromatin structure, with a major fraction of the bulk genome packaged as transcriptionally permissive euchromatin while few loci are embedded in silenced heterochromatin. There is evidence that histone modifications occurring at the lateral surface of the nucleosome play a substantial role in shaping chromatin structure, yet our understanding of the exact mechanism of action is poor. Here, we address how versatile modifications at Lys31 within the globular domain of histone H4 contribute to genome organization and expression in Apicomplexa. H4K31 acetylation was found at the promoter of active genes. The residue lies where the DNA wraps around the histone and its acetylation may enhance nucleosome disassembly, thereby favoring a more relaxed, open chromatin state. This residue tends also to be monomethylated and depending of the parasite examined different patterns were found. H4K31me1 was enriched in the core body of Toxoplasma active genes, yet its occupancy was inversely correlated with transcripts levels likely because the mark by reducing histone turnover impedes RNA polymerase progression across transcribed units. In contrast to the methylation of H3, it is the first time that a methylated residue of H4 has been clearly associated with transcriptional regulation. In Plasmodium, H4K31me1 was exclusively enriched at transcriptionally inactive genomic regions and peculiarly at pericentromeric heterochromatin, likely to replace the missing H3K9me3 that commonly decorated pericentric nucleosomes in other species.

Dans les cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), le groupe de protéines Polycomb (PcG) répriment les gènes de développement en participant ainsi à la maintenance de l’état de pluripotence. Ce complexe dépose la H3K27me3au niveau des éléments régulateurs induisant une compaction de la chromatine. Cette marque forme en plus des marquesactives H3K4me3 présentes des domaines bivalents. Etrangement, des boucles d’ADN dites entre le promoteur et enhancer, généralement associé à l’activation du gènes, sont observées au niveau des gènes bivalents avant leur activation.On suppose que la fonction du PcG pourrait être de neutraliser l'enhancer conférant une future activation rapide des gènes.Au cours de ma thèse, j’ai identifié les boucles d’ADN formé par les réprimés par PcG dans les mESCs. Pour cela,j’ai effectué un profilage épigénomique de 4 marques d'histones et identifié près de 2500 promoteurs bivalents et 13000enhancers. En utilisant des données publiées de Hi-C à haute résolution, j’ai identifié toutes les boucles formées par les domaines bivalents. Etonnement, j’ai pu identifier que de nombreux gènes réprimés par PcG interagissent avec des enhancers actifs. Cette observation a été suivie d'une validation par le 4C-seq. De plus, j’ai effectué une caractérisation fonctionnelle des boucles en utilisant deux approches. Tout d'abord, j'ai mis en place, en collaboration avec D. Bourc'his(Institut Curie), un système de culture de mESCs (2i + VitC) où le taux de H3K27me3 est réduit. J'ai effectué un profilage épigénomique similaire révélant que les promoteurs réprimés par PcG ont perdu la marque H3K27me3. En RNA-seq, j’ai démontré que l’expression des gènes ne change pas après le PcG soit détacher des promoteurs.. Ensuite, par la réalisation de plusieurs validations en 4C-seq j’ai démontré que les interactions avec les enhancers ne sont pas affecté alors que la moitié des enhancers interagissant perdent leurs marques activatrices. Dans le système 2i+VitC, ces gènes semblent être réprimés par un autre mécanisme suite à la perte du PcG. De plus, j’utilise une approche ciblée pour enlever localement laH3K27me3 de deux gènes bivalents en utilisant le système Cette technique est en cours d’optimisation.Notre étude est la plus systématique au niveau génomique des boucles d'ADN dans le cadre de la régulation des gènes PcG. Notre étude révèle une nouvelle fonction du PcG qui est la répression de boucle d’ADN déjà établies entre promoteurs et enhancers. / In the mouse embryonic stem cells (mESCs), Polycomb Group Proteins (PcG) repress developmental genes and thereby participating in the maintenance of the pluripotency. PcG repress genes by depositing the H3K27me3 histone marks on their regulatory elements, followed by chromatin compaction. In addition to the H3K27me3 marks, those genes carry H3K4me3 active marks and were characterized as bivalent. Intriguingly, at many PcG repressed genes, DNA loops can be observed with enhancer elements, which are normally thought to have an activating function. The aim of my project is to both describe and mechanistically dissect the function of Polycomb repressed promoter – enhancer loops.During my PhD, I aimed firstly to identify all promoter–enhancer loops involved by PcG repressed genes in mESCs. I have performed ChIP-seq profiling of 4 histone marks and identified around 2500 PcG repressed promoters and 13000 enhancers. Using a recently published high-resolution Hi-C data in mESCs, I have identified all DNA loops that are formed by PcG repressed promoters. Surprisingly, a high percentage of bivalent promoters were found to contact active enhancers. The presence of those loops were validated by ultra-high 4C-seq on selected genes and imply a small significant increase of the gene expression without leading to a complete activation of the gene. I have established a more physiological ESC model (2i+VitC) where H3K27me3 is reduced at all promoters. I have performed ChIP-seq, where bivalent promoters were all classified as H3K27me3 negative. RNA-seq experiments have showed that those genes do not become activated. 4C-seq experiments have revealed that those loops do not disappear after PcG removal, whereas the half of interacted enhancer loose their H3K27ac active marks. Those genes seem to remain repressed by an unknown mechanism. These results argue for a possible role of PcG in preparing the gene for their activation by blocking the productivity of such DNA loops. Secondly, I aimed to functionally characterize those DNA loops by using a CRISPR/dCas9 approach to completely remove H3K27me3 from two PcG repressed genes that contact active enhancers Pax6 and Nkx1-1 genes. This system is still under optimization steps.My project revealed the most systematic characterization of DNA loops under the regulation of PcG, providing important insight how PcG function to inactivate such loops. I have highlighted an additional function of PcG which the involvement in the repression of already establish loops between active enhancers and promoters and thereby blocking the productivity of such activating loops. This function is an addition to the already described repressive function of PcG on both promoters and poised enhancers.

Les microARN jouent un grand rôle dans la régulation de l'expression des gènes bien que leur mécanisme d'action soit encore sujet à débat. Des premières études chez le vers C. elegans aux différents systèmes in vitro qui ont ensuite été développés, plusieurs modèles ont été proposés, comme l'inhibition de la traduction au niveau de l'initiation ou de l'élongation, et la déstabilisation du transcrit par déadénylation. Cependant, à la lumière des découvertes récentes, un consensus semble apparaître et indique que les miARN inhiberaient d'abord la traduction avant d'induire la déadénylation du transcrit, provoquant ainsi sa dégradation prématurée. D'autre part, le blocage traductionnel semble impliquer à la fois la coiffe en 5' et la queue poly(A) en 3' de l'ARNm ainsi que les facteurs qui s'y lient, c'est à dire le facteur d'initiation de la traduction eIF4F et la Poly(A) Binding Protein (PABP). Ces résultats ont conduit au modèle selon lequel, les miARN seraient capables d'empêcher la liaison entre ces deux facteurs et donc la circularisation du transcrit qui est essentielle à la fois au recrutement de la machinerie traductionnelle et à la stabilité de l'ARNm. Afin de mieux comprendre ce mécanisme, notre laboratoire a développé un système in vitro basé sur l'utilisation du lysat de réticulocytes de lapin qui permet d'étudier l'effet traductionnel des miARN en s'affranchissant de dégradation du transcrit. L'étude de l'effet de drogues et d'enzymes virales, capables de bloquer spécifiquement la fonction de chaque facteur d'initiation dans ce système, a permis de déterminer le rôle clé de eIF4G et PABP dans l'inhibition traductionnelle par les miARN. Cependant, leur interaction n'est pas requise et le blocage s'effectue plutôt au cours de l'étape de balayage de la région 5' non codante par la petite sous-unité ribosomique. En parallèle de cette étude in vitro, un travail sur des lignées cellulaires a permis de déterminer l'influence de la queue poly(A) sur l'effet miARN. De façon très surprenante, l'expression des transcrits non polyadénylés n'est plus inhibée et est même stimulée par les miARN. Cet effet est dépendant de l'association du domaine MIF4G du facteur eIF4G avec le facteur eIF3, ce qui suggère qu'en l'absence de queue poly(A), les miARN seraient capables de stimuler le recrutement de la petite sous-unité ribosomique sur l'ARNm. L'ensemble de ces résultats révèle la complexité de l'effet miARN sur la traduction et ouvre de nouvelles voies / The mechanism by which microRNAs (miRNAs) can control gene expression has been a great matter of debate. From the first studies in worm to the in vitro systems that are used today, many models have been proposed that include regulation at the level of translation or at the level of mRNA stability by controlling 3' deadenylation and decay. Recent studies provided a consensus model of all these discrepancies and suggested that translation inhibition occured first and is followed by deadenylation and further degradation of the target transcript. Moreover, translation silencing seems to occur at the initiation level, and requires eIF4F and PABP initiation factors. This led to the hypothesis that miRNAs could interfere with the interaction between these two factors thus affecting the circularisation of the mRNA, which is essential for translation efficiency. In order to gain insight into this mechanism, we have used an in vitro system based on the rabbit reticulocyte lysate that fully recapitulates miRNA effects on translation with virtually no effect on deadenylation and decay. Using this system and a wide spectrum of translational inhibitors, we have narrowed down the step of initiation at which repression is exerted and we found that miRNAs affect mainly ribosomal scanning. This effect requires the presence of both eIF4G and PABP but does not rely on their physical interaction. Further analysis of miRNA repression in cells revealed that the poly(A) tail was an absolute requirement for miRNA action. To most of our surprise, we observed that removal of the poly(A) resulted in a shift from repression to stimulation of mRNA expression. This effect seems to require the middle domain of eIF4G and the presence of the Ago proteins. Altogether, these results reveal the complexity of miRNA effect and open new prospects on translation regulation

Dans cette these, nous identifions le réseau de régulation de gènes (RRG) agissant en aval de CROWN ROOTLESS1 (CRL1) et impliqué dans la formation des racines coronaires (RC) chez le riz, en vue d’identifier des gènes candidats pour moduler l’architecture du système racinaire (ASR) du riz et du maïs. Pour ce faire, nous avons généré une série temporelle transcriptomique, et l’avons utilisée pour inférer le RRG en jeu durant 45 heures après l’induction de CRL1, un intervalle couvrant les étapes précoces de l’initiation des RC. Nous avons partiellement validé ce réseau en utilisant des bases de données de prédiction de sites de liaison de facteurs de transcription, ainsi que la littérature décrivant des interactions connues. A partir de ce réseau validé, nous avons identifié une cascade de régulation reliant des gènes impliqués dans l’initiation des RC à d’autres genes impliqués dans le patterning et la maintenance des primordia de RC, et testé cette cascade par des essais de transactivation en protoplastes. Les résultats obtenus ont globalement confirmé la cascade prédite, ce qui démontre l’utilité des approches de biologie des systèmes pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des RC. Un autre jeu de données transcriptomique a été obtenu par microdissection laser des primordia de RC à trois stades développementaux. L’analyse différentielle par rapport au tissu cortical adjacent révèle la regulation transcriptionnelle en jeu après l’initiation des RC et l’organisation des primordia. A partir d’une analyse croisée entre données de la série temporelle, données issues de microdissection, autres listes de gènes publiées en lien au développement racinaire chez le riz, analyse formelle du RRG et curation de la littérature, nous avons établi quatre classements en fonction de différentes stratégies de pondération, et identifié les gènes les plus importants du RRG. A partir de ce méta-classement, deux gènes candidats ont été identifies. Leur impact sur la formation des RC et l’ASR sera étudiée au travers de la génération de lignées de surexpression ou knock-out, chez le maïs et le riz. / In this thesis, we aimed at identifying the gene regulatory network (GRN) acting downstream of CRL1 and involved in the formation of crown root (CR) primordia in rice. We used this information to identify candidate genes to modulate root system architecture of rice and maize. To do so, we generated a time-series transcriptomic dataset that was used to infer the GRN at play during the 45 hour following CRL1 induction, covering early steps of CR primordia formation. This network was partially validated using a database describing predicted transcription factor (TF) target genes and literature on available regulatory interactions. From this, a regulatory cascade linking genes involved in CR initiation to genes involved in CR primordia patterning and maintenance was proposed and tested using transient protoplast transactivation assays. Obtained data mostly confirmed the predicted regulatory cascade demonstrating the usefulness of systems biology approaches to better understand the mechanisms involved in CR development. Another transcriptomic dataset obtained from laser capture microdissection of CR primordia at three later developmental stages analysed against adjacent stem cortex tissue, provided insight to the transcriptional regulation occurring after CR initiation and primordia organization. From cross-analysis between time series and microdissected primordia transcriptomic data set, other published gene lists related to root development in rice, formal GRN analysis and literature curation, we computed four rankings according to different scoring strategies to identify the most important genes in the GRN. From this meta-ranking, two candidate genes were identified. Their impact on CR formation and root system architecture will be further studied via the generation of over- or down-expressing lines in maize and rice.

La dérégulation de l’expression des microARN peut induire des cancers. De plus, ils jouent un rôle crucial dans la pathogénèse et la survie des virus. L’herpès virus humain de type 8 (HHV-8 ou KSHV) est l’agent étiologique du sarcome de Kaposi et est impliqué dans la génération de lymphomes agressifs de type B. De manière intéressante, le génome ce virus code 12 pré-miARN localisés dans la région de latence et exprimés sur un même pri-miARN. Les miARN du KSHV sont importants pour le maintien de la latence, l’inhibition de l’apoptose ou encore la régulation du cycle cellulaire de l’hôte. Nous nous intéressons à leur expression et leur régulation durant l’infection virale. Nous avons résolu la structure secondaire de l’ARN codant ces miARN afin d’identifier les critères structuraux responsables de leur accumulation différentielle. Nous avons initié une analyse cinétique de la première étape de maturation et enfin nous essayons d’identifier des co-facteurs modulant leur expression. / It is now well known that modulation of microRNAs expression is linked to the development of cancers. Moreover, they play a crucial role in the pathogenesis and the survival of some viruses. Kaposi’s sarcoma associated herpes virus (KSHV) is the etiologic agent of Kaposi’s sarcoma and is involved in human aggressive B lymphomas generation. Its genome encodes 12 precursor miRNAs that are clustered in a latency region and expressed on a single long primary transcript. KSHV miRNAs are important to maintain the virus latency and to regulate or inhibit the host cell cycle or apoptosis, respectively. Therefore, understanding the regulation of KSHV miRNA accumulation is of prime importance. In this respect, we resolved the secondary structure of them iRNA cluster to identify structural criteria responsible of their differential accumulation. In addition, we started to analyse the mechanism of their maturation by kinetics studies. Finally we tried to identify some cofactors of miRNA expression.

La régulation des gènes est à l’origine de la diversité cellulaire en permettant aux cellules de se différencier et de se spécialiser. La régulation génique repose largement sur l’existence de séquences d’ADN non codantes dans le génome, appelées "éléments cis-régulateurs", qui vont permettre de recruter de nombreux facteurs de transcription afin de former d’importants complexes (nucléo)protéiques qui vont agir sur le niveau de transcription des gènes. Ce recrutement est notamment contrôlé par des modifications épigénétiques. Le développement des techniques de séquençage et des méthodes d’analyse bioinformatiques permettent d’intégrer de grandes quantités de données pour étudier le fonctionnement des éléments régulateurs. Dans un premier temps, l’intégration de l’ensemble des données ChIP-seq disponibles dans les bases de données nous a permis de créer un catalogue d’éléments régulateurs putatifs chez l’Homme. L’analyse de ce catalogue nous a alors mené à caractériser ces éléments et à mettre en évidence la complexité combinatoire des facteurs de transcription. Dans un deuxième temps, nous avons réalisé une étude basée sur l’analyse des éléments régulateurs impliqués dans la différenciation précoce des lymphocytes T chez la souris. Cette étude a permis de mettre en évidence deux niveaux de complexité impliqués dans la régulation des gènes : le premier est basé sur la combinatoire des facteurs de transcription au sein des éléments régulateurs et le second repose sur la combinatoire des éléments eux-mêmes. Finalement, nous avons développé une nouvelle technique d’analyse quantitative et à haut débit de l’activité régulatrice de régions génomiques chez les mammifères. / Gene regulation is responsible for cell diversity by allowing cell differentiation and specialisation. Gene expression regulation relies mainly on the existence of non-coding DNA sequences in the genome, called "cis-regulatory elements", which recruit numerous transcription factors to form (nucleo)protein complexes which act on the gene transcription level. This recruitment is controlled in particular by epigenetic modifications. The rapid development of sequencing technologies and bioinformatics methods makes possible the integration of large amounts of data to study regulatory elements. First, the integration of ChIP-seq data for all transcription factors available in public databases has allowed us to create an extensive catalogue of putative regulatory elements in the human genome. The overall analysis of this catalogue led us to further characterize these elements and to highlight the high level of combinatorial complexity of transcription factors in the genome. Secondly, we conducted a more specific study based on the analysis of the regulatory elements involved in the early differentiation of T-cells in mice. This study provided an opportunity to highlight two levels of complexity based on regulatory elements and involved in gene regulation: the first rests on the transcription factor combinatorial in regulatory elements and the second is based on the combinatorial of elements themselves within loci. Finally, to validate experimentally the regulatory elements, we have developed a new quantitative and high-throughput technique to assess the regulatory activity of genomic regions in mammals.

L'angiotensine-II (Ang-II), synthétisée à partir de sources extracardiaques et intracardiaques, régule l'homéostasie cardiaque en favorisant des effets mitogéniques et en promouvant la croissance cellulaire résultant d’une altération de l'expression génique. Dans cette étude, nous avons évalué la possibilité que les récepteurs de l'angiotensine-1 (AT1) ou les récepteurs de l'angiotensine-2 (AT2) situés sur l'enveloppe nucléaire régulent l’expression génique des cardiomyocytes. En analysant les noyaux cellulaires retenus des fractions de cœur de rat par immunobuvardage Western, nous avons détecté une co-purification préférentielle des protéines AT1 et AT2 avec un marqueur de la membrane nucléaire (Nup 62), par rapport aux marqueurs de la membrane plasmique (Calpactin I), de l’appareil de Golgi (GRP 78) ou du réticulum endoplasmique (GM130). La microscopie confocale a permis de démontrer la présence des AT1 et AT2 dans les membranes nucléaires. La microinjection de l’Ang-II-FITC sur des cardiomyocytes a provoqué une liaison de préférence aux sites nucléaires. Les enregistrements de transients calciques ont illustré que les AT1 nucléaires régulent le relâchement du Ca2+. L’incubation des ligands spécifiques d’AT1 et d’AT2 avec l’UTP [α32P] a résulté en une synthèse de novo d’ARN (par exemple, 16,9 ± 0,5 cpm/ng ADN contrôle vs 162,4 ± 29,7 cpm/ng ADN-Ang II, 219,4 ± 8,2 cpm/ng ADN L -162313 (AT1) et 126,5 ± 8,7 cpm/ng ADN CGP42112A (AT2), P <0,001). L’incubation des noyaux avec Ang-II augmente de façon significative l’expression de NFκB, une réponse qui est réprimée partiellement par la co-administration de valsartan ou de PD123177. Les expériences dose-réponse avec Ang-II administrée à l'ensemble des noyaux purifiés vs. aux cardiomyocytes seuls a montré une augmentation plus importante dans les niveaux d'ARNm de NFκB avec une affinité de ~ 3 fois plus grande (valeurs d’EC50 = 9 contre 28 pmol/L, respectivement), suggérant un rôle préférentiel nucléaire dans la signalisation. Par conséquent, nous avons conclu que les membranes cardiaques nucléaires possèdent des récepteurs d’Ang-II couplés à des voies de signalisation et à la transcription génique. La signalisation nucléaire pourrait jouer un rôle clé dans les changements de l'expression de gènes cardiaques, entraînant ainsi des implications mécanistiques et thérapeutiques diverses. / Angiotensin-II (Ang-II) from extracardiac sources and intracardiac synthesis regulates cardiac homeostasis, with mitogenic and growth-promoting effects largely due to altered gene-expression. In this study, the possibility that angiotensin-1 (AT1R) or angiotensin-2 (AT2R) receptors are located on the nuclear envelope and mediate effects on cardiomyocyte gene expression was assessed. Western blot tests of nucleus-enriched rat heart fractions indicated the presence of AT1R and AT2R proteins that preferentially copurified with a nuclear membrane marker (Nup 62) but not markers of plasma (Calpactin I), Golgi apparatus (GRP 78) or endoplasmic reticulum (GM130) membranes. Confocal microscopy revealed the existence of AT1R and AT2R proteins on nuclear membranes. Microinjected Ang-II preferentially bound to nuclear sites of isolated cardiomyocytes. Ca2+i-recordings on nuclear preparations demonstrated an AT1R-mediated Ca2+ release. AT1R and AT2R ligands enhanced de novo RNA synthesis in isolated cardiomyocyte nuclei incubated with [α32P]UTP (e.g. 16.9 ± 0.5 cpm/ng for DNA control vs. 162.4 ± 29.7 cpm/ng for DNA Ang-II, 219.4 ± 8.2 cpm/ng for DNA L-162313 (AT1) and 126.5 ± 8.7 cpm/ng for DNA CGP42112A (AT2), P<0.001). Ang-II application to isolated cardiomyocyte nuclei enhanced NFκB mRNA-expression, a response that was suppressed by co-administration of valsartan or PD123177. Dose-response experiments with Ang-II applied to purified nuclei vs. to whole cardiomyocytes showed a greater increase in NFκB mRNA levels at saturating concentrations with ~3 fold greater affinity (EC50 values 9 vs. 28 pmol/L, respectively), suggesting preferential nuclear signaling. These results lead us to conclude that cardiac nuclear membranes possess angiotensin receptors that couple to nuclear signaling pathways and regulate transcription. Signaling within the nuclear envelope (e.g. from intracellularly synthesized Ang-II) may play a role in Ang-II-mediated changes in cardiac gene-expression, with potentially important mechanistic and therapeutic implications.

Les facteurs de transcription sont des protéines spécialisées qui jouent un rôle important dans différents processus biologiques tel que la différenciation, le cycle cellulaire et la tumorigenèse. Ils régulent la transcription des gènes en se fixant sur des séquences d’ADN spécifiques (éléments cis-régulateurs). L’identification de ces éléments est une étape cruciale dans la compréhension des réseaux de régulation des gènes. Avec l’avènement des technologies de séquençage à haut débit, l’identification de tout les éléments fonctionnels dans les génomes, incluant gènes et éléments cis-régulateurs a connu une avancée considérable. Alors qu’on est arrivé à estimer le nombre de gènes chez différentes espèces, l’information sur les éléments qui contrôlent et orchestrent la régulation de ces gènes est encore mal définie. Grace aux techniques de ChIP-chip et de ChIP-séquençage il est possible d’identifier toutes les régions du génome qui sont liées par un facteur de transcription d’intérêt. Plusieurs approches computationnelles ont été développées pour prédire les sites fixés par les facteurs de transcription. Ces approches sont classées en deux catégories principales: les algorithmes énumératifs et probabilistes. Toutefois, plusieurs études ont montré que ces approches génèrent des taux élevés de faux négatifs et de faux positifs ce qui rend difficile l’interprétation des résultats et par conséquent leur validation expérimentale. Dans cette thèse, nous avons ciblé deux objectifs. Le premier objectif a été de développer une nouvelle approche pour la découverte des sites de fixation des facteurs de transcription à l’ADN (SAMD-ChIP) adaptée aux données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. Notre approche implémente un algorithme hybride qui combine les deux stratégies énumérative et probabiliste, afin d’exploiter les performances de chacune d’entre elles. Notre approche a montré ses performances, comparée aux outils de découvertes de motifs existants sur des jeux de données simulées et des jeux de données de ChIP-chip et de ChIP-séquençage. SAMD-ChIP présente aussi l’avantage d’exploiter les propriétés de distributions des sites liés par les facteurs de transcription autour du centre des régions liées afin de limiter la prédiction aux motifs qui sont enrichis dans une fenêtre de longueur fixe autour du centre de ces régions. Les facteurs de transcription agissent rarement seuls. Ils forment souvent des complexes pour interagir avec l’ADN pour réguler leurs gènes cibles. Ces interactions impliquent des facteurs de transcription dont les sites de fixation à l’ADN sont localisés proches les uns des autres ou bien médier par des boucles de chromatine. Notre deuxième objectif a été d’exploiter la proximité spatiale des sites liés par les facteurs de transcription dans les régions de ChIP-chip et de ChIP-séquençage pour développer une approche pour la prédiction des motifs composites (motifs composés par deux sites et séparés par un espacement de taille fixe). Nous avons testé ce module pour prédire la co-localisation entre les deux demi-sites ERE qui forment le site ERE, lié par le récepteur des œstrogènes ERα. Ce module a été incorporé à notre outil de découverte de motifs SAMD-ChIP. / Transcription factors (TF) play important roles in various biological processes such as differentiation, cell cycle progression and tumorigenesis. They regulate gene expression by binding to specific DNA sequences (TFBS). Identifying these cis-regulatory elements is a crucial step to understand gene regulatory networks. Technological developments have enhanced DNA sequencing at genomic scale. On the basis of the resulting sequences, computational biologists now attempt to localize the most important functional regions, starting with genes, but also importantly the whole genome characterization of transcription factor binding sites and allow the development of several computational DNA motif discovery tools. Although these various tools are widely used and have been successful at discovering novel motifs, they are not adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The main drawback of these approaches is that most of the predicted motifs represent artifacts due to an inefficient assessment of their enrichment. This thesis is about transcription factor proteins and statistical analysis of their binding sites in ChIP-chip and ChIP-sequencing data. The first objective was to develop a new do novo DNA motif discovery tool adapted to ChIP-chip and ChIP-sequencing data. SAMD-ChIP combines enumerative and stochastic strategies to predict enriched motifs in the vicinity of the ChIP peak summits. Our approach is an automated pipeline that includes motif discovery, motif clustering, motif optimization and finally motif identification using transcription factor (TF) databases. SAMD-ChIP outperforms state-of-the-art motif discovery tools in term of the number of predicted motifs and the prediction of rare and degenerate motifs. In particular, SAMD-ChIP efficiently identifies gapped motifs such as inverted or direct repeats bound by nuclear receptors and composite motifs resulting from the association of different single TF binding sites. The underlying assumption of the second objective is that in regulatory regions, binding sites of interacting transcription factors co-occur more often than expected by chance in the vicinity of the ChIP-peak summits. We proposed an approach to predict transcription factor binding sites co-localization based on the prediction of single motifs by do novo motif discovery tools or by using TFBS models from TF data bases.

De nombreux systèmes biologiques présentent une organisation complexe. Par exemple, les biopolymères peuvent posséder une structure très hiérarchisée responsable de leur fonction particulière. Comprendre la complexité de cette organisation permet de décrire des phénomènes biologiques et de prédire les fonctions des molécules. En outre, en supposant que la structure primaire du polymère est formée aléatoirement, nous pouvons essayer de caractériser ce phénomène par des grandeurs probabilistes (variances, moyennes, etc). Cette formulation est propre aux problèmes d'évolution.Les réseaux biologiques sont d'autres objets communs de la physique statistique possédant de riches propriétés fonctionnelles. Pour décrire un mécanisme biologique, on utilise différents types de réseaux biomoléculaires. Le développement de nouvelles approches peut nous aider à structurer, représenter et interpréter des données expérimentales, comprendre les processus cellulaires et prédire la fonction d'une molécule.L'objectif de cette thèse est de développer des méthodes pour l'étude d'objets statiques ou dynamiques, ayant une architecture complexe. Ici, nous nous intéressons à deux problèmes.La première partie est consacrée à l'analyse statistique des biopolymères aléatoires. Nous étudions une transition de phase présente dans les séquences aléatoires de l'ARN. On met alors en évidence deux modes : le régime où presque toutes les bases qui composent l'ARN sont couplées et la situation où une fraction finie de ces bases restent non complémentaires.La deuxième partie de cette thèse se concentre sur les propriétés statistiques des réseaux. Nous développons des méthodes pour l'identification d'amas de gènes co-expressifs sur les réseaux et la prédiction de gènes régulateurs novateurs. Pour cela, nous utilisons la fonction du plus court chemin et l'analyse du profil des motifs formés par ces amas. Ces méthodes ont pu prédire les facteurs de transcription impliqués dans le processus de longévité. Enfin, nous discutons de la formation de motifs stables sur les réseaux due à une évolution sélective. / Complex organization is found in many biological systems. For example, biopolymers could possess very hierarchic structure, which provides their functional peculiarity. Understating such, complex organization allows describing biological phenomena and predicting molecule functions. Besides, we can try to characterize the specific phenomenon by some probabilistic quantities (variances, means, etc), assuming the primary biopolymer structure to be randomly formed according to some statistical distribution. Such a formulation is oriented toward evolutionary problems.Artificially constructed biological network is another common object of statistical physics with rich functional properties. A behavior of cells is a consequence of complex interactions between its numerous components, such as DNA, RNA, proteins and small molecules. Cells use signaling pathways and regulatory mechanisms to coordinate multiple processes, allowing them to respond and to adapt to changing environment. Recent theoretical advances allow us to describe cellular network structure using graph concepts to reveal the principal organizational features shared with numerous non-biological networks.The aim of this thesis is to develop bunch of methods for studying statistical and dynamic objects of complex architecture and, in particular, scale-free structures, which have no characteristic spatial and/or time scale. For such systems, the use of standard mathematical methods, relying on the average behavior of the whole system, is often incorrect or useless, while a detailed many-body description is almost hopeless because of the combinatorial complexity of the problem. Here we focus on two problems.The first part addresses to statistical analysis of random biopolymers. Apart from the evolutionary context, our studies cover more general problems of planar topology appeared in description of various systems, ranging from gauge theory to biophysics. We investigate analytically and numerically a phase transition of a generic planar matching problem, from the regime, where almost all the vertices are paired, to the situation, where a finite fraction of them remains unmatched.The second part of this work focus on statistical properties of networks. We demonstrate the possibility to define co-expression gene clusters within a network context from their specific motif distribution signatures. We also show how a method based on the shortest path function (SPF) can be applied to gene interactions sub-networks of co-expression gene clusters, to efficiently predict novel regulatory transcription factors (TFs). The biological significance of this method by applying it on groups of genes with a shared regulatory locus, found by genetic genomics, is presented. Finally, we discuss formation of stable patters of motifs in networks under selective evolution in context of creation of islands of "superfamilies".