No / We have investigated the surface localisation of the phosphotransferase system protein HPr in the equine pathogen Streptococcus equi subsp. equi using immunogold localisation and transmission electron microscopy. Like the LppC acid phosphatase lipoprotein, a reference surface antigen, the S. equi HPR could be clearly detected on the surfaces of intact cells. This study is consistent with previous reports that some streptococcal HPr is cell surface associated and suggests that the extracytoplasmic mobilisation and transfer of phosphate groups by streptococci warrant further investigation.

Universiẗat, Diss., 2003--Stuttgart.

Bakterien wie Escherichia coli sind immer wieder wechselnden Umweltbedingungen und Nährstoffen ausgesetzt. Aus diesem Grund zeigen sie eine starke Regulation des Kohlenstoff-Metabolismus, um stets die am besten geeignete Nährstoffquelle nutzen zu können. Das Glukose-Phosphotransferase-System (PTS) stellt in E.coli das Hauptaufnahmesystem für Glukose dar und unterliegt damit einer besonderen Regulation. Die Untersuchung der Regulation des Glukose-PTS durch das kleine regulatorische Peptid SgrT war ein Hauptaspekt in dieser Arbeit. Das so genannte SgrRST-System wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen als verantwortlich für die Regulation der Expression und Aktivität des Glukose-Transportproteins EIICBGlc (Gen ptsG) unter Glukose-6-Phosphatstress identifiziert. Sie konnten einen durch SgrR aktivierten und durch sgrS (sRNA) vermittelten spezifischen Abbau der ptsG-mRNA zeigen und zudem das von sgrS kodierte Protein SgrT nachweisen (Wadler und Vanderpool, 2007). Dabei waren der Mechanismus und die Funktion von SgrT bei der Regulation des Glukose-PTS bislang unklar. In dieser Arbeit konnte zum ersten Mal eine direkte Protein-Protein-Wechselwirkung zwischen SgrT und dem Membranprotein EIICBGlc durch in vitro- und in vivo-Methoden nachgewiesen werden. Dabei wurde nicht nur der Nachweis einer Wechselwirkung erbracht, sondern es konnte auch auf Seiten des EIICBGlc eine für die Interaktion der beiden Proteine essentielle Region identifiziert werden. Im hoch konservierten KTPGRED-Motiv des Linkers, welcher die membranständige EIICGlc- und die cytoplasmatische EIIBGlc-Domäne flexibel miteinander verbindet, wurden die Aminosäuren T383, P384, G385, R386 und E387 als Interaktionspartner für SgrT nachgewiesen. Damit wurde der in allen Enterobakterien vorkommenden Sequenz des Linkers in den Glukose- und N-Acetyl-Glukosamin-spezifischen Transportproteinen zum ersten Mal eine Funktion zugewiesen. Zudem wurde ein Modell entwickelt, welches die Funktionsweise von SgrT verdeutlicht. Durch die Bindung des Linkers und die damit verbundene Verhinderung der zum Glukose-Transport notwendigen Konformationsänderung des EIICBGlc, setzt SgrT die Transportaktivität des Membranproteins unter Glukose-6-Phosphatstress drastisch herab. Im Rahmen des FORSYS-Partner Projektes wurde zudem die Auswirkung des SgrRST-Systems auf die Aufrechterhaltung der metabolischen Balance von E.coli in Fermentationsversuchen untersucht. Ein zweites Projekt dieser Arbeit befasste sich mit der Auswirkung der Expression eines chromosomal kodierten EIICBGlc-His auf das Wachstum verschiedener Stämme. Es konnte erfolgreich ein Stamm mit einem ptsGHis-Gen im Chromosom konstruiert und in verschiedenen Versuchen auf z.B. Transportaktivität und Wachstum getestet werden. Des Weiteren wurde ein Stamm mit einem chromosomal kodierten EIICBGlc-His unter der Kontrolle des tacPO kloniert. Durch gezielte IPTG-Zugabe ist das Expressionslevel einstellbar und könnte so in verschiedenen Versuchsansätzen zur Analyse der Auswirkung auf den Metabolismus der Zelle dienen. Auf Grund einer geringen Transportaktivität dieses Stammes wurde eine Suppressionsmutante isoliert, welche einen verstärkten Transport zeigt, bei der sich jedoch das Expressionslevel des EIICBGlc-His nicht mehr vollständig herabsetzen lässt. Eine Optimierung beider Stämme ist demnach erforderlich.

No / We have investigated the surface localisation of the phosphotransferase system protein HPr in the equine pathogen Streptococcus equi subsp. equi using immunogold localisation and transmission electron microscopy. Like the LppC acid phosphatase lipoprotein, a reference surface antigen, the S. equi HPR could be clearly detected on the surfaces of intact cells. This study is consistent with previous reports that some streptococcal HPr is cell surface associated and suggests that the extracytoplasmic mobilisation and transfer of phosphate groups by streptococci warrant further investigation.

Aminoglycoside antibiotics are losing their bactericidal efficacy due to the spread of enzymes that catalyze a covalent modification to them. A common property of many of these aminoglycoside modifying enzymes (AGMEs) is the capacity to modify multiple diverse aminoglycosides thus conferring resistance to these drugs among several pathogenic bacterial species. To gain a better understanding of the protein-antibiotic interactions responsible for resistance and the promiscuous nature of AGMEs, a variety of biophysical techniques including nuclear magnetic resonance (NMR), isothermal titration calorimetry (ITC), steady state kinetics, intrinsic tryptophan fluorescence, and computational modeling are employed in this work. Results and discussion presented herein are divided into two parts. In Part I, a detailed thermodynamic and kinetic characterization of the association between the aminoglycoside acetyltransferase-(3)-IIIb (AAC) and several antibiotics and/or coenzyme(s) provides insight into the global properties of the protein. AAC is shown to have a broad substrate range where antibiotic interaction occurs with a favorable enthalpy and unfavorable entropy. When coenzyme A (the non-catalytic form of the acetyl donor, acetyl coenzyme A) is present, enthalpy becomes more favored, entropy more disfavored, and antibiotic affinity significantly increases. AAC shows preference for antibiotics with amine groups at the 2′ and 6′ positions and to those possessing four or more pseudo-saccharide rings. These and other data lay the foundation for understanding AAC and lead into the next discussion wherein the source of promiscuity of AGMEs is explored in Part II. The aminoglycoside phosphotransferase-(3′)-IIIa (APH), a representative from the phosphotransferase family of AGMEs, has been well characterized previously. However, none of the data presented to date provides rationale for its promiscuity. In this work, NMR derived hydrogen-deuterium exchange experiments reveal that APH maneuvers its entire structure to accommodate diverse antibiotics. Furthermore, presence of an antibiotic creates a more stable APH conformation while coenzyme induces an antibiotic dependent increase in the flexibility of APH. For comparison, a computationally derived homology model of AAC predicts that its promiscuous nature may be due to a large flexible loop. Taken together, APH and AAC, two structurally and functionally diverse proteins, utilize different aspects of structural flexibility to facilitate a broad substrate repertoire that is key to bacterial survival.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1997. / Vita. Includes bibliographical references (leaves [176]-179).

Universiẗat, Diss.--Osnabrück, 1994.

Listeria monocytogenes est une bactérie à Gram+, ubiquiste, pathogène intracellulaire d’origine alimentaire, responsable chez l’homme, de nombreuses infections telles que les infections foeto-maternelles, des méningo-encéphalites et des septicémies. La bactérie utilise préférentiellement le glucose qui est transporté via le système phosphoenolpyruvate:sucre phsosphotransferase (PTS) et des perméases non-PTS. Les deux principaux transporteurs de glucose chez L. monocytogenes seraient des PTS de la classe mannose. Le premier est codé par l’opéron manLMN (man) et le deuxième, par l’opéron mpoABCD (mpo). Nous avons, dans un premier temps, mis en évidence le transport de glucose par ces PTS chez L. monocytogenes et aussi identifier d’autres transporteurs non-PTS de glucose. Des tests de croissance en milieu minimum (MM) additionné de glucose et des tests de consommation de glucose ont permis de montrer que les mutants ΔmanL (manL code pour l’EIIABMan) et ΔmanM (manM code pour l’EIICMan) utilisent moins vite le glucose que la souche sauvage AML73 ou EGDe (3 à 4 fois moins vite). Le mutant ΔmpoA (mpoA code pour l’EIIAMpo) montre un phénotype similaire à la souche sauvage tandis que le mutant ΔmpoB (mpoB code pour l’EIIBMpo) utilise 4 à 5 fois moins vite le glucose que la souche sauvage. Des tests de qRT-PCR ont par ailleurs permis de montrer que la délétion du gène mpoA permet une expression constitutive de l’opéron man tandis que la délétion du gène mpoB entraîne une inhibition de l’expression de cet opéron. Nous avons aussi montré que l’opéron man est induit par le glucose et l’opéron mpo est exprimé constitutivement. Le PTSMan est le principal système de transport de glucose chez L. monocytogenes et le PTSMpo pourrait fonctionner comme un senseur de glucose qui en présence de ce sucre stimule l’expression de l’opéron man en régulant l’activité de ManR. Le mutant ΔptsI (ptsI code pour la protéine générale EI du PTS) utilise 8 à 10 fois moins vite le glucose que la souche sauvage et présente une très faible expression de l’opéron man. L’utilisation du glucose (bien que faible) par le mutant ΔptsI permet d’affirmer qu’il existerait des transporteurs non-PTS qui permettraient à ce mutant d’utiliser le glucose. Des tests de complémentation hétérologue dans la souche E. coli LJ140 (incapable de transporter le glucose) ont permis de montrer que les trois protéines GlcU (GlcU1, GlcU2 et GlcU3, identifiées par homologie de séquences aux GlcU d’autres firmicutes) permettent le transport de glucose chez L. monocytogenes mais avec une très faible affinité. Un rôle potentiel du PTS et des transporteurs non-PTS dans la régulation de PrfA a également été mis en évidence par des tests de dosage β-D-glucuronidase à partir de cultures bactériennes réalisées en milieux liquides ou sur géloses et aussi par des tests de qRT-PCR (pour l’expression des gènes actA et hly). Ces tests ont été réalisés à partir de la souche L. monocytogenes AML73 (portant la fusion Phly-gus) et des mutants ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI et glcU (construits dans cette souche). Les mutations manL, manM, mpoB, ptsI entraînent une augmentation de l’activité de PrfA (de 2 à 14 fois) et une augmentation de l’expression des gènes de virulence PrfA-dépendants (hly et actA) est également observée dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations glcU et mpoA ne montrent aucun effet sur l’activité de PrfA. Les mutants montrant une forte activité de PrfA contiennent peu ou pas de protéine EIIABMan qui est supposée jouer un rôle dans la régulation de l’activité de PrfA par le glucose. L’effet des mutations PTS observé sur l’expression des gènes de virulence dépend de PrfA car cet effet disparaît quand le gène prfA est délété dans les mutants ΔmanL, ΔmanM et ΔmpoB. Les mutations montrant un effet sur l’activité de PrfA ont également été étudiées in vitro par des infections des cellules épithéliales (Caco-2 et Jeg-3) avec les différents mutants et également in vivo dans la souris. La délétion du gène ptsI montre un effet dans l’infection plus particulièrement dans l’entrée des bactéries dans les cellules / L. monocytogenes is a ubiquitous foodborne pathogenic Gram-positive bacterium, which can multiply in host cells and infect humans causing septicemia, spontaneous abortion and méningoencephalitis. This bacterium transports glucose via phosphoenolpyruvate:sugar phosphotransferase systems (PTS) and non-PTS permeases. Two major glucose-transporting PTSs belong to the mannose class. One is encoded by the manLMN (man) operon and the second by the mpoABCD (mpo) operon. One goal was to study the transport of glucose by the proteins encoded by these operons and to identify non-PTS glucose transporters. Growth studies in MM supplemented with glucose and glucose consumption assays with several mutants revealed that deletion of manL (encodes EIIABMan) or manM (encodes EIICMan) significantly slowed glucose utilization (3- to 4-fold) compared to the WT AML73 or EGDe strain. Deletion of mpoA (encodes EIIAMpo) had no significant effect on glucose utilization (same phenotype as the WT) whereas deletion of mpoB (encodes EIIBMpo) significantly slowed glucose utilization (4- to -5 fold). By using qRT-PCR, we show that expression of the man operon is induced by glucose, whereas the mpo operon is expressed constitutively. Nevertheless, deletion of mpoA causes constitutive man operon expression whereas deletion of mpoB inhibits it. The PTSMpo therefore functions as a constantly synthesized glucose sensor regulating man operon expression. Deletion of ptsI (encodes the general PTS component EI) also inhibits man expression and the ΔptsI mutant was most strongly impeded in glucose utilization. The residual glucose uptake probably owes to three GlcU-like non-PTS transporters. The successful heterelogous complementation of the E. coli LJ140 strain, wich is unable to transport glucose, suggests that the L. monocytogenes GlcU proteins, GlcU1, GlcU2 and GlcU3 (identified by sequences homology to GlcU proteins in other firmicutes) are indeed capable of transporting glucose.A potential role of PTS and non-PTS components in PrfA regulation was studied in the L. monocytogenes AML73 strain (contains a Phly-gus fusion) and in the ΔmanL, ΔmanM, ΔmpoB, ΔmpoA, ΔptsI, glcU mutants derived from it. For that purpose, I carried out β-D-glucuronidase activity tests with bacteria grown either in liquid or on solid medium and qRT-PCR experiments (expression of actA and hly genes). Interestingly, deletion of ptsI, manL, manM and mpoB caused elevated PrfA activity (2- to -14 fold) and elevated expression of virulence gene expression (actA and hly) in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants was observed. Nevertheless, glcU inactivation and mpoA deletion had no effect on PrfA activity. The elevated PrfA activity disappeared when the prfA gene was also deleted in the ΔmanL, ΔmanM and ΔmpoB mutants, confirming that the stimulatory effect of the various mutations on virulence gene expression is PrfA-dependent. All mutants exhibiting elevated virulence gene expression contain no or only little unphosphorylated EIIABMan, which we therefore suspect to play a major role in glucose-mediated PrfA inhibition. The effect of the PTS mutations was also tested in in vitro host cells infection assays (Caco-2, Jeg-3 cells) and in an in vivo mouse model. Deletion of ptsI led to elevated infection of the host cells, which probably owes to the elevated synthesis of the InlA protein.

Arginine kinase catalyzes the reversible phosphorylation of arginine using ATP. This phosphotransferase is found throughout invertebrate species; whereas a homologous enzyme, creatine kinase, is found in both vertebrate and invertebrate species. Arginine kinases are found as monomers of 40 kDa or 80 kDa and dimers of 80 kDa while creatine kinases are found as dimers of 80 kDa, monomers of 150 kDa, or octamers of 320 kDa. The significance or advantage of the dimeric state or various quaternary structures is still not understood for this family of enzymes. Here, arginine kinase from Isostychopus badonotus muscle was purified to homogeneity and analyzed for physical, kinetic, and immunological characteristics. The results indicate that arginine kinase from the sea cucumber, I. badonotus, is a dimer with a molecular weight of 87 kDa that displays physical and kinetic characteristics similar to other arginine kinases regardless of their weight or subunit composition. However, immunological cross-reactivity using I. badonotus polyclonal antibodies shows that dimeric arginine kinase from the sea cucumber can react with dimeric arginine and creatine kinases but not with monomeric arginine or creatine kinases. Comparable results are seen with polyclonal antibodies raised against purified monomeric arginine kinase from the American cockroach, Periplaneta americana. Monomeric arginine kinase from the cockroach reacted with monomeric arginine kinases but not with dimeric arginine or creatine kinases or monomeric creatine kinases. Arginine kinase from the sea cucumber and the cockroach is substantially inhibited by the anion nitrate which mimics the transferable phosphoryl group in the assumed rapid equilibrium, random addition reaction. Here, nitrate has been shown to inhibit both the initial velocity and percent of product formed from arginine kinase in I. badonotus and P. americana. Difference spectra for each enzyme in the presence of varying components of the transition state analog suggest that nitrate has an effect on the enzyme itself and inhibits through a mechanism beyond that of stabilization of the dead-end complex. Further characterization of the dimeric state in these enzymes on a structural level included the elucidation of the protein sequence from the American cockroach and a comparison with dimeric arginine and creatine kinases.

Im Rahmen der Arbeit Molekularbiologische Charakterisierung des Glukose Phosphotransferase System Regulators MtfA aus Escherichia coli wurde das als Mlc titration factor A charakterisierte Protein MtfA auf genetischer, biochemischer und physiologischer Ebene näher charakterisiert. Mit Hilfe von gezielten Austauschen konservierter Aminosäuren konnte im aminoterminalen Bereich eine leuzinreiche Dimerisierungsdomäne und im carboxyterminalen Bereich eine Mlc Wechselwirkungsdomäne identifiziert werden. Letzteres konnte mit Hilfe von Di-Hybrid Studien unabhängig bestätigt werden. Die EIIBGlc Domäne des Glukosetransporters vermag Mlc zu binden. Durch die Membranassoziation des Transporters kann Mlc von seiner Operatorsequenz durch Titration entfernt werden. Lösliches EIIBGlc bindet ebenfalls an Mlc. Es löst aber keine Inaktivierung des Repressors aus. MtfA dagegen liegt cytoplasmatisch vor und inaktiviert Mlc vermutlich über die Inhibierung seiner Tetramerisierung. Eine parallele Expression von MtfA und EIIBGlc zeigte einen inhibitorischen Einfluss von EIIBGlc auf die Wechselwirkung von MtfA und Mlc. Physiologische Untersuchungen von MtfA weisen auf einen Einfluss des Proteins auf das Chemotaxisverhalten von E.coli hin. Darüber hinaus konnte ein relativ schwacher mtfA-Promotor nachgewiesen werden. Im Rahmen von Wachstumskompetitionsversuchen wurde ein Wachstumsvorteil des MtfA Wildtyps im Vergleich zur Mutante beim Wachstum auf Glukose und bei 42°C beobachtet. Außerdem stellte sich bei diesen Versuchen ein Unterschied in der Regulation von MtfA in den Stämmen K-12 und LJ110 heraus. Dieser konnte im Rahmen von RT-RT PCR Studien sowie mittels Western-Blot Analysen bestätigt werden. Die erfolgreiche Reinigung des Proteins ermöglichte den Nachweis der Dimerisierung in verschiedenen biochemischen Analysen, sowie die Herstellung spezifischer Antikörper.