Este estudo teve por objetivos (1) estudar os efeitos de diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de células planctônicas e biofilme de S. mutans UA159, (2) verificar a viabilidade de uso de um modelo para crescimento de biofilme bacteriano no estudo do processo de desmineralização, (3) avaliar a capacidade da terapia fotodinâmica em controlar o processo de desmineralização mediado por biofilme de S. mutans crescidos sobre discos de dentina bovina e (4) mensurar a capacidade da terapia fotodinâmica em promover estresse celular a S. mutans UA159 com deleção do gene VicK. Os procedimentos de terapia fotodinâmica foram realizados pela associação do fotossensibilizador Photogem® e de um LED vermelho visível (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) como fonte de luz. A viabilidade de células bacterianas foi determinada por dois métodos distintos: teste de atividade metabólica pelo uso da resazurina (etapa 1) e contagem de UFC (etapas 1,2 e 3). Microrradiografia transversal e análise da concentração de cálcio por espectrometria de absorção atômica foram os métodos de escolha para a determinação do perfil do conteúdo mineral (%vol), perda mineral integrada (PMI, %vol x m), profundidade de lesão (PL, m) e concentração de cálcio liberado em meio de cultura (mg/dL). A intensidade de fluorescência emitida pela modulação da proteína GFP após ensaio de estresse celular foi determinada por citometria de fluxo. Os diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica foram capazes de reduzir a viabilidade de células planctônicas de S. mutans, bem como das células organizadas em biofilme (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05), sendo o resultado dose-dependente. Quando Photogem® a 0,25 mg/mL foi associado ao LED a 150 J/cm2, uma redução de aproximadamente 3,9 log10 na contagem de células viáveis provenientes de biofilme foi observada. O modelo para crescimento de biofilme permitu a progressão do processo de desmineralização (24 h PMI: 1905±391 vol% x m, PL: 69,9±12,2 m; 48 h - PMI: 3529±886 vol% x m, PL: 114,2±24,6 m; 72 h - PMI: 4186±1099 vol% x m, PL: 146,1±20,1 m) em função do tempo. As associações de Photogem® 0,25 mg/mL + LED 75 J/cm2 e Photogem® 0,25 mg/mL + LED 150 J/cm2 foram capazes de controlar por 24 h a perda mineral integrada, a profundidade de lesão e a concentração de cálcio liberada em relação ao grupo controle (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Os diferentes tipos de tratamento utilizados no ensaio de estresse celular (H2O2 a 0,0025%, H2O2 a 0,005%, Photogem® a 0,00625%, Photogem® a 0,0125%, LED 4,5 J/cm2, Photogem® a 0,00625% + LED 4,5 J/cm2 e Photogem® a 0,0125% + LED 4,5 J/cm2) produziram aumento significativo da fluorescência captada pela citometria de fluxo em relação ao grupo controle (água deionizada) (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Entretanto, diferenças significativas não foram notadas entre os grupos de tratamento. Portanto, a terapia fotodinâmica foi capaz de reduzir a viabilidade de células planctônicas e células organizadas em biofilme (S. mutans UA159), bem como controlar o processo de desmineralização mediado por bactéria durante 24 h. Além disso, pelo modelo utilizado, a terapia fotodinâmica pode ser capaz de modular estresse celular comparável àquele obtido com a utilização do peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. / The present study aimed (1) to assess the effects of different parameters of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) on the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, (2) to test the effectiveness of a biofilm model in evaluating the demineralization process, (3) to assess the influence of PACT on the control of demineralization process mediated by S. mutans biofilm growth on dentin discs, and (4) to measure the ability of PACT in promoting cellular stress on S. mutans UA159 knockout vicK gene. PACT procedures were performed by association between a photosensitizer (Photogem®) and a visible red LED (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) as light source. Viability of bacterial cells was determined by two distinct methods: resazurin assay (phase 1) and Colony Forming Unit (CFU) counts (phases 1, 2, and 3). Transversal microradiography and calcium release analysis by atomic absorption spectrometry were chosen to analyze mineral content profile (%vol), integrated mineral loss (IML, %vol x m), lesion depth (LD, m), and concentration of calcium release in culture media (mg/dL). Fluorescence intensity levels, which were modulated by expression of Green Fluorescent Protein-reporter (GFP) after cellular stress, were measured by flow cytometer. A dose-dependent effect on the reduction of viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans was observed after application of different parameters of PACT (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED decreased in nearly 3.9 log10 the viability of S. mutans biofilm. Progression of demineralization process was correlated with the time (24 h IML: 1905±391 vol% x m, LD: 69.9±12,2 m; 48 h - IML: 3529±886 vol% x m, LD: 114.2±24.6 m; 72 h - IML: 4186±1099 vol% x m, LD: 146.1±20.1 m). Integrated mineral loss, lesion depth and concentration of calcium release were controlled for 24 h by the following associations: 0.25 mg/mL Photogem® plus 75 J/cm2 LED, and 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED, in comparison to control group (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). Different treatments (0.0025% H2O2, 0.005% H2O2, 0.00625% Photogem®, 0.0125% Photogem®, 4.5 J/cm2 LED, 0.00625% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED, and 0.0125% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED) increased significantly the fluorescence levels emitted by S. mutans, when compared with levels of the control group (demi water) (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). However, significant statistical differences were not observed among treatment groups. Therefore, PACT was able to decrease the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, as well as controlling the demineralization process mediated by bacteria for 24 h. Moreover, according to present methods, PACT may modulate cellular stress similar to hydrogen peroxide.

Este estudo teve por objetivos (1) estudar os efeitos de diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica sobre a viabilidade de células planctônicas e biofilme de S. mutans UA159, (2) verificar a viabilidade de uso de um modelo para crescimento de biofilme bacteriano no estudo do processo de desmineralização, (3) avaliar a capacidade da terapia fotodinâmica em controlar o processo de desmineralização mediado por biofilme de S. mutans crescidos sobre discos de dentina bovina e (4) mensurar a capacidade da terapia fotodinâmica em promover estresse celular a S. mutans UA159 com deleção do gene VicK. Os procedimentos de terapia fotodinâmica foram realizados pela associação do fotossensibilizador Photogem® e de um LED vermelho visível (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) como fonte de luz. A viabilidade de células bacterianas foi determinada por dois métodos distintos: teste de atividade metabólica pelo uso da resazurina (etapa 1) e contagem de UFC (etapas 1,2 e 3). Microrradiografia transversal e análise da concentração de cálcio por espectrometria de absorção atômica foram os métodos de escolha para a determinação do perfil do conteúdo mineral (%vol), perda mineral integrada (PMI, %vol x m), profundidade de lesão (PL, m) e concentração de cálcio liberado em meio de cultura (mg/dL). A intensidade de fluorescência emitida pela modulação da proteína GFP após ensaio de estresse celular foi determinada por citometria de fluxo. Os diferentes parâmetros de terapia fotodinâmica foram capazes de reduzir a viabilidade de células planctônicas de S. mutans, bem como das células organizadas em biofilme (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05), sendo o resultado dose-dependente. Quando Photogem® a 0,25 mg/mL foi associado ao LED a 150 J/cm2, uma redução de aproximadamente 3,9 log10 na contagem de células viáveis provenientes de biofilme foi observada. O modelo para crescimento de biofilme permitu a progressão do processo de desmineralização (24 h PMI: 1905±391 vol% x m, PL: 69,9±12,2 m; 48 h - PMI: 3529±886 vol% x m, PL: 114,2±24,6 m; 72 h - PMI: 4186±1099 vol% x m, PL: 146,1±20,1 m) em função do tempo. As associações de Photogem® 0,25 mg/mL + LED 75 J/cm2 e Photogem® 0,25 mg/mL + LED 150 J/cm2 foram capazes de controlar por 24 h a perda mineral integrada, a profundidade de lesão e a concentração de cálcio liberada em relação ao grupo controle (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Os diferentes tipos de tratamento utilizados no ensaio de estresse celular (H2O2 a 0,0025%, H2O2 a 0,005%, Photogem® a 0,00625%, Photogem® a 0,0125%, LED 4,5 J/cm2, Photogem® a 0,00625% + LED 4,5 J/cm2 e Photogem® a 0,0125% + LED 4,5 J/cm2) produziram aumento significativo da fluorescência captada pela citometria de fluxo em relação ao grupo controle (água deionizada) (ANOVA a um critério, Games-Howell, p<0,05). Entretanto, diferenças significativas não foram notadas entre os grupos de tratamento. Portanto, a terapia fotodinâmica foi capaz de reduzir a viabilidade de células planctônicas e células organizadas em biofilme (S. mutans UA159), bem como controlar o processo de desmineralização mediado por bactéria durante 24 h. Além disso, pelo modelo utilizado, a terapia fotodinâmica pode ser capaz de modular estresse celular comparável àquele obtido com a utilização do peróxido de hidrogênio em diferentes concentrações. / The present study aimed (1) to assess the effects of different parameters of Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) on the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, (2) to test the effectiveness of a biofilm model in evaluating the demineralization process, (3) to assess the influence of PACT on the control of demineralization process mediated by S. mutans biofilm growth on dentin discs, and (4) to measure the ability of PACT in promoting cellular stress on S. mutans UA159 knockout vicK gene. PACT procedures were performed by association between a photosensitizer (Photogem®) and a visible red LED (Biotable®, 630 nm, 50 mW/cm2) as light source. Viability of bacterial cells was determined by two distinct methods: resazurin assay (phase 1) and Colony Forming Unit (CFU) counts (phases 1, 2, and 3). Transversal microradiography and calcium release analysis by atomic absorption spectrometry were chosen to analyze mineral content profile (%vol), integrated mineral loss (IML, %vol x m), lesion depth (LD, m), and concentration of calcium release in culture media (mg/dL). Fluorescence intensity levels, which were modulated by expression of Green Fluorescent Protein-reporter (GFP) after cellular stress, were measured by flow cytometer. A dose-dependent effect on the reduction of viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans was observed after application of different parameters of PACT (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED decreased in nearly 3.9 log10 the viability of S. mutans biofilm. Progression of demineralization process was correlated with the time (24 h IML: 1905±391 vol% x m, LD: 69.9±12,2 m; 48 h - IML: 3529±886 vol% x m, LD: 114.2±24.6 m; 72 h - IML: 4186±1099 vol% x m, LD: 146.1±20.1 m). Integrated mineral loss, lesion depth and concentration of calcium release were controlled for 24 h by the following associations: 0.25 mg/mL Photogem® plus 75 J/cm2 LED, and 0.25 mg/mL Photogem® plus 150 J/cm2 LED, in comparison to control group (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). Different treatments (0.0025% H2O2, 0.005% H2O2, 0.00625% Photogem®, 0.0125% Photogem®, 4.5 J/cm2 LED, 0.00625% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED, and 0.0125% Photogem® plus 4.5 J/cm2 LED) increased significantly the fluorescence levels emitted by S. mutans, when compared with levels of the control group (demi water) (one-way ANOVA, Games-Howell, p<0.05). However, significant statistical differences were not observed among treatment groups. Therefore, PACT was able to decrease the viability of planktonic cells and biofilm of S. mutans UA159, as well as controlling the demineralization process mediated by bacteria for 24 h. Moreover, according to present methods, PACT may modulate cellular stress similar to hydrogen peroxide.

Les contaminations des surfaces constituent un problème majeur de santé public rencontré dans plusieurs secteurs tels que les milieux hospitaliers et l’industrie alimentaire. Cette contamination consiste en l’adhésion de bactéries pathogènes ou opportunistes qui peuvent former des biofilms. Ces biofilms sont potentiellement des sources de développement et de prolifération des bactéries. Une voie efficace de lutte contre la contamination microbienne est l’élaboration de surfaces bactéricides visant à empêcher ou diminuer l’adhésion bactérienne. Basé sur le savoir-faire du laboratoire de Chimie des Substances Naturelles dans le domaine des polysaccharides, nous avons entrepris d’élaborer des supports antibactériens en fixant de manière covalente des molécules aux propriétés antibactériennes sur des fibres lignocellulosiques de pâte à papier (la pâte Kraft). Le lien triazole formé est stable vis-à-vis de l’hydrolyse acide ou basique, et subsiste dans des conditions oxydantes et réductrices. Nous avons choisi de nous intéresser dans un premier temps à la fixation de manière covalente d’un antibactérien commercial connu, le triclosan, sur des fibres lignocellulosiques de la pâte à papier ; puis dans une deuxième approche nous nous sommes orientés vers la fixation de porphyrines sur ces supports. Enfin dans une troisième approche, nous avons fixés des molécules aromatiques qui n’acquièrent leur potentiel antimicrobien qu’après greffage sur le support via le lien triazole. L’étude de l’effet antimicrobien des différents matériaux a montré pour une activité bactéricide du matériau Pâte Kraft-triclosan vis-à-vis notamment de trois souches fréquemment trouvées en milieu hospitalier: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus et Escherichia coli ; Dans le cas du greffage de photosensibilisateurs, seul le matériau pâte Kraft-Porphyrine neutre a permis une photoinactivation des souches après irradiation. / Surface contamination by pathogens constitutes a major public health problem encountered in many areas such as hospitals, environment and food industry. This contamination consists in the adhesion of pathogenic or opportunistic bacteria that can attach to a biotic or abiotic surface and lead to the formation of biofilm. An effective way to fight against microbial contamination is the development of antibacterial surfaces, in order to prevent or reduce bacterial adhesion. Based on the expertise of the Laboratoire de Chimie des Substances Naturelles in the field of polysaccharides, we have undertaken the development of antibacterial materials by grafting through covalent bonds molecules presenting antibacterial properties onto lignocellulosic fibers (in this case Kraft pulp fibers). Triazoles are resistant to acid and basic hydrolysis, reductive and oxidative conditions. This moiety is also relatively resistant to metabolic degradation and is not posing particular toxicity problems. The study of the antibacterial effect has shown a bactericidal activity of the triclosan-Kraft pulp sheet against three strains frequently found in hospitals: Pseudomonas aeruginosa, Bacillus cereus and Escherichia coli. In the case of grafting photosensitizers, only the neutral porphyrin-Kraft pulp sheet material displayed a strong photobactericidal activity after irradiation.

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

L’émergence de nouvelles souches bactériennes résistantes a signé la fin de l’« âge d’or » des antibiotiques. L’organisation mondiale de la santé a reconnu l’imminence des problèmes associés à ces nouvelles bactéries, qui engendrent de nouveau une mortalité en augmentation. Afin de palier à ce problème, de nouvelles alternatives aux antibiotiques sont envisagées par les chercheurs à travers le monde. La thérapie photodynamique antimicrobienne est l’une de ces alternatives. Elle a su se démarquer grâce à son incapacité à induire la résistance bactérienne. Alors que les résultats furent initialement très prometteurs contre les bactéries Gram positif, une moins bonne sensibilité fut rapidement observée de la part des bactéries Gram négatif. Afin d’augmenter le potentiel antibactérien de cette technique, diverses stratégies furent élaborées comme l’utilisation de photosensibilisateurs cationiques, l’ajout d’un agent de ciblage, ou la présence d’un agent de perméabilisation membranaire. L’un de ces agents est la polymyxine B, un peptide antimicrobien qui arbore une très bonne affinité avec les bactéries Gram négatif. Dans cette étude, nous avons voulu associer chimiquement différents photosensibilisateurs avec des dérivés de polymyxines B de façon covalente, par l’intermédiaire d’un bras « spacer » ou d’une plateforme. L’association de ces deux familles de molécules a permis d’élaborer de nouveaux composés qui ont démontré une activité photobactéricide accrue contre un large spectre de bactérie. De plus, ces composés ont montré une affinité augmentée pour les bactéries, ce qui permettra de réduire les effets secondaires sur les cellules humaines. Cette étude confirme l’importance d’utiliser des peptides antimicrobiens afin d’améliorer la thérapie photodynamique. Ces travaux seront approfondis afin de permettre la création de nouveaux traitements dermatologiques basées sur cette nouvelle thérapie et efficaces contre un large spectre de souche bactérienne / Despite advances achieved over the last decade, infections caused by multi-drug resistant bacterial strains are increasingly important societal issues that need to be addressed. New approaches have already been developed in order to overcome this problem. Photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT) could provide an alternative to fight infectious bacteria. Interesting results have been obtained against Gram-positive bacteria, but it also appeared that Gram-negative strains were less sensitive to PACT. Enhanced efficacy against Gram-negative bacteria had been previously obtained following three differents strategies, which are respectively the use of cationic photosensitizers, photosensitizers bound to antimicrobial peptides, or a membrane disrupting agent. Polymyxin B is an antimicrobial peptide, known as the “last-line” treatment against Gram-negative resistant strains, which has already been used as a disrupting agent in order to improve PACT. In addition of this enhancement, this peptide is known for its strong interaction for Gram-negative bacteria. Thus, in this work, we designed differents coumpounds, consisting of a photosensitizer covalently attached to derivatives of polymyxin B, through a spacer or a chemical platform. These combinations have led to the creation of novel compounds which have shown highly photobactericidal activities against a wide spectrum of bacteria. Moreover, these compounds present enhanced affinity for bacteria, which should significantly reduce side effects on mammalian cells. This study confirmed the importance of using antimicrobial in order to target bacterial strains. Thus, such results may allow the creation of novels PACT-based dermatological treatments efficient against a wide spectrum of bacterial strains.

O gênero Neoscytalidium está crescentemente sendo associado às infecções superficiais e profundas causadas em pacientes imunocomprometidos e imunocompetentes. O fungo filamentoso Neoscytalidium dimidiatum é um microrganismo saprofítico e fitopatogênico, encontrado no solo e vegetação de regiões de clima tropical e subtropical. N. dimidiatum var. hyalinum e N. dimidiatum estão envolvidos em infecções superficiais de pele e unha sendo que a espécie produtora de melanina, N. dimidiatum, está associado preferencialmente a infecções profundas sugerindo que a espécie variante não produtora de melanina, N. dimidiatum var. hyalinum, pode ser menos virulenta que a pigmentada. Pouco é descrito na literatura sobre as variedades em questão tanto em relação à sensibilidade a drogas antifúngicas e ao tratamento fotodinâmico antimicrobiano (TFDA), bem como a características fisiológicas referentes à tolerância a variações de temperatura e pH. Assim, o presente trabalho teve como objetivo o estudo de isolados clínicos de N. dimidiatum e N. dimidiatum var. hyalinum obtidos de infecções de pele e unha. Neste estudo foram realizadas a identificação molecular, a filogenia multilocus, a verificação in vitro do desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs e a caracterização in vitro do perfil de susceptibilidade a antifúngicos e TFDA com fotossensibilizadores (FSs) fenotiazínicos, bem como os efeitos do TFDA nas biomoléculas dos artroconídios das variedades estudadas. A filogenia multilocus foi realizada pelo sequenciamento de sete diferentes loci onde foi evidenciado polimorfismo na região Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 e nos genes ?-Tubulina (TUB), Fator de Alongamento de cadeia 1? (EF1) e Histona H3 (HH3). O agrupamento dos isolados clínicos deste estudo em genótipos distintos permitiu a separação em 6 tipos de sequência (TSs), sendo que o TS5 foi composto apenas pela espécie variante N. dimidiatum var. hyalinum. A análise de desenvolvimento em diferentes temperaturas e pHs demonstrou um tamanho de colônia reduzido para todos os isolados de N. dimidiatum var. hyalinum. Anfotericina B, voriconazol e terbinafina foram os antifúngicos mais eficientes para ambas variedades. Os valores das concentrações inibitórias mínimas (CIMs) encontrados para os derivados azólicos foram baixos para todos os isolados clínicos de N. dimidiatum var. hyalinum. Os isolados clínicos de N. dimidiatum mostraram ser menos sensível ao TFDA com os FSs azul de metileno (MB), novo azul de metileno N (NMBN), azul de toluidina O (TBO) e novo derivado sintético (S137) quando comparado à variedade hialina. NMBN e S137 mostraram maior eficiência para inativação de Neoscytalidium spp. Adicionalmente, no TFDA todos os FSs apresentaram efeito de permeabilidade de membrana plasmática, embora somente NMBN e S137 apresentaram a produção de Malondialdeido (MDA), isto é, causaram a peroxidação lipídica nos artroconídios de N. dimidiatum e da variedade hialina / Neoscytalidium sp. is increasingly being associated with superficial and deep infections in immunocompromised and immunocompetent patients. The filamentous fungus Neoscytalidium dimidiatum is a saprophytic and plant pathogenic microorganism that is found in soil and vegetation of tropical and subtropical regions. N. dimidiatum var. hyalinum and N. dimidiatum are involved in superficial skin and nail infections. The melanin producer N. dimidiatum is preferably associated with deep infections suggesting that the clinical isolate without melanin, N. dimidiatum var. hyalinum, may be less virulent than the pigmented variety. Little is described in the literature regarding the varieties N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum about the sensitivity to antifungal drugs and photodynamic antimicrobial chemotherapy (PACT), and the physiological characteristics related to the growth at different temperature and pH. Therefore, the present study aimed to investigate clinical isolates of N. dimidiatum and N. dimidiatum var. hyalinum obtained from skin and nail infections. Here in this study were performed the molecular identification, multilocus phylogeny, the in vitro characterization of development at different temperatures and pHs, and the characterization of in vitro susceptibility to antifungal agents and PACT with phenotiazinium photosensitizers (PSs), as well the PACT effects on the biomolecules of the Neoscytalidium spp. arthroconidia. The multilocus phylogeny was performed by sequencing seven different loci where polymorphism were identified in the Internal Transcribed Spacer (ITS) 1 region of rDNA and in the genes ?-tubulin (TUB), elongation factor 1? (EF1) and Histone H3 (HH3). The grouping of the clinical isolates from this study in different genotypes allowed the clustering in 6 sequence types (ST), in which the ST5 was composed exclusively by all N dimidiatum var. hyalinum isolates from this study. The analysis of development at different temperatures and pHs showed a reduced colony size for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. Amphotericin B, voriconazole and terbinafine were the most effective antifungal for both varieties. The minimal inhibitory concentrations (MICs) values found for the azoles derivatives were low for all N. dimidiatum var. hyalinum isolates. N. dimidiatum clinical isolates have shown to be less sensitive to PACT with the PS methylene blue (MB), new methylene blue (NMBN), toluidine blue O (TBO) and new synthetic derivative (S137) when compared to hyaline variety. NMBN and S137 have shown more effectiveness for the inactivation of Neoscytalidium spp. Additionally, all PS in PACT have caused plasma membrane permeability, although only NMBN and S137 showed the production of malondialdehyde (MDA), i.e., caused lipid peroxidation in both N. dimidiatum and hyaline variety

Made available in DSpace on 2017-07-24T19:37:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ariana Rodrigues.pdf: 4102019 bytes, checksum: 823cb458ebe2eea53b3ba0d11aed9880 (MD5) Previous issue date: 2012-03-06 / Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico do Paraná / The increasing pathogenic bacteria resistance to antibiotics has led to the development of new alternatives to replace them. The Photodynamic Antimicrobial Chemotherapy (PACT) is one of the alternatives recently researched. Several associations between photosensitizer (PS) and light sources are used to inactivate different micro-organisms. The porphyrin derivatives have interesting features and are amongst the most investigated compounds in PACT, showing promising results. The light-emitting diode (LED) source presents advantages, since this device has been shown efficient against bacteria and is economically feasible. The present study investigated the photodynamic activity of different porphyrin derivatives/LED systems for application in PACT. The following porphyrin derivatives were used: 5,10,15,20-tetrakis(2,6-difluor-5-sulfonatophenyl) sodium porphyrinate, Na4[H2(TDFSPP)], 5,10,15,20-tetrakis(2,6-difluor-5-sulfonatophenyl) zinc (II) sodium porphyrinate, Na4[Zn(TDFSPP)]) and 5,10,15,20-tetrakis(4-sulfonatophenyl) manganese (III) sodium porphyrinate, Na4[Mn(TSPP)]. LED systems were used in different emission bands: orange, red, green and blue. The photodynamic activity of PS/LED systems were analyzed through the photobleaching test, photoxidation of bovine serum albumin (BSA) protein, uric acid and microbiological assay with ATCC and hospital Staphylococcus aureus strains. The results showed no significant photobleaching of porphyrin derivatives using LED as a light source. The PS/LED systems led to oxidation of the BSA protein and uric acid, except for the derivative Na4[Mn(TSPP)]. The photoxidation constant rate for Na4[H2(TDFSPP)]/green and blue LED, Na4[Zn(TDFSPP)]/green and blue LED systems, were close to the constant rate for drugs with application in photodynamic therapy (PDT). The uric acid test result indicated that compounds are capable of generating singlet oxygen. The Na4[H2(TDFSPP)]/blue LED system had a higher photodynamic activity against ATCC and hospital S. aureus strains. The results demonstrated that the systems under study present potential to be used in PDT and PACT. / A crescente resistência de bactérias patogênicas a antibióticos levou ao desenvolvimento de novas alternativas que possam substituí-los. Uma das alternativas investigadas atualmente é a quimioterapia fotodinâmica antimicrobiana (PACT). Várias associações entre fotossensibilizadores (FS) e fontes de luz são utilizadas para inativar diferentes micro-organismos, comprovando a eficiência dessa terapia. Os derivados porfirínicos apresentam características interessantes para aplicação em PACT e estão entre os compostos mais investigados, apresentando resultados promissores. O uso de LED como fonte de luz apresenta vantagens, uma vez que esse dispositivo tem mostrado bons resultados na eliminação de bactérias e é economicamente mais viável. Assim, no presente estudo, investigou-se a atividade fotodinâmica de diferentes sistemas derivados porfirínicos/LEDs para possível aplicação em PACT. Para isso, utilizou-se os seguintes derivados porfirínicos: 5,10,15,20-tetrakis (2,6-difluoro-5-sulfonatofenil) porfirinato de sódio, Na4[H2(TDFSPP)], 5,10,15,20-tetrakis (2,6-difluoro-5-sulfonatofenil) zinco (II) porfirinato de sódio, Na4[Zn(TDFSPP)], e 5,10,15,20-tetrakis (4-sulfonatofenil) manganês (III) porfirinato de sódio, Na4[Mn(TSPP)]. A irradiação dos compostos foi feita utilizando-se sistemas de LED com diferentes faixas de emissão: alaranjado, vermelho, verde e azul. A atividade fotodinâmica dos sistemas FS/LED foi avaliada por meio dos testes de fotobranqueamento, foto-oxidação da proteína BSA, ácido úrico e de ensaio microbiológico, utilizando-se a bactéria Staphylococcus aureus de origem ATCC e hospitalar. Os resultados mostraram que os derivados porfirínicos não sofreram fotobranqueamento quando associados aos diferentes LEDs. Os sistemas FS/LED levaram à oxidação da proteína BSA e à degradação da molécula de ácido úrico, exceto para o derivado Na4[Mn(TSPP)]. As constantes de foto-oxidação obtidas para os sistemas Na4[H2(TDFSPP)]/LED verde e azul; Na4[Zn(TDFSPP)]/LED verde e azul, ficaram próximas aos valores obtidos para fármacos com aplicação em Terapia Fotodinâmica (TFD). Os resultados do teste do ácido úrico para esses mesmos sistemas indicaram que eles são capazes de gerar oxigênio singlete. O sistema Na4[H2(TDFSPP)]/LED azul apresentou maior atividade fotodinâmica sobre as cepas de S. aureus ATCC e hospitalar. Assim, os resultados demonstram que os sistemas investigados apresentam potencial para aplicação em TFD e PACT.